Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van drie verschillende methoden voor het analyseren van celproliferatie in borstkankercellijnen. Dit omvat het gebruik van conventionele celtelling, op luminescentie gebaseerde celviabiliteit en celtelling door het gebruik van een celimager. Elk biedt voordelen voor de reproduceerbare meting van celproliferatie.

Abstract

Het meten van celproliferatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, elk met verschillende niveaus van gevoeligheid, reproduceerbaarheid en compatibiliteit met high-throughput formaten. Dit protocol beschrijft het gebruik van drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in vitro, waaronder een conventionele hemocytometer tellkamer, een luminescentie-gebaseerde test die de verandering in de metabolische activiteit van levensvatbare cellen gebruikt als maatstaf voor het relatieve aantal cellen, en een multi-mode celbeeldvormer die het aantal cellen meet met behulp van een telalgoritme. Elke methode heeft zijn eigen voor- en nadelen voor het meten van celproliferatie, inclusief tijd, kosten en compatibiliteit met hoge doorvoer. Dit protocol toont aan dat elke methode nauwkeurig celproliferatie in de loop van de tijd kan meten en gevoelig was om groei bij verschillende cellulaire dichtheden te detecteren. Bovendien was de meting van celproliferatie met behulp van een celbeeldvormer in staat om aanvullende informatie te verstrekken, zoals morfologie, confluentie en maakte een continu bewaken van celproliferatie in de loop van de tijd mogelijk. Kortom, elke methode is in staat om celproliferatie te meten, maar de gekozen methode is gebruikersafhankelijk.

Introduction

Het tumor suppressor gen p53, een essentiële regulator van een aantal cellulaire processen zoals celcyclus, apoptose en senescentie ^1. Het is verantwoordelijk voor genomische stabiliteit en is daarom cruciaal voor het handhaven van het evenwicht van celdood en celgroei. Mutaties in p53 komen vaak bij kanker en de belangrijkste oorzaak van p53 inactivering leidt tot ongecontroleerde celproliferatie kanker ^2. Interessant mutaties in p53 vertegenwoordigen slechts ongeveer 25% van de borstkankers ^3, wat suggereert dat andere mechanismen verantwoordelijk voor het verlies van p53 functie. De recent ontdekte p53 isovormen is aangetoond dat overexpressie in een aantal menselijke kankers, en kan p53 functie ^4,5 moduleren. We hebben eerder aangetoond dat het p53-isovorm, Δ40p53, is het hoogst tot expressie isovorm bij borstkanker en aanzienlijk opgereguleerd in borstkankercellen, in vergelijking met normale aangrenzende tissue ^6. Naar aanleiding van dit, we stabiel getransduceerde menselijke borstkanker cellijn MCF-7 tot Δ40p53 overexpressie met behulp van de LEGO-IG2-puro + vector (GFP +) ^7. Deze cellen werden gebruikt om te onderzoeken of hoge Δ40p53 expressie verhoogt celproliferatie aanbiedingen in borstkankercellen.

Er zijn vele directe en indirecte methoden voor het meten van celproliferatie in vitro gekweekte cellen ^8,9. Deze kan worden uitgevoerd als continue metingen in de tijd, of eindpunt assays ^10. Gebruikelijke werkwijzen zijn nog steeds bruikbaar, zoals celtellingen behulp van een hemocytometer. Deze test is een lage kosten en directe meting van het aantal cellen, maar het vertrouwen op de grote cellen en hoogopgeleide training om fouten en grote standaard afwijkingen van de tellingen te minimaliseren. De noodzaak om metingen geschikt is voor high-throughput formaten voeren heeft geleid tot de ontwikkeling van multiwell-plaat assays. Deze luminescentie-gebaseerde testen measure aantal cellen op basis van een luminescent signaal dat evenredig is met de metabolische activiteit van de cel ^11,12. Meer recent, de invoering van hoge gehalte imaging platforms heeft het mogelijk gemaakt voor nieuwe instrumenten die celdeling controleren, terwijl het verstrekken van kwantitatieve en kwalitatieve verzamelen fenotypische data, en omvat een verscheidenheid aan systemen ^13. Al deze werkwijzen wegen om celgroei te meten, hetzij door continue meting of eindpunt assays, en bezitten elk een reeks voordelen en nadelen met betrekking tot gevoeligheid, doorvoer van aantallen monsters en celinformatie, die derhalve afhankelijk kan worden gewogen op de onderzoeksvraag.

