Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen

Summary

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Abstract

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introduction

Het tumor suppressor gen p53, een essentiële regulator van een aantal cellulaire processen zoals celcyclus, apoptose en senescentie ^1. Het is verantwoordelijk voor genomische stabiliteit en is daarom cruciaal voor het handhaven van het evenwicht van celdood en celgroei. Mutaties in p53 komen vaak bij kanker en de belangrijkste oorzaak van p53 inactivering leidt tot ongecontroleerde celproliferatie kanker ^2. Interessant mutaties in p53 vertegenwoordigen slechts ongeveer 25% van de borstkankers ^3, wat suggereert dat andere mechanismen verantwoordelijk voor het verlies van p53 functie. De recent ontdekte p53 isovormen is aangetoond dat o....

Protocol

1. Voorbereiden Cellen voor verspreiding Analyses

Opmerking: Bereid de twee cellijnen op dezelfde wijze en zaad in dezelfde notatie voor elke methode te analyseren.

1. Kweek MCF-7-LEGO en MCF-7-cellen Δ40p53 ⁷ tot 75-80% samenvloeiing in T-75 ^cm2 weefselkweek kolven met behulp fenolrood vrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) , 200 mM L-glutamine, 2 ug / ml insuline en 1 ug / ml Puromycine bij 37 ° C met 5% _CO2. Behandel cellen in een steriele bioveiligheid kast klasse II.
   Opmerking: De hoeveelheid tijd die nodig is om de cellen groeien to....

Results

Verschillende methoden voor het meten van de proliferatie van gekweekte cellen, de cel proliferatie van MCF-7-Δ40p53 getransduceerde cellen te bestuderen werd vergeleken met de niet-getransduceerde MCF-7-LEGO borstkanker cellijn. De drie methoden werden vergeleken - de conventionele methode hemocytometer cellevensvatbaarheid luminescentie assay en cell imaging analyse- worden beschreven in de schema (figuur 1). Elke methode heeft voor- en nadelen nauwkeurig celtelling in.......

Discussion

In dit protocol werden drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in gekweekte cellen onderzocht. Elke methode kon reproduceerbare en nauwkeurige metingen van celproliferatie dan 96 uur en de resultaten waren vergelijkbaar tussen elk van de geteste methoden (figuur 2 en 3). Zowel de luminescentie-gebaseerde test en cell imaging methode produceerde de meest robuuste resultaten tonen lineaire toename in celproliferatie na 96 uur (figuur 2b, c). Bovendi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5