Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

Samenvatting

Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.

Samenvatting

De studie van neuroplasticiteit en moleculaire veranderingen in aangeleerd gedrag schakelt uit de studie van hele hersenen van de studie van specifieke sets van dun verspreid geactiveerde neuronen genaamd neuronale ensembles bemiddelen geleerd associaties. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is onlangs geoptimaliseerd voor volwassen rat hersenweefsel en liet isolatie van geactiveerde neuronen met behulp van antilichamen tegen neuronale merker NeuN en Fos eiwit, een marker van sterk geactiveerd neuronen. Tot nu toe werden Fos expressie brengende neuronen en andere celtypen geïsoleerd uit vers weefsel, dat lange verwerking dagen en men liet zeer beperkt aantal hersenmonsters worden bepaald na langdurige en complexe gedragsprocedures meebrengt. Hier vonden we dat de rendementen van Fos expressie neuronen en Fos mRNA uit dorsale striatum waren vergelijkbaar tussen vers ontleed weefsel en weefsel bevroren bij -80 ° C gedurende 3-21 dagen. Daarnaast bevestigde we het fenotypevan de Neun-positieve en NeuN-negatieve gesorteerde cellen door het bepalen van genexpressie van neuronale (NeuN), astrocyten (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) en microgial (Iba1) markers, wat aangeeft dat ingevroren weefsel kan ook worden gebruikt voor FACS isoleren gliale celsoorten. Kortom, het is mogelijk te verzamelen, ontleden en vries hersenweefsel voor meerdere FACS sessies. Dit maximaliseert de hoeveelheid gegevens verkregen van waardevolle dierlijke patiënten die vaak ondergaan lange en ingewikkelde gedragsprocedures.

Inleiding

Tijdens het leren, dieren vormen associaties tussen complexe sets van zeer specifieke stimuli. Deze hoge-resolutie-informatie wordt gedacht te worden gecodeerd door wijzigingen binnen specifieke patronen van dun verspreid neuronen genaamd neuronale ensembles. Neuronale ensembles zijn onlangs geïdentificeerd door de inductie van onmiddellijk vroege genen (IEG 's), zoals Fos, Arc en Zif268 en hun eiwitproducten in neuronen die sterk in gedrag of cue exposure werden geactiveerd. Fos-expressie neuronen in het bijzonder is aangetoond dat oorzakelijke rol in context en cue-specifieke aangeleerd gedrag ^1-4. Aldus unieke moleculaire neuroadaptations binnen deze geactiveerde Fos expressie brengende neuronen top kandidaten voor de neurale mechanismen die coderen geleerd verenigingen gevormd tijdens normale en abnormale leren leerstoornissen, zoals verslaving en posttraumatische stressstoornis (PTSS) ^5.

fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) heeft onlangs toegestaan ​​analyse van unieke moleculaire neuroadaptations in Fos expressie neuronen. Flowcytometrie en celsortering werden ontwikkeld in 1960 ^6,7 cellen te karakteriseren en te isoleren op basis van hun lichtverstrooiing eigenschappen en immunofluorescentie en zijn lang gebruikt in immunologie en kankeronderzoek. Echter flowcytometrie en FACS vereist gedissocieerde losse cellen die moeilijk te verkrijgen uit volwassen hersenweefsel zijn. FACS werd eerst gebruikt voor het isoleren en analyseren van Green Fluorescent Protein (GFP) tot expressie brengen striatale neuronen van transgene muizen die geen antilichaam labeling ^8,9 vergde. We ontwikkelden een antilichaam gebaseerde FACS werkwijze ¹⁰ voor het isoleren en moleculaire veranderingen beoordelen Fos expressie brengende neuronen geactiveerd door drugs en ​​/ of aanwijzingen in wildtype dieren ^11-15. In deze werkwijze worden neuronen gelabeld met een antilichaam tegen het algemene neurale marker NeuN, terwijl sterk geactiveerd neuronenzijn gemerkt met een antilichaam tegen Fos. Hoewel onze eerste werkwijze vereist bundeling tot 10 ratten per monster voor vers weefsel, verdere wijziging van protocol toegestane FACS isolatie van Fos-expressie (qPCR) analyse van discrete hersengebieden neuronen en kwantitatieve polymerasekettingreactie vanaf één rat ^13-15 . In totaal werden unieke moleculaire veranderingen gevonden in Fos expressie neuronen geactiveerd tijdens een verscheidenheid aan context- en cue geactiveerd gedrag in de verslavingszorg onderzoek ^12,14,15.

