Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54349

⸱

24 augustus 2016

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

Samenvatting

In de alomtegenwoordige proces van membraanfusie de opening van een fusie porie stelt de eerste verbinding tussen twee voorheen afzonderlijke compartimenten. Tijdens neurotransmitter of afgifte van hormonen via exocytose, de fusie porie kan kortstondig openen en sluiten herhaaldelijk, het reguleren van de lading vrijgavekinetiek. Pore ​​dynamiek ook de wijze van blaasje recycling vast te stellen; onomkeerbare nieuwe sluiting leidt tot voorbijgaande, "kiss-and-run" fusion, terwijl verwijding leidt tot een volledige fusie. Om beter te begrijpen welke factoren regeren porie dynamiek, ontwikkelden we een test om membraanfusie te controleren met behulp van gepolariseerd totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie in een biochemisch goed gedefinieerde in vitro systeem. Fusie van fluorescent gelabelde kleine unilamellaire blaasjes met v-SNARE eiwitten (v-SUV's) met een vlakke bilaag lager t-SNAREs, ondersteund op een zachte polymeer kussen (t-SBL, t-ondersteunde bilaag) Wordt bewaakt. De test maakt gebruik van microfluïdische stromingskanalen die zorgen voor een minimale steekproef consumptie, terwijl het leveren van een constante dichtheid van SUV's. Het benutten van de snelle verbetering van het signaal bij overdracht van lipide etiketten van de SUV naar de SBL tijdens de fusie, wordt kinetiek van lipiden kleurstofoverdracht gecontroleerd. De gevoeligheid van TIRF microscopie laat volgen enkele fluorescerende lipide labels, waaruit lipide diffusiviteit en SUV grootte kan worden afgeleid voor elke samensmelting. vrijmaking van kleurstof tijden lipide kan veel langer dan verwacht voor ongehinderde doorgang door permanent open poriën. Met een model dat veronderstelt vertraging van lipide afgifte wordt veroorzaakt door het trillen porie een porie "openheid", de fractie van tijd de poriën ook voor fusie blijft, kunnen worden geschat. Een oplosbaar marker kan worden ingekapseld in de SUV's voor de gelijktijdige monitoring van lipiden en oplosbare lading release. Dergelijke metingen geven een aantal poriën hersluiten na het verliezen van een gedeelte van het oplosbare lading.

Inleiding

Membraan fusie is een universeel biologisch proces nodig is voor intracellulaire handel in vetten en eiwitten, secretie, de bevruchting, de ontwikkeling en omhuld virus binnenkomst in gastheerorganismen 1-3. Voor de meeste intracellulaire fusiereacties waaronder afgifte van hormonen en neurotransmitters via exocytose wordt de energie twee lipide bilagen smelten door vorming van een vier-helix bundel tussen cognate oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) eiwitten, verankerd in het blaasje (v-SNARE) en het doelmembraan (t-SNARE) 4 resp. Synaptische vesikel exocytose is de meest strak gereguleerd fusiereactie en voordat één milliseconde na aankomst van een actiepotentiaal 1,4,5. De fusie porie, de initiële verbinding tussen de twee compartimenten fuseren, kunnen flikkeren open en meerdere malen gesloten voordat het opnieuw afsluiten of het uitbreiden van onomkeerbaar 5-7. De voormalige resultatenin voorbijgaande, "kiss & run" fusion, terwijl de laatste leidt tot volledige fusie. Factoren die het evenwicht tussen deze twee modi van fusie en mechanismen reguleren poriën flikkeren zijn niet goed begrepen 5,8.

SNARE eiwitten zijn nodig voor exocytose; synaptische blaasje fusie wordt na splitsing van SNAREs afgeschaft door neurotoxins 9. Bulk fusie-experimenten met kleine unilamellaire vesikels (SUV's) aangetoond dat SNAREs niet alleen vereist, maar ook voldoende membraanfusie 10 rijden. In deze massa assay SUV gereconstitueerd met v-SNAREs (v-SUV) werden gedoteerd met fluorescente fosfolipiden (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) en ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) en gemengd met ongelabeld blaasjes met t-SNAREs (t-SUV) Aanvankelijk was de fluorescentie van NBD-PE in v-SUV is geblust door Förster resonance energy transfer (FRET ) naar LR-PE. Zoals labeLED v-SUV fuseren met ongelabelde t-SUV, is de fluorofoor oppervlaktedichtheid in het nu gecombineerde membraan verminderd en de resulterende toename van NBD-PE fluorescentie meldt de mate van lipide mengen 10. Aangezien het grootste deel test is eenvoudig in te stellen en te analyseren, is het op grote schaal gebruikt om de mechanismen van SNARE gemedieerde fusie 10-14 bestuderen. Het heeft echter verscheidene beperkingen, zoals lage gevoeligheid en slechte tijdsresolutie. Belangrijker, als ensemble metingen is gemiddelde resultaten voor alle gebeurtenissen maken onderscheid tussen docking en fusion, alsmede opsporing van hemifusion tussenproducten moeilijk.

De afgelopen tien jaar verschillende groepen, waaronder de onze, zijn er nieuwe tests ontwikkeld om fusie gebeurtenissen bij de enkele blaasje level 15-27 volgen. Ha en collega's gebruikt v-SUV vastgebonden op een oppervlak en bewaakt hun fusie met gratis t-SUV 18,19. Lipide mengen werd gevolgd met behulp van FRET tussen twee lipide gebonden fluoroforen embedden in de v- en t-SUV's, respectievelijk, met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie 18. Later, Brunger het laboratorium gebruikt een enkele lipide-label soorten samen met een inhoud marker voor gelijktijdige detectie van lipiden en inhoud te mengen 20,28. Zowel de lipide en de inhoud merkers werden opgenomen in hoge zelfdovende concentraties; fusie met ongelabelde SUV resulteerde in fluorescentie dequenching 20,28.

Anderen hebben v-SUV gefuseerd met vlakke dubbellagen opgelost in t-SNAREs 15-17,21-27,29. De vlakke geometrie van het doel (t-SNARE bevattende) dubbellaag beter bootst de fysiologische fusieproces van kleine, zeer gebogen blaasjes met een platte plasmamembraan. De Steinem groep toegepast poriën spanning membranen opgelost in t-SNAREs, opgehangen boven een poreus siliciumnitride substraat en gedetecteerd fusion individuele v-SUV met behulp van confocale laser scanning microscopie 23. anderen fgebruikte v-SUV's naar vlakke dubbellagen opgelost in t-SNAREs, ondersteund op een glazen substraat 15-17,21,22,24-27,29. Het grote voordeel van het gebruik van ondersteunde bilagen (SBLs) dat TIRF microscopie kan worden gebruikt voor docking en fusiegebeurtenissen met uitstekende signaal-ruisverhouding en zonder interferentie van vrije v-SUV detecteren, hoewel behulp microfluïdische ook resolutie eenmalige gebeurtenis gebruikt standaard ver-field epifluorescentie microscopie 24.

Een belangrijk punt van zorg is de vraag of en hoe substraat-bilaag interacties invloed op ondersteunde bilaag kwaliteit en het fusieproces. Vroeg werk gebruik gemaakt van vlakke SBLs die direct werden ondersteund op een glazen of kwarts substraat 15-17. Deze SBLs werden door adsorptie, barsten, verspreiding en fusie van t-SUV membranen op het substraat. Het werd al snel besefte echter dat het weglaten van een belangrijke t-SNARE component, SNAP25, van SBLs op deze manier bereid resulteerde in v-SUV docking en fusion kinetiek indistinguishable van die verkregen met een totale t-SNAREs 17. Omdat SNAP25 absoluut voor fusie is nodig in vivo 30,31, werd de fysiologische relevantie van deze vroege pogingen in twijfel te trekken. Tamm de groep overwon deze uitdaging door het gebruik van beter gecontroleerd ondersteunde bilaag vorming 21. Vroeger Langmuir-Blodgett depositie voor het eiwit-vrij eerste folder van de SBL, gevolgd door de fusie van die monolaag met t-SUV's 21. Dit resulteerde in SNAP25-afhankelijke fusie.

