Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Samenvatting

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Samenvatting

Thymus selectie verloopt in een unieke en zeer georganiseerde thymus micromilieu resulteert in de vorming van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire. In vitro modellen voor T lineage betrokkenheid en ontwikkeling te bestuderen hebben waardevolle inzichten in dit proces. Maar deze systemen niet de volledige driedimensionale thymus milieu noodzakelijk voor T cel ontwikkeling en derhalve onvolledig benaderingen van in vivo thymus selectie. Enkele problemen met betrekking tot modellering T cel ontwikkeling kan worden overwonnen door in situ modellen die een intact micro thymus die volledig achter de thymus ontwikkelen winkelwagentje T cellen. Thymus slice organotypische culturen aanvulling op bestaande in-situ technieken. Thymus segmenten de integriteit van de thymus corticale en medullaire gebieden en een platform voor de ontwikkeling van overlay thymocyten van een bepaald ontwikkelingsstadium of endogene Tc bestuderenells binnen een volwassen thymus micromilieu. Gezien de mogelijkheid om ~ 20 sneetjes per muis genereren, thymus plakjes presenteren een uniek voordeel in termen van schaalbaarheid voor high throughput experimenten. Verder is de relatieve gemak bij het genereren thymus plakjes en potentieel verschillende subsets thymus en andere celpopulaties overlappen van verschillende genetische achtergronden vergroot de veelzijdigheid van deze methode. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van de thymus plakjes, isolatie en bekleding van thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse. Dit systeem kan ook worden aangepast om onconventionele T cel ontwikkeling te bestuderen en thymocyten migratie thymocyt-stromale cel interacties en TCR signalen geassocieerd met thymus selectie door twee-foton microscopie te visualiseren.

Inleiding

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire ^1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) ^2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T _reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC ^2,4. Onrijpe CD4 ⁺ CD8 ⁺ dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 ⁺ cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 ⁺ helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen ^1-3.

Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk ^5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio's waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden ^10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie ^11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten ^13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen ^15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio's, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie.

Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld ^17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling ^23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu.

Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen ^18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T cellen na verloop van tijd in cultuur ^18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis.

Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio's en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie ^11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche ^34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.

Protocol

Protocollen voor alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care Comite op het Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. Oogsten Muis Thymus voor de bereiding van de thymus Slices en Single Cell Schorsingen

1. Euthanaseren de muis met CO ₂ gevolgd door cervicale dislocatie.
2. In een laminaire stroming kap, speld de muis buikzijde tot een dissectie board. Spuit de muis met 70% ethanol. Verwijder overtollig alcohol door deppen met een gaasje om te voorkomen dat ethanol uit het invoeren van de borstholte en schade aan het weefsel.
3. Til de huid aan de basis van het borstbeen met een pincet en een snede door de huid. Verleng de snit van de huid naar boven aan elke voorpoot.
4. Een aanvullend snede aan de onderkant van het borstbeen met het membraan scheiden van de ribbenkast. Snijd vervolgens elke zijde van de ribbenkast naar het sleutelbeen. Flip de ribbenkast over de richting van het hoofd waardoor de borstholte. De twee lobben vande thymus liggen boven het hart.
5. Verwijder het bindweefsel rond de thymus lobben behulp van een tang, micro-dissectie schaar en / of scherp gebogen schaar. Gebruik een paar fijne tip gebogen tang om de individuele lobben tillen van onderaf of via de resterende bindweefsel.
   Opmerking: Raak de thymus niet direct te begrijpen.
6. Plaats de thymus lobben in een 15 ml conische buis met PBS en zet apart op ijs totdat het nodig is.