Een groot logistiek probleem bij het uitvoeren van FACS op verse weefsel is dat het een hele dag aan het weefsel en proces FACS dissociëren. Bovendien kan slechts vier monsters per dag worden verwerkt. Dit betekent gewoonlijk dat slechts een hersengebied van elke hersenen mogelijk is en de resterende hersengebieden moeten worden weggegooid. Dit is een groot probleem voor de lage throughput gedrags-procedures, zoals self-administratie en uitsterven training dat een operatie en vele weken van intensieve training vereist. Verder lang en ingewikkeld gedragsprocedures op testdag bemoeilijkt FACS voeren op dezelfde dag. Het zou een aanzienlijk voordeel kunnen de hersenen bevriezen van de dieren direct na gedragstesten en daarna uit een of meer hersengebieden isoleren Fos expressie neuronen op verschillende tijdstippen van de keuze onderzoekers.

Hier laten we zien dat onze FACS protocol kan worden gebruikt voor Fos expressie neuronen (en andere celtypen) van verse of bevroren hersenweefsel isoleren. Als voorbeeld, geïsoleerde we Fos expressie neuronen van de rat striatum na een acuut methamphetamine injecties en van naïeve ratten zonder injecties (controle conditie). Dit kan echter FACS protocol worden gebruikt na elke gedragstherapie of farmacologische behandeling. Daaropvolgende qPCR analyse van onze monsters aangegeven dat de genexpressie van deze celtypen kon worden beoordeeld met SimiLAR efficiency van zowel verse als bevroren weefsel.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren ^16.

Opmerking: hieronder wordt lage bindingsaffiniteit centrifugebuizen Alle stappen die op ijs werden bewaard, tenzij anders vermeld.

1. Voorbereiding voor Tissue Collection

1. Stel de centrifuge 4 ^o C.
2. Fire polish een set van drie glazen Pasteurpipetten met afnemende diameters van ongeveer 1,3, 0,8 en 0,4 mm voor elk monster.
3. Bereid gelabelde 1,7 ml-buisjes met 1 ml koude buffer A en houd de buizen op ijs.
4. Bereid een ijs lade met de hersenen snijden matrix, spatels en glasplaten (of omgekeerd glas petrischaal) waarop de dissectie uit te voeren. Pre-chill twee of meer scheermesjes op de glasplaten en het gebruik tissues papier om alle instrumenten die de t raken drogenkwestie.
5. Ontdooi de enzymoplossing bij kamertemperatuur (KT) gedurende 30 minuten voor weefselverzameltoestel.