Dit protocol beschrijft drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in vitro, waarbij elke methode waarbij verschillende reeksen van gevoeligheid, reproduceerbaarheid en multi-well plaat formaat. Dit protocol doel belang het gebruik van een hemocytometer geteld chamber, een op luminescentie gebaseerde assay cellevensvatbaarheid en mobiele imager, bij de meting van celproliferatie gedurende een tijdsverloop van 96 uur. Hiervoor is de groei van vector-getransduceerde cellen (MCF-7-LEGO) vergeleken met cellen getransduceerd tot overexpressie Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), met behulp van drie verschillende celdichtheden. Celproliferatie werd gemeten elke 24 uur tot 96 uur. Elke methode bleek zijn eigen voor- en nadelen, en afhankelijk van het doel van het experiment, elk nog een waardevolle werkwijze voor het verschaffen van informatie over de snelheid van proliferatie.

Protocol

1. Voorbereiden Cellen voor verspreiding Analyses

Opmerking: Bereid de twee cellijnen op dezelfde wijze en zaad in dezelfde notatie voor elke methode te analyseren.

1. Kweek MCF-7-LEGO en MCF-7-cellen Δ40p53 ⁷ tot 75-80% samenvloeiing in T-75 ^cm2 weefselkweek kolven met behulp fenolrood vrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) , 200 mM L-glutamine, 2 ug / ml insuline en 1 ug / ml Puromycine bij 37 ° C met 5% _CO2. Behandel cellen in een steriele bioveiligheid kast klasse II.
   Opmerking: De hoeveelheid tijd die nodig is om de cellen groeien tot samenvloeiing afhankelijk van het zaaien verdunning. Ter voorbereiding van uitplaten van de cellen voor proliferatie assays, zaad de cellen bij een 1: 3 verdunning in DMEM aangevuld en onderhouden in normale groeiomstandigheden gedurende 3 dagen tot 75-80% confluentie.
2. Om de cellen uit de kolf te verwijderen, giet de media ineen afvalcontainer. Spoel de cellaag met 2 ml voorverwarmde 2x trypsine. Zuig trypsine. Nogmaals 2 ml voorverwarmde trypsine om de cellaag en plaats in een incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 5% _CO2.
   1. Zodra de cellen los te maken, was de cellen met 10 ml vers opgewarmd aangevuld DMEM. Breng de celsuspensie in een steriele 15 ml buis en centrifugeer bij 491 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorgvuldig aspireren en gooi de supernatant.
3. Resuspendeer de celpellet in 5 ml vers DMEM gesupplementeerd. Voer een celtelling de juiste dichtheid zaad cellen in 96-well platen bepalen.
   1. Verdun 100 ul van de celsuspensie in 900 ul 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Plaats een nieuwe 60 micrometer sensor op de geautomatiseerde cel teller. Houd de zuiger en dompel de sensor in de verdunde celsuspensie. Langzaam laat de zuiger op de mobiele toonbank. Haal de sensor uit de cel counter wanneer voltooid.
      Opmerking: De celtelling wordt op de cel teller in cellen / ml.
4. Zaadcellen in een eindvolume van 100 pl (in DMEM) in een 96-puts plaat bij ~ 20% confluentie ruimte voor celgroei en meten van proliferatie gedurende 3-5 dagen (zie tabel 1) mogelijk. Seed alle cellijnen in drievoud.
   Opmerking: Voor dit experiment werden drie verschillende celdichtheden beoordeeld om de optimale celdichtheid te bepalen. De vereiste celaantallen zijn samengevat in tabel 1. Zaad cellen bij een lagere dichtheid als meting van meer groei op lange termijn nodig is.
   1. Voor de hemocytometer en-luminescentie gebaseerde testen, bereiden een bord per tijdstip (dwz 4 platen per test). Voor mobiele imager assay bereiden slechts één plaat voor de duur van het experiment.
5. Handhaaf cellen bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 24 uur.