Om potentiële artefacten geassocieerd met een dubbellaag direct afgezet op een glassubstraat zonder nader Langmuir-Blodgett methoden voorkomen Karatekin et al. Werd een zachte, gehydrateerde poly (ethyleenglycol) (PEG) kussen tussen de bilaag en het substraat 24. Deze modificatie resulteerde ook in SNAP25-afhankelijke fusie 24. Dubbellagen kussens op een zachte polymeerlaag was gekend om transmembraan beter behoudenmobiliteit en de functie 32-eiwit, en was gebruikt in fusion studies met virussen 33. Bovendien gePEGyleerd dubbellagen lijken wat vermogen om zichzelf te genezen behouden en zijn zeer robuust 34,35. Eerst wordt een fractie van commercieel verkrijgbare, lipide-gebonden PEG-ketens zijn opgenomen in de t-SUV membraan. Wanneer deze t-SUV burst en vormen een vlakke dubbellaag op een glazen substraat, een PEG borstel omvat zowel bladen van de vlakke bilaag. Omdat vorming vlakke dubbellaag wordt aangedreven door adhesie van het PEG-ketens rond t-SUV op het hydrofiele glasoppervlak, liposoom barsten en vlakke bilaag vorming betrekkelijk ongevoelig voor de lipidesamenstelling gebruikt. Wanneer echter grote hoeveelheden cholesterol zijn opgenomen, waardoor de cohesieve eigenschappen van de SUV, de SUV kan niet spontaan barsten. Als dit het geval is, kan osmotische shock of tweewaardige ionen worden toegepast om vlakke bilaag vorming 25 helpen.

Zoals hierboven vermeld, in dit apdering een PEG borstel omvat beide zijden van de vlakke, ondersteund dubbellaag. De borstel tegenover de microfluïdische stromingskanaal helpt om niet-specifieke hechting van inkomende v-SUV die ook meestal bedekt met een PEG-laag voorkomen. Vorming van V- en t-SNARE complexen begint vanaf de membraan-distale N-uiteinden en verloopt in etappes in de richting van het membraan-proximale domeinen 36. Voor de v-SUV om met de t-SBL, V- en t-SNARE N-termini nodig boven het PEG borstels, die lijkt op het geval onder de omstandigheden van de assay uitsteken. Borstelhoogte kan worden aangepast aan andere eiwitten dan SNAREs bestuderen door het variëren van de dichtheid van gepegyleerde lipiden en PEG ketenlengte 37,38. Een ander voordeel van de PEG borstels die de proximale oppervlakken van het fuseren van bilagen is dat zij bootsen de drukke omgeving van biologische membranen die zijn verpakt met 30.000-40.000 integrale membraaneiwitten per vierkante micron 39. Net als de PEG-ketens in deze test, de Repulsive eiwit laag die biologische membranen moeten opzij worden geduwd om te zorgen voor contact tussen de twee fosfolipiden dubbellagen voor fusie te komen.

Microfluïdische stromingskanalen worden in deze test, omdat ze unieke voordelen bieden. Ten eerste microfluïdische stroom kunnen meer uniforme afzetting van t-SUV te verspreiden en de zekering t-SBL vormen. Ten tweede, de kleine kanaal volume (<1 pl) minimaliseert monster consumptie. Ten derde, de kleine volumina vereist waarvan de hele experiment constant debiet te worden uitgevoerd. Stroom verwijdert zwak, vermoedelijk aspecifiek, gehecht v-SUV van SBL 16. Het heeft ook een constante dichtheid van v-SUV boven de t-SBL, het vereenvoudigen van kinetische analyse 17. Tenslotte worden gedokt blaasjes gemakkelijk te onderscheiden van vrije degenen door de stroming 25 uitgevoerd. Ten vierde, meerdere microkanalen kunnen worden gebruikt op dezelfde dekglaasje, elk probing een andere toestand. Dit maakt vergelijking van de voorwaarden During dezelfde experimentele run. Een soortgelijke aanpak is gebruikt door de van Oijen groep fusie tussen influenzavirus en kussens SBLs 33 bestuderen.

Bij TIRF microscopie, de exponentiële verval van het verdwijnende veld (met vervalconstante ~ 100 nm) fluorescentie excitatie beperkt tot die moleculen die in de directe nabijheid van het glas-buffer interface. Dit minimaliseert bijdrage van fluorescente moleculen die verder weg zijn, verhoogt de signaal-ruisverhouding en maakt enkel molecuul gevoeligheid belichtingsraam tijden van 10-40 msec. Het verdwijnende veld leidt ook tot een toename van signaal-fusie: de overdracht gemerkte lipiden uit de SUV in de SBL, bevinden zij zich gemiddeld sterker bekrachtigingsveld. Deze toename in fluorescentie wordt sterker grotere liposomen.

Als gepolariseerd licht wordt gebruikt om het verdwijnende veld genereren extra effecten bijdragen tot een verandering in fluorescentie bij transfer van etiketten van de SUV in de SBL. Sommige lipide kleurstoffen overgang dipool georiënteerd met een voorkeurs gemiddelde hoek ten opzichte van de dubbellaag waarin zij zijn ingebed. Hierdoor ontstaat een verschil in de hoeveelheid fluorescentie die door de fluoroforen wanneer zij in de SUV versus de SBL, aangezien het gepolariseerde bundel kleurstoffen anders prikkelen de twee membranen. In het eerste geval zal de excitatie balk interactie met overgang dipolen georiënteerde rond de sferische SUV, terwijl voor het laatste, zal dipool oriëntaties worden beperkt door de vlakke SBL geometrie. Wanneer bijvoorbeeld s-gepolariseerd invallend licht (gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval) wordt gebruikt, excitatie efficiënter als de kleurstof in de SBL dan in SUV voor een lipide kleurstof transitiedipool evenwijdig aan het membraan 29,40 (zoals die van Dil of heb 41-43). Een SUV gedoteerd met zo'n fluorofoor verschijnt dimmen wanneer het dokken op de SBL (figuur 7, Representat ive resultaten). Als een fusie porie opent en verbindt de SUV en SBL membranen, fluorescerende probes diffunderen in de SBL en meer kans te worden enthousiast over de-s gepolariseerde verdwijnende veld 25,27,29. Bijgevolg het fluorescentiesignaal geïntegreerd rondom de fusieplaats sterk toeneemt tijdens de kleurstofoverdracht van de SUV in de SBL 27 (Figuur 3 en Figuur 7). Een bijkomende factor die bijdraagt ​​aan veranderingen die gepaard fusie wordt dequenching van fluorescente labels zoals ze worden verdund wanneer overgebracht in de SBL signaal. De bijdrage van dequenching gewoonlijk klein in vergelijking met verdwijnende veld verval en polarisatie-effecten in de hier beschreven test, omdat slechts een kleine fractie ( figure-introduction-1 ) Van de lipiden zijn gelabeld.

