Ethiek Verklaring: De experimentele procedures werden goedgekeurd door het dier ethische commissie van de Southern Taiwan University of Science and Technology Laboratory Animal Center, National Science Council, Republic of China (Tainan, Taiwan).
1. De bouw van het loopwiel Structure
OPMERKING: Alle acryl moeten transparant zijn. Was de gedemonteerde wiel met water, vervolgens met alcohol om de rubberen band en acryl platen na elk gebruik schoon te vegen.
- Verkrijg een acryl loopwiel 55 cm in diameter en 15 cm breed zijn.
LET OP: Dit wiel is groter dan een traditionele loopwiel (diameter = 35 cm; width = 12 cm) (F igure 1A). - Met behulp van een mes, snijd een kwartcirkel opening in een zijde van het loopwiel om als een ingang en een uitgang en voor ratten (Figuur 1B). Leg een laag van hoge wrijving rubberen band aan de binnenzijde van de acrylic wiel (Figuur 1B).
- Plaats een ijzeren staaf met lagers van het loopwiel (Figuur 1B) aan te sluiten. Plaats twee acryl driehoekige kolommen aan weerszijden van het loopwiel op te treden als het draagframe (Figuur 1B).
- Bevestig een 1 mm dik halfronde, transparant acryl blad aan de buitenzijden van de twee driehoekige kolommen met behulp van schroeven. Gebruik dit blad aan de infraroodsensoren inzetten. Zorg ervoor dat de acryl platen zijn ongeveer 3 cm afstand van elke zijde van het loopwiel.
2. Het inzetten van de infraroodsensoren en definiëren van de effectieve uitoefening Area
LET OP: Houd rekening met de grootte loopwiel en de lengte rat in het ontwerp van een infrarood systeem. Een rat activeert slechts één sensor tegelijk. In dit experiment, ratten tussen 20 en 23 cm lang.
- Boor een gat in de acrylplaten elk 45 ° (arc interval = 21 cm), waarbij de afstandtussen twee gaten zijn ongeveer gelijk aan de lengte van een testrat. Maak de gaatjes even groot als de infraroodsensoren (Figuur 2A).
LET OP: Voor de traditionele MRWs, boor een gat elke 70 ° (arc interval = 21 cm, Figuur 2B). - Tijdens een experiment PRW handhaven de ratten in een evenwichtstoestand van die tussen 0 ° en 135 °.
OPMERKING: Dus dit gebied als de effectieve uitoefening definiëren, terwijl het uitzicht van alle andere afdelingen als ineffectief oefening gebieden. Voor traditionele MRWs Definieer de uitoefening gebied als deel tussen 0 ° tot 140 ° (figuur 2B).
3. Rijden met de Running Wheel
- Gebruik een borstelloze DC motor en een motor chauffeur om het loopwiel rijden.
- Mount een diameter van 10 cm rubberen schijf op de centrale as van de motor (Figuur 1B).
- Met behulp van de ijzeren frame en veren om de motor te ondersteunen, sluit u de rubberen schijf uitcentrale as van de motor naar de buitenzijde van het loopwiel.
LET OP: De veren moeten samenwerken met de schroeven om dynamische motor hoogte aanpassingen mogelijk te maken en om te voorkomen dat rubber schijf van wordt losgekoppeld van het loopwiel spoor als gevolg van losse veren. - Bedien de motor om de 10 cm diameter rubberen schijf met behulp van een microcontroller te rijden, en let op het wiel te draaien als gevolg van de wrijving tussen de rubber schijf en de landingsbaan van het wiel, het creëren van een gemotoriseerde loopwiel platform.
- Mount vier infraroodsensoren achtereenvolgens tussen 0 ° tot 135 ° (Figuur 2A).
Opmerking: Voor traditionele MRWs sensoren zet tussen 0 ° tot 140 ° (figuur 2B). - Sluit vier paren van infrarood sensoren gemonteerd in beide acrylbladen algemene pinnen van de microcontroller met behulp van single core kabels, waardoor een positionering loopwiel systeem vormen.
4. Het construeren van een Adaptive optrekop Kromme
- Drie dagen voor de aanvang van de officiële 3 week de training, trainen ratten door het handmatig bedienen van het loopwiel.
Opmerking: Het doel is om de ratten vertrouwd met de draaiende omgeving worden, en is te testen of elke rat kan verdragen draait op 20 m / min. - Tijdens de handbediende training, geleidelijk versnellen de rijsnelheid tot er een rat is niet in staat om gelijke tred te houden. Wanneer dit gebeurt, verlaag de snelheid tot de rat herwint een regelmatige lopen tempo, en dan geleidelijk de snelheid totdat de rat 20 m / min (stippellijnen in figuur 3) bereikt. De handleiding training omvat zeven ratten aan de opleiding curves te construeren.