2. Tissue Collection en Dissection

1. Start de gedrags- of farmacologische behandeling 90 min voordat weefsel collectie.
   LET OP: Voor de hier getoonde resultaten, acute intraperitoneale injecties van 5 mg / kg methamfetamine op ratten in een nieuwe omgeving (test conditie) en naïeve ratten bewaard in hun kooien (controle conditie) werden uitgevoerd.
2. Verdoven van de rat door het te plaatsen in een glazen pot met exsiccator verzadigd isofluraan en onthoofden de rat 30 - 60 sec later met behulp van een guillotine.
   Gebruik een schaar om de huid en de spieren van het hoofd te verwijderen en bloot de schedel. Gebruik rongeurs aan de schedel te snijden en het openstellen van de foramen magnum en verwijder het achterste deel van de schedel. Gebruik rongeurs langs de bovenranden van de schedel te snijden naar de hersenen bloot. Zorg ervoor dat de hersenen niet beschadigt. Gebruik een kleine spatel om voorzichtig schep onder eend verheffen de hersenen. Verhoog de ​​hersenen en snijd de zenuwen, totdat de hersenen is gratis ^17.
3. Ontleden weefsel met behulp van scheermesjes.
   LET OP: Zorg voor weefselmonsters met een van de volgende manieren: (2.3.1) vers ontleed weefsel; (2.3.2) ingevroren weefsel na dissectie; of (2.3.3) ingevroren weefsel ontleed uit bevroren hele brein. Houd de hersenen snijden matrix, scheermesjes en glasplaat droog gedurende de dissectie en fijnhakken processen gecondenseerde water kan leiden tot hypotoon lyseren van de cellen. Gebruik een vergrootglas om nauwkeurige dissectie te waarborgen.
   1. Voor vers ontleed weefsel, plaatst de vers gewonnen hersenen in een brain slicing matrix (een rat brain-vormige metalen mal met sleuven voor de scheermesjes met tussenpozen 1 mm) die is gekoeld op ijs. Plaats twee of meer vooraf gekoelde scheermesjes in de groeven aan coronale plakjes dat hersengebied (s) van belang bevat snijden. Leg de gesneden slice op de gekoeld glas plaat.
      Let op: Ontleden de hersenen regions van de rente op een gekoeld glas plaat.
   2. Bevroren weefsel na sectie ontleden het hersengebied (s) plaats van segmenten van vers gewonnen hersenen, overeenkomstig aan die boven beschreven in 2.3.1. Plaats de ontleed weefsel in een microbuis en het weefsel snel bevriezen door onderdompeling in de microbuis -40 ° C voor 20 sec isopentaan. Houd ontleed weefsel bevroren te allen tijde in een -80 ° C vriezer tot verdere verwerking.
   3. Voor ingevroren weefsel, onmiddellijk te bevriezen de vers gewonnen hersenen bij -40 ºC isopentaan en op te slaan in een verzegelde zak bij -80 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
      1. Op de dag van dissectie, De bevroren hersenen in een cryostaat ingesteld op ongeveer -20 ° C (niet warmer dan -18 ° C) gedurende ongeveer 2 uur om de temperatuur evenwicht.
         OPMERKING: Hersenen kunnen gemakkelijk worden gesneden bij deze temperatuur, terwijl veel lagere temperaturen maakt de hersenen te bros veilig worden gesneden.
      2. Gebruik scheermesjes tot 1 cut - 2 mm coronale plakjesde bevroren hersenen in een cryostaat. Gebruik een stomp 12- tot 16-gauge naald om weefsel te stoten uit deze schijfjes onder het vriespunt voorwaarden is voldaan. Houd ontleed weefsel bevroren allen tijde tot verdere verwerking.
4. Voeg 1-2 druppels buffer A aan de ontleed weefsel te bedekken voordat hakken. Ontrekken veel witte stof van het weefsel met twee scheermesjes tot verlies van neuronen tijdens de rest van het proces te voorkomen trituratie. Als ab ingevroren weefsel, dan laat het weefsel te ontdooien op de koude glasplaat niet meer dan 1 minuut voordat Buffer A oplossing.
5. Gehakt het weefsel 100 keer in elke orthogonale richting met een scheermesje op een gekoelde glasplaat. Houd het scheermesje verticaal op de glasplaat bij het hakken.
   NB: Grondige hakken is van cruciaal belang voor alle protocol stappen.
6. Scheermesjes aan gehakt weefsel over in microcentrifuge buisjes die 1 ml koude buffer A. Inverteer de buis 3-5 keer Keep alle gehakt weefsel in de oplossing.

3. Cel Dissociatie

LET OP: Gebruik zacht uiteinde over uiteinde mengen alle volgende stappen. Gebruik geen vortex mixer en vermijd luchtbellen die celschade veroorzaken.