Het signaal stijging op fusie kan worden benut om fusie porie eigenschappen afleiden door de tijd te vergelijken,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, die nodig is voor een lipide te ontsnappen via een porie die vrij doorlaatbaar voor lipiden aan de werkelijke release tijd, figure-introduction-2 . Als de twee tijdschalen vergelijkbaar zou worden geconcludeerd dat de poriën weer weinig weerstand tegen lipide flow. Indien de werkelijke lostijd aanzienlijk langer is dan de tijd voor diffusie beperkte release, zou een proces aangeven, zoals poriën flikkeren, vertragen lipide release. De diffusie beperkte release tijd, figure-introduction-3 , Afhankelijk van de grootte van de fuser en liposoom lipide-diffusie; haar ramingen vereist deze twee parameters te worden gekwantificeerd. De single molecule gevoeligheid van de test maakt het mogelijk lipide diffusie te meten door het bijhouden van meerdere afzonderlijke lipide fluoroforen na hun vrijlating in het SBL voor elke fusie event 26. De grootte van elke versmelten vesiclekan worden geschat 27 door het combineren van (i) de intensiteit van een enkele lipide kleurstof, (ii) de verandering in de totale fluorescentie rond docking site na alle fluoroforen op fusie worden overgebracht in de SBL, (iii) de bekende etikettering dichtheid van SUV lipiden, en (iv) de oppervlakte per lipide. Voor veel fusiegebeurtenissen werden de werkelijke lipide afgifte samengesteld worden veel langzamer dan verwacht door diffusie gecontroleerde afgifte 27 zijn, zoals eerder werd opgemerkt uitgaande uniforme SUV maat 44. Uitgaande vertraging van lipide afgifte wordt veroorzaakt door het trillen poriën, een kwantitatief model maakt schatting van "porie openheid", de fractie van tijd de poriën blijft ook voor fusie-27.

Wanneer praktisch is belangrijk om fusie mechanismen waarbij zowel lipide en oplosbare inhoud labels testen. Bijvoorbeeld zou lipide afgifte vertraagd worden door andere dan de porie trillen werkwijzen, zoals restrictie lipide diffusie door de SNARE eiwitten die surround thij porie. Als dit het geval zou zijn, dan los van de inhoud zou release van lipide labels voorafgaan, op voorwaarde dat de porie is groot genoeg om doorgang van oplosbare probes mogelijk te maken. Een fundamentele fout in de benadering kan in de veronderstelling dat de overdracht van gemerkte lipiden SBL vindt plaats via een smalle fusie porie verbinden de SBL een vesicle die grotendeels zijn pre-fusie-vorm heeft behouden. Lipid overdracht in de SBL kan ook het gevolg zijn van de snelle uitzetting van de fusie porie met een gelijktijdige, extreem snelle ineenstorting van de SUV in de SBL membraan, zoals eerder gesuggereerd op basis van lipide vrijlating data alleen 29. Monitoring zowel lipide en inhoud kort tegelijk bleek dat veel poriën afgedicht na het loslaten alle lipide labels, maar bleven sommige van hun oplosbare lading 27. Dit geeft aan dat ten minste enkele liposomen niet samen in de SBL na fusie en dat het lipide kleurstofoverdracht in de SBL gebeurt door een fusie porie. Bovendien, lIPID en inhoud vrijlating vond plaats gelijktijdig 27, waardoor het onwaarschijnlijk is dat de vertraging van lipide vrijlating was te wijten aan hinder van lipide diffusie door de SNARE eiwitten rond de porie 45.

Een SUV-SBL fusie-protocol dat niet controleren oplosbaar inhoud vrijlating is eerder gepubliceerd door Karatekin en Rothman 25. Hier worden meer recente ontwikkelingen opgenomen, namelijk de gelijktijdige controle van lipiden en de inhoud vrij te geven en de schatting van SUV, lipide, en fusie porie eigenschappen 27. Het protocol begint met instructies voor het bereiden van de microfluïdische cellen, gemaakt door het binden van een poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) elastomeer blok met groeven met een glas dekglaasje 25. Vervolgens wordt de bereiding van v-SUV met zowel lipide en inhoud markers toegelicht. Afdelingen 4 en 5 geven instructies voor de montage van de microfluïdische cellen, de vorming van de SBLs in situ en het controleren op gebreken en vloeibaarheid, de invoering van vSUV's in de stroom cellen en detectie van fusiegebeurtenissen. Hoofdstuk 6 bevat instructies voor data-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van een PDMS blok naar de microfluïdische kanaal Formulier

figure-protocol-1
Figuur 1. Microfabricage van stroomcel template en PDMS block bereiding. (A) Ontwerp van een vierkanaals stroomcel die past op een 24 x 60 mm glazen dekglaasje (onder). Zes identieke ontwerpen zijn ingericht om te passen op een 10 cm silicium wafer (boven). (B) Knip blok van ongeveer 5-8 mm dik PDMS op een perforator. (C) Het inbrengen van de slang in het gaatje met behulp van een pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Verkrijgen van een stroomcel template zoals in figuur 1A. Typische kanalen zijn 0,3-1 mm breed, 70-100 micrometer hoog en 1-2 cm lang. Fabriceren van een sjabloon onsing standaard fotolithografie technieken in een cleanroom faciliteit 25 of bestelling als de toegang cleanroom is niet beschikbaar. Alternatief machine een matrijs met grotere afmetingen van een geschikt materiaal.
    Opmerking: Cleanroom personeel kan trainen en begeleiden onervaren gebruikers (toegang tot een cleanroom faciliteit is altijd beperkt tot gebruikers met de juiste opleiding) in het ontwerpen en bestellen van een masker, wafer schoonmaken, en fotolithografie. Zodra een sjabloon wordt verkregen, kan het buiten de cleanroom worden herhaaldelijk gebruikt, mits het in een gesloten schaal gehouden en zorg is genomen om stof uit te sluiten.
  2. Maak een mengsel van ~ 100 ml PDMS (siliconenelastomeer base) en ~ 10 ml verknopingsmiddel (verharder) in een wegwerp plastic beker. Breek het topje van een wegwerp pipet om de viskeuze PDMS verwerken gemakkelijker. Weeg de PDMS in de plastic beker als pipetteren is niet nauwkeurig.
  3. Roer het mengsel goed. Verwijder de vele luchtbellen door ontgassen in een vacuüm exsiccator (ongeveer 20min). Als de beker onder vacuüm wordt gebracht, zal de bubbels aanvankelijk groeien in omvang, verhoging van het mengsel sterk. Controle van de onderdruk die wordt toegepast en zorg ervoor dat de beker is diep genoeg om een ​​lekkage te voorkomen.
  4. Giet een grote daling van de ontgast PDMS mengsel in een glazen petrischaal (150 mm x 20 mm) en druk op de wafer op de PDMS met de sjabloon naar boven. Dit voorkomt luchtbellen gevangen onder de wafer. Opgesloten bellen zullen uitbreiden en kan de wafer kantelen wanneer de schotel wordt geplaatst in de oven. Giet ontgast PDMS op de mal bovenop de wafel totdat deze onder ongeveer 5-8 mm PMDS. Als voorzichtig een luchtbel optreedt verwijderen met een pipet tip.
  5. Bak de PMDS in een oven bij 60 ° C gedurende 3 uur. Zorg ervoor dat het gerecht is niveau.
  6. Gebruik een nieuw scalpel te snijden een PDMS blok met de gevormde kanaal structuren. De uitgesneden blok moet passen op een dekglaasje (zie stap 4.1.9).
  7. Schil de uitgesneden blok van het gerecht en plAce It op een stuk van schone aluminiumfolie.
    Opmerking: Het verknoopte PMDS blokken kan enkele maanden worden bewaard. Op een enkele wafer, zijn er 6 reeksen stromingskanalen (figuur 1A), zodat 6 PDMS blokken kunnen in één PDMS molding. Na het snijden alle 6 van de PDMS blokken, schone losse stukjes PDMS, maar andere wijze de resterende PDMS niet verwijderen voor het storten en verknopen de volgende groep, die slechts ongeveer de helft van de PDMS voor de eerste partij vereist. Een goede template kan een paar jaar duren.
  8. Gebruik een perforator te boren door de PDMS blok in één rechte beweging (Figuur 1B). Begin aan de kant van het kanaal groeven. Zorg ervoor dat u de gestanst stuk PDMS te verwijderen. Herhaal dit voor alle acht gaten van de vier kanalen design.
  9. Plaats de PDMS blok kanaal naar beneden op een nieuwe en kreukvrij stuk aluminiumfolie. Bewaar het blok tot enkele maanden in een droogkast, idealiter in een exsiccator.
  10. Duw de buis (0,25 mm ID, 0,76 mm OD) ongeveer een derde in het gaatje met een pincet (Figuur 1C). Snijd de buis schuin gemakkelijker inbrengen. Reactie buizen lang genoeg om de SUV reservoir en de spuitpomp bereikt, respectievelijk. Na het plaatsen van de gemonteerde chip op de microscoop, snijd de buizen opnieuw als ze te lang zijn.
  11. Om verbinding te maken met het spuiten van de pomp, snijd een stukje van de grotere silicone buis (0,51 mm ID, 2,1 mm OD) en steek de dunnere buis in één kant. Deze kant-en-klare blok PDMS kan worden gehouden gedurende enkele maanden.