- Met behulp van een numerieke vergelijking om de meetgegevens op Dag 3 van het handmatig testen passen Bereken het acceleratiecurven dichtst bij de handenarbeid (de kromme met cirkels, figuur 3). Fit vergelijking 1 tot ruwe gegevens, waarbij C ini = 8, C fin = 20 en τ = 30 vertegenwoordigt de beginsnelheid, de eindsnelheid en de tijdconstante, respectievelijk).
LET OP: Deze vergelijking past zich aan een rat lichamelijke conditie. Daarom wordt verwezen naar de berekende curve als een adaptieve acceleratie-training model.
(1) - Gebruik Vergelijking 1 voor Week 1 van de formele opleiding.
- Weken 2 en 3 van de training, de parameters van vergelijking 1 passen, dat wil zeggen, een verandering 12-22, zodat de snelheid 30 m / min bereikt.
5. Beheersing van het Softwareprogramma
OPMERKING: Uitsluitend ontwikkelen van een code voor de microcontroller motorbedrijf en signaaloverdracht van de infraroodsensoren op een computer voor latere gegevensanalyse.
- Gebruik C programmeertaal om een software-besturingsprogramma met één hoofdprogramma en twee interrupt service routines voor de timer in te schrijvende microcontroller 18.
- Zorg ervoor dat het hoofdprogramma geïnitialiseerd register van de microcontroller en construeert een adaptief versnellingskromme model in het geheugen van de microcontroller.
- Gebruik de interrupt-service routine van Timer 0 tot het adaptieve versnelling curve te activeren en de gehele training duur te berekenen.
- Gebruik de interrupt-service routine van Timer 1 om het signaal gegevens te extraheren uit de infrarood-sensoren en om de gegevens over te brengen naar de computer.
- Met het hoofdprogramma van de positie van 0 o om de snelheid van loopwiel passen opnemen.
- Zodra de ontvangende infraroodsensor bij 0 ° wordt geactiveerd, interpreteren als een daling incidentie, die wordt opgebouwd door het hoofdprogramma. Op het moment dat het optreden tijden van de val incidenten raakt de drempel van 10% van het nummer van de rat positie detecties, deaccelerate het loopwiel automatisch als een veiligheidsmaatregel voor getrainde ratten. LET OP: De snelheid of loopwiel wordt verlaagd totdat de rat kan terugkeren naar de veilige zone (0 o tot 135 o) en handhaven van een stabiele lopende staat voor de veiligheidsmaatregel.
6. Bediening van de Positioning System loopwiel
- Schakel de microcontroller en wachten op een operator om druk op de knop om elke week de training model te beginnen.
- Druk op de knop "Start" om de training te beginnen model voor Week 1.
OPMERKING: De motor versnelt automatisch op basis van de adaptieve versnellingscurve totdat zij tot 20 m / min en automatisch stopt na 30 min. - Druk op de knop "Start" om de training te beginnen model voor Week 2.
LET OP: De motor accelereert automatisch op basis van de adaptieve versnelling curve totdat het 30 m / min bereikt, en stopt automatisch na 30 min. - Druk op de knop "Start" om de training te beginnen model voor Week 3.
LET OP: De motor automatisch Accelerates gebaseerd op de adaptieve versnelling curve totdat het 30 m / min bereikt, en stopt automatisch na 60 min.
OPMERKING: Gedurende de gehele opleiding proces, door te geven het signaal gegevens ontvangen van de infrarood sensoren op een computer draadloos.
- Met behulp van een computer, het analyseren van de locatiegegevens om een effectieve oefening maatregel te krijgen voor de hele oefening proces (
). Zie Vergelijking 2.
(2)
LET OP: EEE, EED en IED vertegenwoordigen de effectieve uitoefening maatregel, de effectieve en ineffectieve trainingsduur, respectievelijk.
7. Het trainen van de Ratten
- Willekeurig verdelen volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten in vijf groepen (n = 9 voor elke groep): de sham, control, tredmolen, MRW en PRW groepen.
- Voer een 3 week trainingsprogramma voor de drie oefening groepen, dat wil zeggen de treadmill, MRW en PRW groepen, maar niet voor de sham en de controlegroepen.
LET OP: De 3 week trainingsprogramma voor elke oefening groep is 20 m / min gedurende 30 minuten tijdens de week 1, 30 m / min gedurende 30 minuten tijdens de Week 2 en 30 m / min gedurende 60 minuten tijdens de Week 3.
8. Animal and Stroke Model
- Zoals vermeld in Sec. 7,1, willekeurig verdelen alle betrokken volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht tussen 250-280 g in 5 groepen.
- Weeg alle dieren om te zorgen voor nauwkeurige dosering drug berekeningen. Verdoven de ratten met natriumpentobarbital (25 mg / kg, intraperitoneaal [ip]) en een mengsel dat ketamine (4,4 mg / kg, intramusculair [im]), atropine (0,02633 mg / kg, [im]) en xylazine (6,77 mg / kg, [im]).