1. Centrifugeer de monsterbuizen bij 110 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Teruggooi supernatant. Voeg langzaam 1 ml koud vers ontdooid enzymoplossing (die een mix van proteolytische enzymen) door de binnenwand van de microbuis. Onmiddellijk zuigen de gehele pellet en voorzichtig pipet op en neer slechts 4 keer met een redelijk grote tip diameter pipet om het gehakt weefsel pellet verspreiden.
2. Inverteer de microbuizen onmiddellijk te voorkomen dat de pellet plakken aan de bodem en incubeer de monsters met eind-over-eind mengen gedurende 30 minuten bij 4 ^° C
3. Na enzymatische digestie weefsel Centrifugeer de buizen bij 960 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en voeg 0,6 ml koude buffer A. immediately na het toevoegen van de buffer A, maken gebruik van dezelfde pipet tip om de pellet te verspreiden door te zuigen de gehele pellet en voorzichtig pipet op en neer 5 keer.
4. Mechanisch vermaal het verteerde weefsel en verzamelen in 15 ml buizen met behulp van de volgende stappen. Voor elk monster, gebruik maken van een aparte set van 3-brand gepolijst glas Pasteur pipetten met aflopende diameters van gehecht aan latex bollen ongeveer 1,3, 0,8 en 0,4 mm.
   1. Zachtjes vermaal elk monster 10 maal met de 1,3 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs (het puin en gedissocieerde cellen zullen naar de bodem). Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml) en transfer naar een 15 ml conische buis (buis # 1).
   2. Voeg 0,6 ml Buffer Een oplossing van de overblijvende pellet. Vermaal het monster 10 maal met de 0,8 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs. Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml) en transfer naar dezelfde 15 ml conische buis # 1.
   3. Voeg 0,6 ml Buffer Een oplossing voor de resterende Pellet. Vermaal het monster 10 maal met de 0,4 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs. Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml, zonder het aanraken van de pellet met niet-gesplitste cellen) en over te dragen aan dezelfde 15 ml conische buis # 1.
      LET OP: Houd de diameter pipet 0,4 mm in de buis # 1 voor de volgende tritureren stappen.
   4. Herhaal stap 3.4.3 drie keer met de kleinste glazen pipet (~ 0,4 mm diameter) en verzamel de bovenstaande vloeistof in een afzonderlijke 15 ml conische buis (buis # 2).
   5. Vermaal de verzamelde celsuspensies in buizen # 1 en # 2 voor 10 keer met de 0,4 mm glazen pipet en op ijs bewaren.

4. Cell Fixatie en Permeabilisatie

1. Bereid 4 microbuisjes per monster (twee microbuisjes voor cellen van de buis # 1 en twee voor cellen van buis 2 #) door het toevoegen van 800 pi van 100% koude ethanol (bewaard bij -20 ^° C voor gebruik) in elke buis en houd ze op ijs . Opmerking: De laatste ethanolconcentratie 50% bedragen.
2. Pipetteer ~ 800 ul van de celsuspensies (van buis # 1 en # 2 tube) in elk van de 4 buizen met koude ethanol en keren de buizen naar de monsters te mengen.
3. Incubeer buizen op ijs gedurende 15 minuten terwijl het omkeren van de buizen elke 5 min.
4. Na fixatie / permeabilisatie, centrifuge de buizen bij 1.700 xg gedurende 4 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant. Reactie 50 pi oplossing van celverlies voorkomen.
   OPMERKING: De korrels in dit stadium zijn wit en plak minder aan de wand van de buizen dan voorheen permeabilisatie. Daarom is de bovenstaande vloeistof voorzichtig door de wand van de microbuis te raken waar er geen pellet en het opstellen van de bovenstaande langzaam met behulp van een micropipet.