2. Coverslip Cleaning

  1. Schone dekglaasjes volgens de in Karatekin en Rothman 25 beschreven protocol met een sterk oxiderende mengsel van zwavelzuur (H 2 SO 4) en waterstofperoxide (H 2 O 2). Voer deze procedure in een cleanroom, en de juiste veiligheidsmaatregelen te nemen. U kunt ook gebruik maken van een cleanroom gereinigd coverslip dat in de handel verkrijgbaar (zie Materials List).

3. Voorbereiding van v-SUVS die zowel Lipid en Content Labels

figure-protocol-2
Figuur 2. Schematische voorstelling van SUV preparaat. Lipiden worden gemengd in een glazen buis (1) en het oplosmiddel wordt verdampt om een lipide film te vormen door draaiing van de buis in een waterbad (2). Resterende sporen oplosmiddel verwijderd onder hoog vacuüm (3). De lipidefilm gehydrateerd in reconstitutie buffer die detergens en eiwit terwijl gewerveld (4). Als inhoud kleurstof te kapselen wordt in deze stap en in de verdunningsstap (5). Verdunning van de concentratie detergens beneden de kritische micel concentratie leidt tot liposoomvorming. Wasmiddel wordt gedurende de nacht gedialyseerd weg (6). Voor t-SUV voor SBL vorming inbegrip NBD-PE (groen), zijn vesicles dreef in een dichtheidsgradiënt en verzameld ophet grensvlak tussen twee lagen (7a). Om v-SUV's te scheiden met ingekapselde inhoud marker van vrije kleurstof het monster wordt overreden een grootte-uitsluiting-kolom en verzameld in 0,5 ml fracties (7b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereid 4 L reconstitutie buffer, die 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCI, 100 uM EGTA en 1 mM DTT, pH 7,4. Met meeste buffer dialyse en 100 ml voor andere stappen.
    Opmerking: Andere buffers kunnen worden gebruikt, maar het is belangrijk om de buffer osmolariteit consistent in het experiment te houden en kies omstandigheden waarin de eiwitten functioneel. Voor het bereiden van v-SUV's met alleen lipide labels en t-SUV's, volg Karatekin en Rothman 25.
  2. Lipide voorraden bij -20 ° C in chloroform en chloroform worden opgeslagen: methanol (2: 1, v / v), laat injectieflacons bereikt kamertemperatuur voorafgaand aanvoorkomen condensatie.
  3. Gespoeld glazen buis met chloroform om sporen van reinigingsmiddel te verwijderen en meng de lipiden in de gewenste verhouding met een uiteindelijke hoeveelheid van 1 pmol in een mengsel van chloroform en methanol (2: 1, v / v). Gebruik alleen glazen spuiten / buisjes aan organische oplosmiddelen / opgeloste lipiden te verwerken.
    Opmerking: De lipiden die hier gebruikt zijn POPC: SAPE: DOPS: Cholesterol: PEG2000-DOPE: deed op een molaire verhouding van 57,4: 15: 12: 10: 4,6: 1 voor v-SNARE bevattende vesicles en POPC: SAPE: DOPS: Cholesterol : hersenen PI (4,5) P2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54,9: 15: 12: 10: 3: 4,6: 0,5) voor t-SNARE SUV. Zie Materiaal voor meer informatie. Andere lipide samenstellingen kunnen worden gebruikt.
  4. Damp het oplosmiddel onder een zachte stroom van stikstof of in een rotatieverdamper. Dompel het uiteinde van de buis in een waterbad (37 ° C) boven de hoogste smelttemperatuur van de lipiden verwarmd tot een homogene lipidefilm opbrengst en grote temperatuurverschillen vermijden tijdens het verdampen van het oplosmiddel. Begin vacuüm bij ongeveer300 mbar totdat de lipide film wordt gevormd, vervolgens doorgaan ~ 2 minuten bij hoogste vacuüm in de roterende verdamper.
  5. Verwijder de glazen buis en wikkel het in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te vermijden en verwijderen van resterende sporen oplosmiddel door het plaatsen van de buis in een exsiccator onder hoog vacuum gedurende ten minste 2 uur. Deze stap kan ook worden uitgevoerd 's nachts.
  6. De gedroogde lipidefilm rehydrateren, bereid een mengsel van detergens (n-octyl-β-D-glucopyranoside, OG), eiwit (v-SNAREs) en SRB in reconstitutie buffer (500 ui eindvolume). Houd de uiteindelijke detergensconcentratie ~ 2 maal de kritische micel concentratie (CMC, 20-25 mM voor OG) en stel het eindvolume zodat het detergens lipide verhouding> 10. Ontbinden Sulforhodamine B (SRB) poeder in het eiwit-detergens oplossing tot een eindconcentratie van 10-50 mM SRB verkrijgen door voorzichtig schudden van de oplossing. Stel de osmolariteit van de reconstitutie buffer bij het toevoegen van hoge concentraties SRB doordat de concentration van kaliumchloride dienovereenkomstig.
    Opmerking: Lipid-to-eiwitverhouding (LP) voor t-SNAREs is hoog (LP ~ 20.000, ~ 70 t-SNAREs per vierkante micron. 25). Significant hoger t-SNARE dichtheden in de SBL kan leiden tot inactieve eiwit aggregaten met een significante vermindering van het fusie-tarieven 17,24. LP voor v-SNAREs veel lager (LP ~ 200, 7000 ~ v-SNAREs per um 2), nabij het ​​v-SNARE dichtheden gevonden synaptische blaasjes 46,47. Om de eiwitfunctie na recombinante expressie en zuivering van v- en t-SNAREs waarborgen is het nuttig om een eenvoudige bulk fusie-assay 48 voeren alvorens alle stappen van de interne vesikel fusie assay.
  7. Schud de voorverwarmde glazen buis met de gedroogde lipide film tijdens het toevoegen van het eiwit-detergens-SRB-oplossing van stap 3,6. Probeer te voorkomen dat het creëren van bubbels. Blijf schudden gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
  8. Verdun het schoonmaakmiddel vervijfvoudigde door het toevoegen van reconstructiebuffer die SRB (voeg 2 ml, 2,5 ml uiteindelijk volume), terwijl snel vortexen concentratie gradiënten te vermijden. Blijf schudden gedurende 15 minuten tot 1 uur bij 37 ° C.
    Let op: Langere incubatie toename eiwit reconstitutie efficiëntie. De snelle verdunning vermindert de concentratie detergens onder de CMC en leidt tot de vorming van kleine liposomen.
  9. Dialyseer de vesicle suspensie eerst tegen ~ 1 L reconstitutie buffer gedurende 1-2 uur bij omgevingstemperatuur geroerd en vervolgens met 3 L reconstitutie buffer overnacht bij 4 ° C met 4 g polystyreen adsorptiemiddel, met een 20.000 MWCO dialysebuis of cassette. Gebruik verschillende bekers voor dialyse van vesicles met en zonder SRB om kruisbesmetting te voorkomen.
  10. Equilibreer een gelfiltratiekolom met reconstitutie buffer. Voer het vesicle suspensie door de kolom vrij SRB scheiden van de v-SUV met ingekapselde SRB. Gebruik reconstitutie buffer zonder SRB als elutiemiddel zodra het gehele monsterging de kolom. Verzamelen v-SUV in 0,5 ml fracties.
  11. Controleer succesvolle SRB inkapseling op zichzelf gedoofd concentraties door het meten van SRB fluorescentie vóór en na de toevoeging van het wasmiddel een hoeveelheid van 16 blaasjes. Met behulp van een fluorescentie spectrometer, prikkelen de steekproef bij 550 nm en scan de SRB-uitstoot tussen 570 nm en 630 nm. Verwacht een 4-8 voudige toename in fluorescentie SRB afhankelijk van de ingekapselde hoeveelheid wasmiddel na toevoeging als het membraan oplosbaar en bezit SRB verdund.
  12. Kenmerken de lipiden en eiwitten uit via fluorescentiespectroscopie 24 en SDS-PAGE gelelektroforese, respectievelijk. Gebruik een gevoelige kleuring methode, in het bijzonder voor de hoge LP t-SUV monsters (zie Materials List). Typisch ongeveer 50% van zowel lipide- en eiwit ingang verloren tijdens de bereiding waardoor een LP dicht bij de nominale waarde.
  13. Karakteriseren SUV maten met behulp van dynamische lichtverstrooiing 24 of elektron Micrpy 48. WINKEL SRB met v-SUV bij 4 ° C tot ~ 3-4 dagen. Niet in de vriezer, als het invriezen en ontdooien breekt het membraan en releases ingekapseld SRB.