- Beoordeel de narcose diepte door het bewaken van de ademhaling (normaal 70-115 ademhalingen / min), ritme, de diepte van de ademhaling, slijmvliezen kleur en regelmatig testen van reflexen, bijvoorbeeld teen knijpen, staart knijpen, ooglid / wimperen palpebrale.
- Invoegen temperatuursondes in het rectum te houden en de rectale temperaturen tussen 37-37,5 ° C gebruik makend van afzonderlijke verwarmingslampen.
- Induceren focale ischemie, voorbijgaande middelste cerebrale slagader occlusie (MCAo) door het invoegen van een gloeidraad in de interne halsslagader om de opening van de middelste cerebrale slagader via externe halsslagader benadering 19 af te sluiten.
- Voer dezelfde operationele procedures op de schijn-geopereerde dieren, terwijl niet een filament te voegen in de interne halsslagader. Handhaving van focale cerebrale ischemie gedurende 1 uur, verwijder de gloeidraad, sluit de incisie, en dan laat 1 cm van de nylon hechtdraad uitsteekt, die zouden kunnen worden ingetrokken reperfusie mogelijk te maken.
- Dien subcutane (sc) injectie van een analgeticum (buprenorfine (0,05 mg / kg, sc)), in de dieren analgesie tweemaal daags gedurende 3 dagen.
9. Het beoordelen van Neural Damage
- EvalUate neurologische en motorische functies, respectievelijk door de neurologische ernst score (mNSS) 20 en een hellend vlak-test 21.
OPMERKING: mNSS is een samenstelling van de motor (spier status abnormale beweging), sensorische (visuele, tactiele en proprioceptieve) en reflextesten. Geef een punt voor het niet uitvoeren van een taak. Beoordeel neurologische functie op een schaal van 0-18 (normale score = 0; maximale tekort score = 18). - Beoordelen alle ratten qua prestaties behavioral de dag vóór en dag gedurende een periode van 7 dagen na de operatie.
- Meet de achterste ledematen grijpkracht van de rat met behulp van een hellend vlak.
- Plaats ratten op de hellende klimtoestellen dagelijks en acclimatiseren de ratten van de apparatuur en de testcondities 1 week voor het testen.
- Plaats elke rat op de inrichting en de rat stimuleren het platform beklimmen tot de bovenkant van het apparaat tijdens de gewenningsperiode.
- Plaats de rat opde top van de inrichting met het hoofd naar beneden tijdens de test. Controleer of de lichaamsas van de rat blijft langs een 20 x 20 cm 2 rubber geribbeld oppervlak op het hellend vlak vanaf een hoek van 25 °.
- Verhoog de hoek dynamisch met een kogelschroef verbonden met een stappenmotor om de maximale hoek waarbij een dier op het vlak vast kon houden. Verhoog de hoek van het hellend vlak geleidelijk totdat de muis niet te houden op het hellend vlak, en vervolgens op te sporen een naar beneden glijden evenement. De basislijn mate van hellend vlak is 25 ° in het begin.
- Vraag twee waarnemers (niet op de hoogte van welke behandeling de ratten hadden gekregen), om zelfstandig te onderzoeken en scoren alle gedragstesten, dat wil zeggen het gemiddelde van de linker- en rechterzijde maximale hoeken.
- Opoffering alle dieren op dag 7 na MCAo. Perfuseren de harten van de dieren onder diepe narcose (natriumpentobarbital 100 mg / kg, ip) met een zoutoplossing 22 . Verwijder en dompel het hersenweefsel in koude zoutoplossing 5 min, dat vervolgens wordt gesneden in 2,0 mm coronale secties met een tissue slicer 22.
- Dompel de verse hersencoupes in 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) bij 37 ° C gedurende 30 min, vervolgens over de plakjes 5% formaldehyde oplossing fixatie bij 4 ° C gedurende 24 uur. Plaats de gekleurde hersenen plakken op een plexiglas houder.
- Fotografeer de TTC-gekleurde plakjes met een schaalverdeling met behulp van een CCD-camera gekoppeld aan een personal computer geladen met beeldbewerkingssoftware. Gebruik een semi-automatische beeldanalyse systeem, alsmede aan het infarct gebied (mm 2) van elke TTC-gekleurde hersenen slice 23 te schatten.
- Bereken de totale infarctvolume voor elke plak uit de som van geïnfarceerd oppervlakken van alle hersenplakjes. Markeer het gebied ongekleurd (ischemische hersenen) afzonderlijk op elke zijde van 2 mm dikke plakken, dan berekent het infarct volume en de gemiddelde waarde.
- Calculaat het gecorrigeerde infarct volume (CIV) als
CIV = {LT- (RT-RI)}
d (3)
OPMERKING: Indien LT en RT duiden de gebieden van de linker en rechter hemisferen in mm 2 respectievelijk RI is het infarctgebied in mm 2 en d = 2 mm is de plakdikte.