5. Cell Filtration

1. Resuspendeer de pellets uit stap 4.4 met koude PBS als volgt:
   1. Voeg 550 ul koud PBS tot een van de twee microbuisjes uit buis # 1 en gebruik een redelijk grote diameter piPette tip om voorzichtig pipet de celsuspensie op en neer 5 keer. Herhaal hetzelfde voor één Microbuis afkomstig van de buis # 2.
   2. Voor cellen van buis # 1 met dezelfde pipet eerste celsuspensie tweede pellet. Resuspendeer de tweede pellet door voorzichtig pipetteren de gecombineerde celsuspensie op en neer 5 keer.
   3. Voor cellen van buis # 2, resuspendeer en voeg de pellets (dat wil zeggen, derde en vierde microbuizen) zoals beschreven in 5.1.2.
2. Filtreer beide celsuspensies van stap 5.1.2 en 5.1.3 afzonderlijk met twee verschillende paren cellen zeven (100 urn en 40 urn poriegrootte) als volgt:
   1. Pre-nat elke cel zeef door toevoeging van PBS aan de binnenkant van de zeef. Gebruik een pipet om de overmaat PBS vanaf de buitenzijde van de zeef te verwijderen.
   2. Pipetteer de celsuspensie uit stap 5.1.2 gelijkmatig op de eerste cel zeef van 100 urn poriegrootte. Verzamel de doorstroming in een 50 ml buis op ijs. Gebruik de piPette de flow verzamelen via bevestigd aan de buitenzijde van de onderste cel zeef.
   3. Gebruik dezelfde pipet om de doorstroom te brengen van de cel 100 urn zeef om de 40 urn cel zeef. Verzamelen deze doorstroming in een 50 ml buis op ijs. Wanneer door middel van het overbrengen van de doorstroming van 40 micrometer cel zeef, veranderen om nieuwe pipet tips om besmetting van 100 micrometer cel zeef voorkomen.
   4. Herhaal deze stappen voor de celsuspensie uit stap 5.1.3 met een nieuwe set filters.
3. Combineer de twee doorstroom van elk monster voor een eindvolume van ongeveer 1 ml per monster.

6. Incubatie met Antilichamen

LET OP: Gebruik maken van kleine hoeveelheden van de hersenen celsuspensies om meerdere controlemonsters voor te bereiden voor het instellen van de juiste flowcytometer instellingen voorafgaand aan het uitvoeren van de belangrijkste monster. Voor elk antilichaam labeling, voorbereiden controlemonsters die geen antistoffen, maar de se omvattencondary antilichaam (of ander fluorescerend label), en dan zowel de primaire en secundaire antilichamen (of andere fluorescerend label). Met deze bedieningselementen de poorten die specifieke versus niet-specifieke labeling in de flowcytometer scheiden ingesteld. Gebruik indien mogelijk fluorochromen die geen compensatie niet verplicht is. Verhoog het eindvolume van de gating controlemonsters een eindvolume van 700 pl door toevoeging van PBS voorafgaand aan het toevoegen van de primaire antilichamen.