4. SUV-SBL Fusion Analyse Monitor Lipid Alleen release

  1. Vorming van de tethered ondersteunde bilaag binnen de microfluïdische stromingskanalen
    1. Plaats de PDMS blok (stap 1.11) onder hoog vacuum gedurende ten minste 20 min voorafgaand aan het experiment om opgeloste gassen te verwijderen. Dit reduceert de kans op luchtbellen in de microkanalen in het fusie-experiment.
    2. Schakel de microscoop setup en verwarm het podium monsterhouder (figuren 3 en 4) op de gewenste temperatuur.
    3. Filter de reconstitutie buffer gebruikt om de vesicles te verdunnen door een filter met 0,45 urn of kleiner poriegrootte.
    4. Verdun ~ 30 ul van de NBD-PE gelabelde t-SUV's of eiwit-vrij (pf-SUV's) controle liposomen (voorraadoplossing 0,5-1 mM lipide) met ~ 60 pi buffer. De eindconcentratie is hier niet kritisch.
    5. Ontgas dit mengsel met behulp van een 3 ml spuit. Druk op het grootste deel van de lucht boven het monster terwijl de spuit verticaal. Sluit de tip (naald gratis) met behulp van paraffine film en creëren een vacuüm door te trekken naar beneden de zuiger. Tik de injectiespuitcilinder ontgassing van de oplossing te versnellen. Herhaal dit proces een paar keer totdat er geen luchtbellen meer voordoen wanneer vacuüm wordt toegepast.
    6. Gebruik een hypodermische naald met een diameter iets groter dan de buis die de PDMS blok is bevestigd aan een perforator op het dekken van een microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat het doorgestoken stukje plastic is niet in de buis als het de slang later aangesloten op de microfluïdische kanaal inlaat kunnen verstoppen.
    7. Vul het ontgast SUV oplossing in de microcentrifugebuis met een gat in de dop en plaats deze in de houder op de microscoop podium in evenwicht tot de ingestelde temperatuur.
    8. place een vooraf gereinigd dekglaasje (deel 2) in een plasma schoner en lopen lucht plasma voor ongeveer 5 minuten. Zet de plasma behandelde dekglaasje (behandelde zijde naar boven) op een paar pluisvrije weefsels dienen als een kussen.
    9. Verwijder de aluminiumfolie van het ontgaste PDMS blok en zet het blok bovenop het dekglaasje. Bij hergebruik van de PDMS blok gezet op en maak een stukje plakband om het kanaal kant om het schoon te maken. Druk de PDMS te blokkeren op het dekglaasje met behulp van een pincet om het te plakken, maar niet te hard als het glas zou kunnen breken op.
    10. Plaats de gemonteerde doorstroomcel op de microscoop podium en sluit de slang aan de SUV reservoir en de spuitpomp respectievelijk. Tape het dekglaasje naar het podium (Figuur 3B).
    11. Begin opzuigen SUV bij 3 gl / min totdat de oplossing de kanalen opvult (~ 2,25 mm / sec voor 75 urn x 300 urn kanaaldoorsnede). Als oplossingen voor alle kanalen beginnen omhoog te bewegen the slang aan de uitgangszijde, verminderen stroom naar 0,5 pl / min en incubeer gedurende 30-45 min.
      Opmerking: De tijd tussen plasma behandelen van het glaasje en stroomt de SUV in het kanaal niet meer dan 10-20 min het effect van de plasmabehandeling is voorbijgaand.
    12. Controleer de kanalen voor een lek. Gebruik een 10-20x doelstelling lucht naar NBD-PE fluorescentie observeren vanuit het NBD-PE bevatten t- of pf-SUV's. Excite NBD fluoroforen met behulp van de 488 nm laser. Lekken zijn moeilijk op te sporen met behulp van helderveld verlichting.
    13. Zet een buis met ontgast reconstitutie buffer in de houder en laat de temperatuur in evenwicht komen zo snel veranderingen in temperatuur kan leiden tot defecten in het SBL. Stop de stroom en wacht ~ 1 min om te controleren of de doorstroming volledig is gestopt en er geen luchtbel zal worden opgezogen in de buis voordat u de inlaat buizen naar de ontgaste buffer.
    14. Spoel alle kanalen met ontgast buffer om ongebonden SUV's weg te wassen.
    15. Overschakelen naar een higher vergroting TIRF doelstelling (60X, olie, NA 1,45-1,49) en controleer of de bilaag lijkt homogeen en vrij is van alle voor de hand liggende grootschalige gebreken, zoals donkere vlekken of lipide buisjes uit dat zich uitstrekt van de SBL.
  2. Controleer de vloeibaarheid van de bilaag
    1. Als een specifieke FRAP eenheid niet beschikbaar is, of als een FRAP sequentie niet kan worden geprogrammeerd, dan kwalitatief testmembraan vloeibaarheid als volgt.
      1. Sluit het velddiafragma een kleine grootte (~ 40 urn diameter) en stel de 488 nm excitatie lichtintensiteit door de software (20-80 uW of 15-60 nW / um 2) de NBD-PE fluorescentie bleken de belichte gebied significant, maar niet volledig. Voor een fluïdum bilaag, bij steady state, de fluorescentie-intensiteit in het midden van het blootgestelde gebied moet lager dan aan de randen, als intacte NBD-PE moleculen Voer het blootgestelde gebied en diffunderen een zekere afstand voor het bleken. Wanneer daarentegen het oppervlak S gehechtUV's niet barsten of andere reden de ondersteunde bilaag niet vloeibaar moeten alle fluoroforen op het blootgestelde oppervlak bleken.
        Opmerking: Laser intensiteitswaarden in dit en latere stappen zijn bedoeld als ruwe uitgangspunt en moeten worden geoptimaliseerd voor een gegeven stel omstandigheden.
      2. Stop de verlichting en start opnieuw enkele minuten later de resultaten van de steady state metingen verifiëren
    2. Programmeer een FRAP sequentie voor een meer kwantitatieve meting, indien mogelijk. Zie aanvullende bestanden en de bijbehorende legenda voor details.
      Let op: soms SUV zal hechten aan het glas dekglaasje, maar slagen er niet te barsten en vormen een vloeistof bilaag. Als dit gebeurt, spoel de kanalen met ontgast reconstitutie buffer die 10 mM Mg 2+ naar ondersteunde dubbellaagsformatie helpen. Gebruik fluorescentie bleken om tweelaags vloeibaarheid beoordelen als in 4.2. Zodra een vloeistof dubbellaag wordt gevormd, spoelen met Mg 2+ -vrij Reconstitution buffer.
  3. Invoering v-SUV's in de microfluïdische stromingskanalen
    1. Ontgas reconstitutie buffer en hiermee de v-SUV voorraadoplossing met een factor van ongeveer 10 3 5 verdunnen tot 10, afhankelijk van de v-SUV voorraadconcentratie. Doel voor een verdunning die resulteert in ongeveer 10-100 fusiegebeurtenissen binnen 60 seconden in het gezichtsveld.
      Opmerking: Te veel fusies verhoging van de achtergrond fluorescentie (aangezien elk event deposito's LR-PE of heb lipide etiketten in de SBL) en zorg detectie en analyse van fusie gebeurtenissen moeilijk. In tegenstelling tot een fusie tarief dat te laag is resulteert in een slechte statistieken of vereist de verwerving van veel meer films. Voor een v-SUV concentratie van 0,1 mM lipide, te beginnen door het verdunnen van 5 ul SUV leverbaar in 995 ul reconstitutie buffer en verdun vervolgens 5-50 ul van deze in 950-995 pi reconstitutie buffer.
    2. Laat de temperatuur evenwicht voor het stoppen van de stroom en inserTing de inlaat buis in de verdunde v-SUV-oplossing.
    3. Pas de TIRF hoek en polarisatie als volgt.
      1. Nadat de gewenste polarisatie door rotatie van de excitatiebundel Pas de kanteling van de spiegel bevelen de positie van de bundel via een stappenmotor via de software. Verplaats de positie van de laserstraal van het centrum van het objectief aan de achterkant brandvlak opzij excentrisch. Observeren het licht van het doel aan de voorzijde komen met een toenemende hoek ten opzichte van de as als doel de positie verder wordt bewogen excentrisch.
      2. Let op de motorpositie wanneer de uittredende bundel eerste verdwijnt in het doel, dat wil zeggen, wanneer TIR eerder wordt behaald.
      3. houden langzaam verder bewegen van de bundel positie uit het midden, terwijl het bewaken van de fluorescentie van het oppervlak. Let op de motor positie wanneer het oppervlak fluorescentie verdwijnt wanneer de bundel te ver buiten het centrum is verhuisd.
      4. Kies een balk positio n tussen de twee bovengenoemde grenswaarden vastgesteld. Voor de beste signaal-ruisverhouding en signaalversterking bij fusie Kies een ondiepe penetratiediepte (straalpositie dichter bij de rand van het doel) die nog steeds zorgt voor een gelijkmatige verlichting van de Viewfield.
        Opmerking: Het beste is om op dezelfde TIR balk positie (zelfde indringdiepte) voor alle experimenten te houden nadat de instellingen zijn geoptimaliseerd. Controleer het roteren van de polarisatie niet tot veranderingen van straalpositie.
    4. Flow-v SUV in het kanaal met een stroomsnelheid van 2 ul / min, overeenkomend met een gemiddelde lineaire stroomsnelheid van ~ 1,5 mm / sec tot een doorsnede van 75 urn x 300 um. Overschakelen naar de excitatie / emissie-instellingen om lipide mengen monitor (LR of alleen hebben).
  4. Observeren fusie tussen enkel v-SUV's en de SBL