2. Agarose Embedding en Vibratome snijden van thymus Lobes

1. Bereid 4% agarose-oplossing voor het inbedden door het oplossen van 2 g laag-smeltpunt agarose in 50 ml steriele PBS en de magnetron op een lage stand totdat de agar volledig is opgelost. Bedek kolf met aluminiumfolie en in een waterbad van 55 ° C tot aan gebruik.
2. In een weefselkweek kap bereiden compleet RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum bevat (FBS), 4 mM L- glutamine, 1 x penicilline / streptomycine, en 10 uM2-mercaptoethanol.
3. Voeg 1,5 ml compleet RPMI-1640 media per goed op een 6-well celkweek plaat en plaats een celkweek insert in elk putje. Stel de plaat opzij in een incubator bij 37 ° C totdat het nodig is.
4. Bereid een slushy ijswater bad met water en ijs in een ijsemmer.
5. Verwijder voorzichtig alle resterende bindweefsel rond elk thymus kwab met behulp van fijne tip pincet. Doe dit terwijl de thymus kwab is ondergedompeld in PBS in een weefselkweek schotel, na de overdracht op een tissue doekje doordrenkt met PBS, of onder een dissectie microscoop.
6. Laat de agarose afkoelen onder 40 ° C, wanneer de kolf net handwarm, zodat oververhitting van het weefsel. Giet de afgekoelde 4% agarose in een weefsel matrijs tot een hoogte van 1 cm ~.
7. Gebruik een pincet de thymus kwab zorgvuldig overdragen aan een weefsel wipe en rol voorzichtig te drogen zonder beschadiging van het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel droogt volledig of het zal tijdens het snijden uit de agarose schuift.
8. Schuif de nok in de agarose en plaats deze horizontaal (aan oppervlak van elk segment te verhogen) of verticaal (om het aantal segmenten te verhogen) aan de bodem van de vorm. Plaats de vorm in ijswater gedurende 5-10 minuten om de agarose te stollen.
9. Gedurende deze tijd, bereidt de vibratome voor het snijden door het monteren van de bufferbak, assembleren de objectplaatje en plaatsen van de vibratome mes. Leg een stuk tape laboratorium op het monster disc. Steriliseer de schone, geassembleerd werkruimte met 70% ethanol.
10. Zodra de agarose stolt, draai de mal en druk voorzichtig in het midden van de agarose ingebedde kwab vrij te geven.
11. Gebruik een scherp mes om het overtollige agarose rondom de lob verlaten ~ 2 mm van agarose aan weerszijden en trim ~ 0,5 cm aan de onderzijde.
12. Beveiligde elk agarose blok met een druppel weefsellijm het stuk tape op het objectplaatje. Meerdere blokken worden gelijmd op de band.
13. Lijn de vibratome mes with bovenkant agarose blok. Vul het buffer lade met steriel PBS tot het mes en agarose blok (s) volledig worden ondergedompeld.
14. Gedeelte agarose ingebed weefsel plakjes te verkrijgen met een dikte van 400-500 urn. Zet de vibratome tot 0,225 mm / sec snelheid, 100 Hz, en 5 °.
15. Gebruik een gebogen spatel om de thymus plakjes verzamelen in een weefselkweek plaat met steriel PBS als ze zijn gesneden. Gooi de eerste en de laatste slice.
16. Onderzoek de plakken onder een lichtmicroscoop op 4x vergroting. Kies de plakken met intacte thymus weefsel en de omringende agarose (figuur 1A).
17. Breng de plakjes op de plaat in stap 2.3 bereid door met een pipet tip om schuif de thymus slice uit de gebogen spatel op de celkweek insert. Elke insert is geschikt voor ~ 3 plakjes. Controleer de segmenten elkaar niet of celkweek insert wanden raken.
18. Handhaving van de plaat bij 37 ° C totdat het nodig is.

3. Voorbereiding van de Thymocyten voor overlay

1. Isoleer thymus lobben zoals in hoofdstuk 1. Distantiëren de lobben handmatig een enkele celsuspensie met een gesteriliseerde 15 ml weefselmaler gevuld met 5 ml steriel PBS dat 2% FBS maken. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml conische buis.
2. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x ACK lysis buffer (0,15 M _NH4Cl, 10 mM _KHCO3, 0,1 mM _Na2 EDTA) bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om rode bloedcellen te lyseren.
3. De buis wordt tot 15 ml met PBS dat 2% FBS. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
4. Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS dat 2% FBS en cellen passeren door een 255 urn zeef.
5. Aantal cellen met een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de celpellet in PBS met 2% FBS bij een concentratie van 1 x 10 ⁷ cellen per ml.
6. Label de cellen met cellulaire kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) volgens de protocollen van de fabrikant wanneer geen thymocyten van muizen die congenic markers of genetisch gecodeerde fluorescente reporters te onderscheiden van segment endogene cellen.
7. Na de laatste wasbeurt van de gelabelde cellen, resuspendeer de cel pellet in volledige RPMI-1640 media bij 1-3 x 10 ⁶ cellen per 15 ul.