2. Vaststellen celgetal Using een hemocytometer

1. Voorverwarmen zowel medium en trypsine tot 37 ° C in een celkweek incubator, oven of waterbad. Aspireren media uit cellen in een afvalcontainer, een keer wassen met 30 pi 2x trypsine, en zuig het trypsine.
2. Was de cellen opnieuw met 30 ui 2x trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes tegen de rand van de plaat om de cellen los te maken van de plaat. Voeg 50 ul DMEM aangevuld en meng cellen door pipetteren totdat de cellen vormen een enkele celsuspensie.
3. Bereid hemocytometer met het schoonmaken van het oppervlak en de glazen afdekplaat met 70% ethanol.
4. Plaats de glazen afdekplaat-slip op het tellen van kamers en brengen tot 'Newton's breking ringen' is te zien tussen de cover-slip randen en de hemocytometer.
   Opmerking: Deze geven aan dat de cover-slip correct heeft gehandeld op de hemocytometer.
5. Voorzichtig pipet 20 ul van celsuspensie onder de kap-slip, het vullen van de telkamer door capillaire beweging.Plaats hemocytometer onder 10x vergroting van een microscoop en visualiseren van de telling kamers in het raster lay-out.
6. Aantal cellen in de buitenste 4 kwadraten van de grid. Om de nauwkeurigheid te verbeteren, herhalingen van extra buitenste pleinen, indien nodig, of tot de telling heeft bereikt 70-100 cellen ^14,15.
   1. Bereken celconcentratie per ml als volgt: Gemiddeld aantal cellen per vierkante x verdunningsfactor (indien gebruikt) x 10 ⁴
7. Herhaal stap 2,1-2,8 elke 24 uur gedurende 96 uur na het zaaien.

3. Bepalen celproliferatie gebruik van een luminescentie-gebaseerde test

Let op: Dit is een eindpunt meting. Zodra het reagens wordt aan de cellen toegevoegd, de plaat slechts eenmaal worden gekwantificeerd.

1. Dooi luminescentie reagens in een 22 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
2. Meng reagens door het inverteren van de fles om een ​​homogeen mengsel te verkrijgen.
3. Evenwicht een plaat van gezaaide cellen (uit stap1,5) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
4. Voeg 100 ul van luminescentie reagens aan elke well. Meng de inhoud op een orbitale schudder gedurende 2 min. Laat de plaat geïncubeerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Het opzetten van een luminescentie experiment met behulp van de multi-mode plaat reader software.
   1. Schakel de multi-mode plaat lezer en de software te openen. In de 'task manager', selecteer 'experimenten' en 'maak new'.Select' file 'van de kant van de werkbalk, en onder' protocol 'tab, selecteer' procedure '.
   2. Selecteer 'Grenier 96 platte bodem' plaattype, en vink het vakje "gebruik deksel '. Selecteer 'lezen' actie in het kader box 'te lezen methode'. Selecteer 'luminescentie' detectiemethode. Klik op 'OK'.
   3. In het lezen stap selecteert u de putten onder het tabblad 'volledige plaat' te scannen, en selecteer putten als blanco wells handelen.
   4. Stel het ingesteld op lege filter filter (bv stekker, Em: gat, spiegel: geen). Stel de winst voor135, met een integratie van 0,5 sec per waterput en een lees hoogte van 6,5 mm. Klik op 'OK' om de instellingen voor de luminescentie te lezen op te slaan.
6. Het uitvoeren van een Lichtgevende lezen
   1. Eject plaathouder door het selecteren van het tabblad 'instrument control' en klik op 'plaat out'.Place 96-well plaat op de plaat houder, zodat het deksel op. Sluit de plaathouder door te klikken op 'plaat' onder het tabblad 'instrument control'. Klik op 'nu' van werkbalk om lichtgevende lezen uit te voeren.
   2. Exporteren de relatieve lichtgevende eenheid (RLU) metingen van elk putje naar een spreadsheet voor verdere analyse.
7. Herhaal stappen 3.1-3.6 proliferatie registreren elke 24 uur tot 96 uur na het zaaien van cellen.