1. Bereid lichtverstrooiing en DAPI controlemonster door de overdracht van een 100 pi monster van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koude PBS met 1 ug / ml DAPI kleuring van kernen. Incubeer gedurende 10 min met een end-over-end mengen, en was (zoals aangegeven in de stappen 6.4.2 tot 6.4.5) alvorens door de flowcytometer.
   LET OP: Dit monster wordt alleen gebruikt om de cel / kernen gate voorafgaand aan het sorteren van de resterende cellen in de FACS apparaat instellen.
2. Bereid enkele controlemonsters immunolabeled door de overdracht van 100 & #181, l van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koud PBS met een antilichaam (bijvoorbeeld antilichaam NeuN). Voeg 600 ul koud PBS tot een microbuis met een ander antilichaam (bv Fos antilichaam). Voeg de overeenkomstige secundaire antilichaam als het niet direct geconjugeerd primair antilichaam.
   Opmerking: Deze monsters worden gebruikt om de juiste fotomultiplicatorbuis (PMT) spanning bepalen, en de overlap van de twee fluorescentiesignalen beoordelen indien nodig. Antilichaamconcentraties worden getitreerd om de beste signaal-ruisverhouding in alle kanalen bereiken. Overlappende fluorescentiesignalen kunnen worden gecompenseerd door interne ijking van verschillende fluorescentie kanalen in de flowcytometer.
3. Bereid double fluorescent gelabelde negatieve controlemonster door overdracht 100 ul van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koud PBS met de secundaire antilichamen alleen of IgG direct geconjugeerde primaire antilichamen.
   LET OP: This controle monster kan worden gebruikt elke keer vóór sortering om de achtergrond fluorescentie voor elke fluorofoor te bepalen.
4. Bereid belangrijkste monster worden opgelost.
   1. Transfer 700 ul van de gefiltreerde cellen in een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 7 pl (1: 100) van primair Fos antilichaam direct geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) en 1,4 pl (1: 500) van primair NeuN antilichaam direct geconjugeerd aan fycoerytrine (anti-NeuN-PE). Incubeer buizen gedurende 30 minuten bij 4 ° C met eind-over-eind mengen.
   2. Aan het einde van de incubatie, voeg 800 ul koud PBS aan elke microbuis, waaronder hoofdmonster en controlemonsters en meng door inversie.
   3. Centrifuge microbuisjes op 1.300 g gedurende 3 minuten bij 4 ºC. Verwijder het supernatant, waardoor 50 gl supernatant celverlies voorkomen.
   4. Voeg 1 ml koude PBS voor de pellet en resuspendeer cellen met een pipet met een redelijk grote tip diameter.
   5. Centrifugeer bij 1300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Discard het supernatant.
   6. Resuspendeer de pellet in 500 ul koud PBS (eindvolume passen afhankelijk van de grootte van het pellet).
   7. Overdracht en filteren de suspensie in een ronde bodem FACS monster buis met een cel zeef dop (40 pm). Houd de immunolabeled cellen op ijs en onmiddellijk uit te voeren FACS. Opmerking: Voor het filteren, raakt u de pipet tip verticaal op de zeef dop en duw de celsuspensie doorheen.
5. Stel flowcytometer poorten met behulp van controlemonsters.
   1. Gebruik de lichtverstrooiende en DAPI controlemonster om de neuronale celpopulatie te identificeren van de totale gebeurtenissen en celresten.
      LET OP: Cel lichamen in dit preparaat zijn slechts 1-2% van de totale gebeurtenissen (de rest zijn puin en gebroken cellulaire processen). Gebaseerd op DAPI fluorescentiesignaal (aangeeft kernen) en voorwaartse verstrooiing (grootte van de cel) is het mogelijk om cellichamen en poort achteren basis van de voorwaartse en zijwaartse lokaliseren lichtverstrooiende eigenschappen vande cellen (zoals getoond in figuur 1 A, B).
   2. Gebruik de enkele controlemonsters immunolabeled naar het PMT voltage instellingen bepalen, en spillover van de emissie te analyseren vanuit één specifieke fluorochroom in een ander filter / kanaal (bijv Alexa Fluor 488 / FITC of Phycoerythrine). Als fluorescerende signalen overlappen, corrigeer de overlap door het handmatig aanpassen van de vergoeding niveaus.
   3. Gebruik de dubbele fluorescent-gelabelde negatieve controle voor het opzetten van de drempel voor de positieve populatie.
      Opmerking: Het signaal afkomstig van dit monster wordt gedacht veroorzaakt door auto-fluorescentie en de cellen van het hoofdmonster boven deze drempel ligt kan als positief worden beschouwd. Typisch is de drempel voor het classificeren strenger en ongeveer boven 2/3 van de gemerkte cellen boven de negatieve controle daadwerkelijk gesorteerd.
6. Sorteer de neuronen van de belangrijkste monster door FACS in 1,7 ml microbuisjes. Verzamel de cellen in 50 ui RNAextractiebuffer. Na het sorteren vortex en centrifugeer de buis en meng de suspensie door en neer te pipetteren 10 maal alle gesorteerde cellen herstellen van de wanden van de buis.
7. Incubeer de gesorteerde celsuspensie bij 42 ° C gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat alle cellen voorafgaand aan RNA-extractie worden gelyseerd en centrifugeer bij 2800 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
8. Breng de bovenstaande vloeistof over in een RNase-vrije buis voor langdurige opslag bij -80 ° C of onmiddellijk verwerken monster voor RNA-isolatie, cDNA synthese doelgen pre-amplificatie en qPCR, zoals eerder ^13-15 beschreven.