.jpg "/>
Figuur 3. De experimentele opstelling pTIRF. (A) Schematische weergave van een v-SUV en een t-SBL op een glassubstraat. Kunstmatige kleuren TIRFM afbeeldingen één SUV-SBL samensmelting tonen lipide docking (1) en afgifte van lipide kleurstof in de SBL (2) gevolgd door bleken en afname van de fluorescentie-intensiteit (3). De totale fluorescentie-intensiteit (som van de pixelwaarden in de 5.3 micrometer x 5,3 micrometer doos) signaal wordt getoond. (B) Het dekglaasje gebonden aan het PDMS blok geplakt op de verwarmde podium. Inlaatbuis voor microfluïdische kanalen monsters van de buis in metalen monsterhouder (rechts) opgezogen door de injectiepomp (links). Onder de pomp is de dubbele emissie unit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

oad / 54349 / 54349fig4.jpg "/>
Figuur 4. Schematische voorstelling van de experimentele opstelling. De uitdovende golf ontstaat op het glas-buffer interface in de microfluïde kanaal. De SBL is gevormd op het glas en v-SUV aangezogen uit de metalen monsterhouder (rechtsboven) door het kanaal in de spuit (linksboven). M, spiegel; DM, dichroïsche spiegel; L, lens; F, filter; P, polarisator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voortdurend prikkelen en te bewaken v-SUV fluorescentie met behulp van een 561 nm (voor LR-PE) of 638 nm (voor deed) laser, afhankelijk van de fluorofoor opgenomen in v-SUV's. Als v-SUV's het stromingskanaal en dock op en de zekering te bereiken met de SBL, de achtergrond fluorescentie signaal begint op te stapelen.
  2. Stel de excitatie-intensiteit laser door de software continu bleken de achtergrondfluorescentie, zodanig dat bij steady state nieuwe docking en fusion gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden waargenomen.
    Opmerking: Als het bleken te langzaam is, zal de achtergrond fluorescentie te hoog zijn. Als bleken te snel zullen signalen van aangemeerd SUV's en van fluoroforen vrijkomt in de SBL snel verdwijnen, verkorten het venster waarin fusie van aangemeerd SUV kan worden gedetecteerd of een fluorofoor kan worden gevolgd. LR-PE geëxciteerd bij 561 nm, 2,5-7,5 mW verlichten van een cirkel 190 urn diameter (100-250 nW / um 2) is een redelijke waarde te starten. Voor 638 nm excitatie van deed, 0,8-1,6 mW macht over een 190 micrometer cirkel met een diameter (30-60 nW / um 2) kan worden gebruikt voor de eerste tests.
  3. Acquire meerdere films op verschillende posities in een bepaald kanaal. Controleer NBD-PE fluorescentie te controleren of de SBL geen defecten op deze posities heeft. Acquire full-frame films met de maximale snelheid (~ 50 frames / sec) of een bijgesneden gebied van belang bij hogere framesnelheid (tot~ 100 Hz) gedurende 60 sec.
  4. Ga naar een andere microfluïdische kanaal en herhaal de opnames voor andere aandoeningen. Onder negatieve controles zoals een eiwitvrij SBL of SUV, voeg de oplosbare cytoplasmatische domein van de v-SNARE VAMP2 (CDV) als een remmer of behandelt v-SUV met tetanus neurotoxine (30 min bij 37 ° C) in één of meer van de kanalen op dezelfde dekglaasje.
  1. Opruimen en PDMS recycling
    1. Om de PDMS blok hergebruiken, spoel de microkanalen met -200 pl 70% ethanol met een stroomsnelheid van 5 pl / min. Tot slot, zuigen lucht door de buizen en kanalen.
    2. Maak de PDMS blokkeren voorzichtig van het dekglaasje door lichtjes te knijpen. Plaats het op een schoon stuk aluminiumfolie. Bewaar in een vacuümexsiccator. Het kan meerdere keren worden hergebruikt.
    3. Voor een grondige reiniging spoel de kanalen met een detergent of natriumhydroxide oplossing vóór de 70% ethanol. Als alternatief, verwijder alle buizen weer m de ultrasone trillingen PDMS en het blok voor 30 minuten in isopropanol, voor het drogen en het invoegen van nieuwe leidingen.