4. Vaststellen celgetal Met behulp van een Cell Imager

1. Het opzetten van een cell imaging experiment met behulp van de multi-mode cel imager software
   1. Schakel de multi-mode cel imager open the software.
   2. In de 'task manager', selecteert u het tabblad 'experimenten' en 'creëren new'.On de' file 'werkbalk, klik op' 'tab en open' protocol procedure 'tab.Select' ingestelde temperatuur 'actie. Stel incubator 'aan' en stel de temperatuur tot 37 ° C en laat 'voorverwarmen' voordat u verder gaat met de volgende stap box '. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
   3. Selecteer 'lezen' actie. Klik op 'image' detectiemethode, selecteer 'endpoint / kinetische' lezen type en optica 'filters' type. Klik op 'OK'.Click op' tab volledige plaat 'en kies putten op de plaat af te beelden. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
   4. Selecteer de 2.5X doelstelling van de daling onderaan opties 'doelstellingen'. Onder het tabblad 'kanalen', selecteert u twee kanalen: GFP 469, 525 en Bright Field. Controleer 'auto' exposure voor beide kanalen en selecteer de automatische belichting ook.
   5. Om te bepalen auto focusinstellingen, selecteer 'auto-focus' en klik op 'opties'. Voor de auto-focus opties, selecteert u de 'scannen en vervolgens autofocus' methode. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
   6. Stel de horizontale en verticale verplaatsing van het centrum van de put (pm) waardoor 0.Select meerdere beelden per putje in een 3 x 2 montage scannen met horizontale afstand (pm) = 2881 en verticale afstand (pm) = 2127. Klik op 'OK' om de procedure op te slaan.
      Opmerking: Zie tabel 2 voor lezen parameters.
2. Het uitvoeren van lezen Experiment op geselecteerde Plate
   1. Klik op het tabblad 'instrument control' en selecteer de 'plate out' function.Place 96-well plaat in plaat houder, zodat het deksel op. Onder de tab 'instrument control', selecteert u de 'plaat' functie. Selecteer 'lees nu' op het tabblad plaat. Herhaal lees elke 24 uur tot 96 uur na het zaaien.
3. Analyse van celtelling DeCell Imager Software.
   1. Om een ​​beeld te analyseren, klikt u op het tabblad 'gegevens' op de belichte plaat, selecteert u 'picture [GFP 469, 525 + Bright gebied]'. Dubbelklikken op een goed beeld gebracht.
   2. Klik op een geladen afbeelding. Selecteer 'analyseren' en selecteer een enkel beeld van de montage te analyseren. Klik op 'OK'.Check de' GFP 'enige kanaal, en stel de parameters zoals aangegeven in tabel 3. Klik op' START 'om de parameters van toepassing zijn op de afgebeelde cellen.
   3. Neem de celtelling masker geplaatst via afgebeeld cellen, die wordt gebruikt om het aantal cellen per beeld bepalen. Klik op deze instellingen 'wijzigingen toe te passen en te handhaven voor elke plaat belicht gedurende het experiment.
   4. Eenmaal terug in de belichte plaat, klikt u op de drop 'data' down menu en selecteer 'cell count'. Dit brengt het totale aantal cellen per putje te genereren.
   5. Exporteer alle gegevens naar een spreadsheet door te klikken op de tab 'export' voor verdere analyse of de celtellingen per putje.

Results

Verschillende methoden voor het meten van de proliferatie van gekweekte cellen, de cel proliferatie van MCF-7-Δ40p53 getransduceerde cellen te bestuderen werd vergeleken met de niet-getransduceerde MCF-7-LEGO borstkanker cellijn. De drie methoden werden vergeleken - de conventionele methode hemocytometer cellevensvatbaarheid luminescentie assay en cell imaging analyse- worden beschreven in de schema (figuur 1). Elke methode heeft voor- en nadelen nauwkeurig celtelling in...

Discussion

In dit protocol werden drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in gekweekte cellen onderzocht. Elke methode kon reproduceerbare en nauwkeurige metingen van celproliferatie dan 96 uur en de resultaten waren vergelijkbaar tussen elk van de geteste methoden (figuur 2 en 3). Zowel de luminescentie-gebaseerde test en cell imaging methode produceerde de meest robuuste resultaten tonen lineaire toename in celproliferatie na 96 uur (figuur 2b, c). Bovendi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5