Resultaten

Sorteren van Fos-positieve en Fos-negatieve neuronen van verse en diepgevroren dorsale striatum weefsel van enkele ratten na acute methamphetamine injecties.

Het hierboven beschreven protocol werd gebruikt voor Fos-positieve en negatieve Fos-neuronen van een rat dorsale striatum 90 min direct na een intraperitoneale injectie van methamfetamine (5 mg / kg). Naïeve ratten in hun kooien werden gebruikt als controles. Dorsale hetz...

Discussie

FACS kan worden gebruikt om neuronen en andere celtypen uit verse of ingevroren volwassen hersenweefsel sorteren. Zoals vermeld in de inleiding, de mogelijkheid om bevroren weefsel te gebruiken maakt optimaal gebruik van monsters van dieren die complexe en langdurige gedrags- procedures, zoals zelf-administratie en terugval studies in de verslavingszorg onderzoek hebben ondergaan. Deze gedrags-procedures duurt meestal 1-2 uur of langer, en vereisen dat alle dieren (10 - 20 in totaal) worden getest op dezelfde dag ^1...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Brain matrix	CellPoint Scientific	69-2160-1	om coronale hersensnedes te verkrijgen
Hibernate A low fluorescence	Brain Bits	HA-lf	Buffer A in het protocol wordt gebruikt voor het verwerken van weefsel en cellen van de dissociatie tot fixatie stappen
Accutase	Millipore	SCR005	Enzymoplossing in het protocol wordt gebruikt voor enzymatische vertering van weefsel voorafgaand aan trituratie
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	om celverlies tijdens het protocol te voorkomen
Cell Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340	om celsuspensie te filteren
Cell Strainer, 100 µm	BD Falcon	352360	om celsuspensie te filteren
Falcon 5 ml ronde bodem polystyreen testbuis met celfilter snap cap	BD Bioscience	352235	om celsuspensie te filteren voordat deze door de flow cytometer gaat
Pasteur Pipet, Glass	NIH supply	6640-00-782-6008	om weefsel te tritureren
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (muis monoklonaal) antilichaam	EMD Millipore	FCMAB317PE	antilichaam om neuronen te detecteren
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Cell Signaling Technology	8677	antilichaam om Fos-expresserende cellen te detecteren
DAPI	Sigma	D8417	om kernen te labelen
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	Het kit bevat de RNA extractie buffer voor stap 6.14. Het wordt gebruikt om gesorteerd cellen te verzamelen
Superscript III first strand cDNA synthesis system	Invitrogen	18080-051	om cDNA te synthetiseren uit RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	om gerichte-preamplificatie van cDNA te doen
TaqMan Advance Fast Master	Applied Biosystems.	4444963	om PCR te doen met TaqMan sondes
Fos TaqMan sonde	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan sonde/primers
NeuN TaqMan sonde	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	nucleotidesequentie voor neuronaal gen marker
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	nucleotidesequentie voor neuronaal gen marker
NeuN Reverse primer	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	nucleotidesequentie voor neuronaal gen marker
Gfap TaqMan sonde	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	TaqMan sonde/primers voor astrocytic gen marker
iba-1 TaqMan sonde	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	TaqMan sonde/primers voor microglia gen marker
Gapdh TaqMan sonde	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	nucleotidesequentie voor referentie/huishoudelijke gen
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	nucleotidesequentie voor referentie/huishoudelijke gen
Gapdh Reverse primer	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	nucleotidesequentie voor referentie/huishoudelijke gen
Oligo2 TaqMan sonde	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	TaqMan sonde/primers voor oligodendrocytisch gen marker
P1000 pipettor	Rainin	17014382	Het wordt aangeduid als de pipet met een grote tip diameter in stappen 3.1 en 3.3 voor milde weefsel trituratie en stap 6.7 om cellen te resuspenderen
7500 Fast Real-time PCR system	Applied Biosystems.	446985	voor kwantitatieve PCR
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		voor FACS sortering