5. SUV-SBL Fusion Analyse Monitor Lipid en Content kort tegelijk

  1. Voor tweekleurige monitoring van gelijktijdige lipiden en oplosbare inhoud vrij te geven, volgt u dezelfde stappen als in hoofdstuk 4, met uitzondering van het gebruik liposomen gemerkt met zowel een lipide (DID) en een oplosbare inhoud (SRB) label, zoals uitgelegd in hoofdstuk 3 SRB is ingekapseld bij 10 mM en aanvankelijk zeer zichzelf gedoofd.
  2. Met de configuratie schematisch weergegeven in figuur 4, wekken SRB en deed fluorescentie gelijktijdig gebruikt 561 nm en 638 nm lasers respectievelijk. Een dichroïsche spiegel (640 nm) splitst de emissie in twee bundels die worden uitgevoerd door middel van een korte (595/50 nm) en een lange (700/75 nm) golflengte filter om de SRB detecteren en deed uitstoot, respectievelijk. De twee emissie-bundels worden geprojecteerd side-by-side op de EM-CCD-chip.
jove_title "> 6. Gegevensanalyse

  1. Analyse van de FRAP gegevens
    1. Gebruik de MATLAB-programma voorzien in de aanvullende informatie aan de lipide diffusiecoëfficiënt, D te schatten. Het programma leest een lijst van OME-TIFF bestanden 49, detecteert het gebleekte gebied plot de gemiddelde pixelwaarden in het gebleekte gebied als functie van de tijd, en past de resulterende herstelcurve een model van Soumpasis 50 om de hersteltijd te extraheren, figure-protocol-3 , Waarbij w de straal van de cirkel gebleekt.
      Opmerking: Een MATLAB programma werd eerder 25 voor de analyse van FRAP films met behulp van Nikon ND2 bestanden voorzien. Het actuele programma leest OME-TIFF bestanden 49, omdat de meeste formaten gemakkelijk kan worden omgezet OME-TIFF. Een kwantitatieve analyse van FRAP gegevens eenvoudigste en meest nauwkeurig wanneer bleken instantaan de bleached regio is een cirkel, en bleken tijdens de uitlezing is te verwaarlozen. Hoewel deze criteria niet strikt in de eenvoudige FRAP metingen hier beschreven wordt voldaan, kan een redelijke schatting van de diffusiecoëfficiënt worden verkregen. Voor een meer nauwkeurige schatting, gebruik dan het volgen van enkele lipide kleurstoffen (paragraaf 6.3).
  2. Analyse van docking rate, fusion rate en docking-to-fusion vertragingstijden
    1. Gebruik ImageJ om een ​​film te openen om te analyseren en aan te passen helderheid en het contrast om duidelijk te identificeren docking en fuseren gebeurtenissen. Start de SpeckleTrackerJ 26 plugin. Zie Smith et al. 26 en online documentatie voor SpeckleTrackerJ voor instructies voor gebruik.
    2. Identificeer alle nieuw aangemeerd SUV in SpeckleTrackerJ. Om SUV's die nauw dock van degenen die stuiteren de SBL te onderscheiden, opleggen van een minimum docking duur van een paar frames. Sla de tracks, en herhaal voor alle films.
      Opmerking: Voor de dockoning rate, het enige dat telt is om te bepalen wanneer een SUV gedokt, dus alleen het eerste frame waarin de SUV's gedokt moet worden opgenomen in deze tracks. De rest van de tracks zullen niet in aanmerking worden genomen in de analyse. Echter, auto-het bijhouden van elke SUV totdat het bleekt of zekeringen helpt merk SUV's die al zijn gevolgd.
    3. Identificeer alle fusing blaasjes. Hiervoor moeten de sporen omvatten alle frames van het eerste frame een SUV aangemeerd tot het eerste frame waarin fusie duidelijk door een plotselinge toename van de fluorescentie van de vlek gevolgd. De duur van deze sporen worden gebruikt voor het docking-to-fusie vertragingen te berekenen. Sla alle tracks. Herhaal dit voor alle films.
    4. Voor batch analyse van docking of fusie van gegevens, een lijst opstellen van het traject bestanden uit de betreffende films en voer de MATLAB's die bij de Karatekin en Rothman 25. Aanwijzingen die samen worden voorzien van het programma.
      Opmerking: De programma's plot van de cumulative docking en fusiegebeurtenissen als functie van de tijd, op basis van gegevens uit het traject bestanden. Docking en fusion tarieven zijn geschat op basis van de hellingen van deze percelen. Voor fusie gegevens wordt het docking-to-fusie vertragingen ook berekend en de verdeling uitgezet als survival plot, dwz de kans dat fusie nog niet heeft plaatsgevonden op een bepaalde vertraging na het koppelen.
  3. Lipid diffusiviteit
    1. Voor elke samensmelting, volgen enkele fluorescente lipiden mocht waarneembaar worden wanneer zij voldoende afstand van het fusie (figuur 6) zijn verspreid. Gebruik SpeckleTrackerJ voor het bijhouden, en sla de tracks voor verdere analyse met behulp van MATLAB. Afhankelijk van de grootte van de vesicle fusing, kenmerkend 3-30 enkele fluoroforen kunnen worden gevolgd. Omdat meer titels wenselijk voor het berekenen van figure-protocol-4 , Proberen om enkele moleculen zo lang bijhoudenmogelijk handmatig gecorrigeerd trajecten indien nodig.
    2. Bereken het gemiddelde kwadraat verplaatsing (MSD) voor enkele lipide marker trajecten die> 40-50 frames (ongeveer ~ 1,5 sec) duren. Gebruik de MSD aan de lipide diffusiecoëfficiënt berekenen, figure-protocol-5 . Zie Smith et al. 26 en Stratton et al. 27 voor meer informatie.
  4. Single lipide kleurstof intensiteit, SUV-SBL intensiteit reductie factor, en blaasjes grootte
    1. Meet de som van de pixelwaarden van een lipide marker in een 3 x 3 pixels (0,8 um x 0,8 um) rondom de markering voor ~ 15 frames voor en na de markering bleekmiddelen in een enkele stap. Aftrekken van de achtergrondintensiteit gemiddeld over de post-bleekmiddel kaders van de pre-bleach gemiddelde intensiteit voor het bleken van de intensiteit van het gevolgde lipide marker verkrijgen. Herhaal de meting voor zoveel merkers als praktisch voor een bepaalde film.
    2. Zet de distributie van enkele lipide label intensiteiten, figure-protocol-6 , En breng een Gauss naar het gemiddelde te schatten.
    3. Bereken de vertraging tussen het moment fusie zich voordoet en de baan van een enkele lipide merker bezit in dat geval eindigde in een enkele stap bleken. Het verkrijgen van het bleken tijd voor een fluorofoor in de SBL, figure-protocol-7 , Door het uitzetten van de overlevende functie van de vertragingen en passend bij een exponentiële.
      Let op: Omdat de gepolariseerde excitatie veld koppels meer zwak om de fluoroforen op een SUV, het bleken tijd van een SUV is meestal veel langzamer 27.
    4. Schatting figure-protocol-8 De intensiteit reductiefactor voor een lipide kleurstof wanneer de SUV opzichte wanneer het in de SBL na Stratton 27 (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> figure-protocol-9 is de intensiteit van een kleurstof in de SUV).
      Let op: Als het bleken verwaarloosbaar waren, figure-protocol-10 gelijk aan de gekoppelde intensiteit zou figure-protocol-11 (punt (1) in figuur 3A, rechter paneel), gedeeld door de totale intensiteit bereikt na alle fluoroforen zijn bij fusie gestort in het SBL (stippellijn gelabeld figure-protocol-12 in figuur 3). Vanwege de snelle bleking in de SBL, figure-protocol-13 is meestal niet bereikt en een nauwkeurige schatting van figure-protocol-14 vergt het aanbrengen van de release kinetiek om een uitdrukking die 27 incl udes beide figure-protocol-15 (Zie 6.4.3) en figure-protocol-16 . Aparte uitdrukkingen worden verschaft in Stratton et al 27 voor de gevallen van poriën beperkt en verspreiding beperkte release kinetiek.; de beste fit geval varieert van evenement naar evenement (zie 6.5.1 voor het geval van poriën beperkt kinetiek).
    5. Bereken het blaasje gebied voor afzonderlijke gebeurtenissen van 27 figure-protocol-17 waar figure-protocol-18 is de aangemeerd SUV intensiteit, figure-protocol-19 is de gemiddelde intensiteit van een enkele lipide kleurstof in de SBL, figure-protocol-20 de intensiteit reductiefactor voor een lipide kleurstof wanneer het in de SUV opzichte wanneer het in de SBL enatie 1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> is de bekende oppervlaktedichtheid van lipide kleurstoffen.
  5. Fusion porie eigenschappen
    1. Ervan uitgaande dat release is porie beperkt is, passen de lipide label vrijgavekinetiek tot 27 figure-protocol-21 waar figure-protocol-22 is aangemeerd SUV intensiteit vlak voor fusie en de overige parameters zijn zoals eerder gedefinieerd. Gebruik de waarde van figure-protocol-23 verkregen in 6.4.3 als een vaste parameter, en haal de beste pasvorm ramingen voor figure-protocol-24 en figure-protocol-25 .
    2. Schat de fractie van de tijd de porie open is, P 0, in de veronderstelling vertraging van lipide release is te wijten aan porie flikkeren 27:60; figure-protocol-26 = figure-protocol-27 , Waarbij A ves is het blaasje gebied (sectie 6.4.5), b de poriën hoogte (meestal achterwege blijven ~ 15 nm), RP ≈ 3 nm is de effectieve poriestraal zoals gezien door de diffunderende lipide labels en omvat half de bilaag dikte (~ 2 nm), figure-protocol-28 is de lipide diffusiviteit (berekend 6,3), en figure-protocol-29 is de tijd voor de lipiden worden vrijgegeven uit de SUV in de SBL (van 6.5.1).
    3. Om te bevestigen dat een nominale P 0> 1 geeft een volledig open poriën, P 0 = 1, past de intensiteit tijdsverloop aan vergelijking 4 van Stratton et al. 27, de voorspelde kinetiek voor een permanent open poriën. Deze fit moet beter zijn dan fittin zijng de expressie in 6.5.1 voor een permanent open poriën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