4. overlay Thymocyten op de thymus Slices

1. Gebruik een pipet om alle vloeistof rond de thymus schijfjes op de insert te zuigen.
   Let op: Wees voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de agarose. Wanneer de agarose is beschadigd, zal de overlay thymocyten niet hechten aan het oppervlak slice door verlies van oppervlaktespanning.
2. Zonder het segment met de pipet tip, overlay 15 ul van thymocyten bereid in hoofdstuk 3 op elke thymus slice.
3. Incubeer de plate bij 37 ° C gedurende 2 uur om de cellen te migreren naar de thymus plakjes.
4. Na 2 uur, spoel de thymus segmenten 3 maal met 1 ml PBS om overmaat overlay thymocyten die nog niet gemigreerd in het weefsel te verwijderen.
5. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de thymus schijfjes gereed zijn geoogst, kenmerkend 1-72 uur, afhankelijk van het experiment.

5. dissociatie van thymus Slices voor flowcytometrie

1. Bereid een microcentrifugebuis voor elk segment door toevoeging van 150 pl PBS met 2% FBS.
2. Voeg 1 ml PBS met 2% FBS aan de weefselkweek insert met de thymus plakjes en roer met een gebogen spatel om de plakken los te maken van het oppervlak van de celkweek insert.
3. Breng het segment van het inzetstuk aan de microcentrifugebuis met een gebogen spatel.
4. Handmatig verstoren de plak met behulp van een microcentrifugebuis monster stamper. Voeg 150 ul PBS die 2% FBS tot een eindvolume 300pl.
5. Filter de gedissocieerde weefsel door een 40 pm filter in een nieuwe microcentrifugebuis. De gefilterde cellen zijn klaar om te worden gekleurd voor flowcytometrische analyse ^40.
6. Filtercellen nogmaals alvorens ze op een flowcytometer zodat de agarose wordt verwijderd en gaat de stroom cytometer niet verstoppen.
7. Het verwerven van de cellen op een flowcytometer en analyseren van gegevens zoals eerder beschreven ^40.

Resultaten

Thymus plakjes ondersteuning analyse van de verschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling, zoals positieve en negatieve selectie. Voor een succesvolle experimenten, de kwaliteit van de thymus slice staat voorop. Daarom moet thymus plakjes worden onderzocht om de integriteit van de thymusweefsel waarborgen en dat de agarose rond de thymus slice intact (Figuur 1A). Oppervlaktespanning kan worden aangetast wanneer de agarose beschadiging veroorzaakt ee...

Discussie

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van thymus segmenten en representatieve resultaten efficiënte positieve en negatieve selectie overlay preselectie MHC klasse-I beperkte TCR transgene thymocyten door flowcytometrie. Dit systeem is gebruikt met soortgelijke succes positieve selectie van MHC klasse II beperkte CD4 ⁺ T-cellen van voorselectie DP thymocyten ³² ondersteunen, en in aanwezigheid van agonist antigeen negatieve selectie en thymus T _reg ontwikkeling ^{11,12, 36...}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12)	Polyciences	18986	22 mm x 22 mm vierkant, ingekort tot 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades	Personna	74-0002
Tissue Adhesive	3M	1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts	BD Falcon	353090	Van verschillende geteste merken, deze hielden de cellen het beste bovenop de plakjes
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 met L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Fetal Bovine Serum	Wisent	080-110	Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM	Wisent	609-065-EL
Penicilline/Streptomycine, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Forceps Inox Tip	Dumont	RS-5047	Fijne punt gebogen pincet, maat.17 x.10 mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090