SBL Kwaliteit

Het is cruciaal om de kwaliteit en de vloeibaarheid van de SBL vóór het fusie-experiment controleren. De fluorescentie onderaan glaszijde van een microfluïde kanaal moet uniform zijn, zonder duidelijke gebreken. Als een luchtbel passeert hoewel het kanaal, laat meestal zichtbare littekens op de SBL. Als er zulke grote schaal littekens / defecten, geen gebruik maken van dat kanaal. Soms SUV's ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Succesvolle implementatie van de SUV-SBL fusie test hier beschreven is afhankelijk kritisch over een aantal belangrijke stappen, zoals functionele reconstructie van eiwitten in liposomen, het verkrijgen van goede kwaliteit SBLs, en het kiezen van de juiste beeldvorming parameters om enkele moleculen te detecteren. Hoewel het wat tijd en moeite kunnen nemen om te slagen, wanneer de test succesvol is geïmplementeerd, biedt het een schat aan informatie over het fusieproces niet beschikbaar zijn van een andere in vitro<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

We danken Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) voor het ontwerp en de bouw van de gepolariseerde TIRF-microscoop, David Baddeley (Yale University) voor hulp bij instrumentatie voor tweekleurige detectie, en James E. Rothman (Yale University) en Ben O'Shaughnessy (Columbia University) en leden van hun groepen voor stimulerende discussies. EK wordt ondersteund door een Kavli Neuroscience Scholar Award van de Kavli Foundation en NIH-subsidie 1R01GM108954.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Milli-Q (MQ) waterMillipore
KOHJ.T. Baker3040-05
Ethanol 190 ProofDecon
IsopropanolFisher ChemicalA416P4
HEPESAmericanBioAB00892
Sodium Cholride (KCl)AmericanBioAB01915
DithiothreitolAmericanBioAB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)AmericanBioAB00892
EGTAAcros Organics409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform J.T. Baker9180-01in glazen fles, LET OP, draag PPE
MethanolJ.T. Baker9070-03in glazen fles, LET OP, draag PPE
Liposoombereiding
Gastight Hamilton spuitHamiltonvar. groottengebruik alleen glazen spuit met oplosmiddelen (Chloroform/ Methanon, 2:1, v/v)
Glazen buizen Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm schroefdop kweekbuisPyrex 70825-16grondig schoonmaken, spoelen met chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)Avanti Polar Lipids850457Lipiden komen opgelost in CHCl3 of als lyfiliseerde poeder in verzegelde flacons. Bij openen in delen verdelen. Extra opslaan als gedroogde lipidefilms onder inerte atmosfeer bij -20 °C. Houd voorraden in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) bij -20 °C. Laat op RT komen voordat u opent
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (natriumzout), 18:1 PS (DOPS)Avanti Polar Lipids840035Zoals hierboven.
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)Avanti Polar Lipids850804Zoals hierboven.
L-α-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (hersenen, varkens) (ammoniumzout), hersenen PI(4,5)P2Avanti Polar Lipids840046Zoals hierboven.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammoniumzout), 18:1 NBD PEAvanti Polar Lipids810145Zoals hierboven.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout), 18:1 PEG2000 PEAvanti Polar Lipids880130Zoals hierboven.
cholesterol (schapenwol, >98%)Avanti Polar Lipids700000Zoals hierboven.
DiD' olie; DiIC18(5) olie (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchloraat)Molecular ProbesD-307
Rotavapor R-210BuchiR-210verwarmingsbad boven Tm van gebruikte lipiden
OG n-Octyl-β-D-GlucopyranosideAffymetrix0311bewaar bij -20 °C, laat op RT komen voordat u opent
Schudden - Eppendorf Thermomixer REppendorf
Slide-A-Lyze Dialyse Cassettes, 20k MWCO, 3 mllife technologies66003
Bio-Beads SM-2 AdsorbentenBio-Rad1523920
OptiPrep Dichtheidsgradiënt MediumSigma-AldrichD1556
Ultracentrifugeerbuis, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mmBeckman Coulter41121703
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineBMolecular ProbesS-1307
Econo-Column Chromatografie Kolommen, 2.5 × 10 cmBio-Rad7372512
Sepharose CL-4BGE Healthcare17-0150-01
SYPRO Orange Protein Gel StainMolecular ProbesS-66505.000x Concentraat in DMSO
PDMS blok
Sylgard 184 Silicone elastomeren kit, PDMSDow Corning3097358-1004
Pyrex glazen petrischaal, 150 x 20 mm, compleet met dekselCorning3160-152
Gatjespons - Herbruikbare Biopsie Pon, 0.75 mmWorld Precision Instruments504529
Handmatige Gatjesponsmachine SYNEOMHPM-UNV
Boor .035 x.026 x 1.5 304 SS TiN gecoate ronde ponsSYNEOCR0350265N20R4boordiameter: 0,9 mm, ponsboorgrootte: 0

Referenties

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287(2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006(2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109(2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ondersteunde BilayerLipidiek KleurstofoverdrachtVesikel FusiegebeurtenissenFluorescentieherstelGepolariseerde ExcitatieVrijgave van Oplosbare LadingFusieporiedynamiek
SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.