Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

27 juli 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Samenvatting

Affiniteit zuivering benaderingen zijn succesvol in het isoleren van inheemse complexen voor proteomics karakterisering geweest. Structurele heterogeniteit en een mate van heterogeniteit samenstelling van een complex meestal niet belemmeren vooruitgang bij het uitvoeren van dergelijke studies. Daarentegen zou een complex bestemd voor structurele karakterisering worden gezuiverd in een staat die zowel qua samenstelling en structureel homogeen en bij een hogere concentratie dan vereist voor proteomics. Recent zijn er aanzienlijke vooruitgang bij de toepassing van elektronenmicroscopie voor structuurbepaling van grote macromoleculaire complexen zijn. Dit heeft interesse in benaderingen verhoogde inheemse complexen van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor structurele bepaling te zuiveren door elektronenmicroscopie. De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is geoptimaliseerd te extraheren en te zuiveren een 18-subunit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein assemblage uit gist (Saccharomyces cerevisiae)

Inleiding

Veel grote cellulaire processen worden uitgevoerd door grote eiwit en eiwit-RNA-complexen 1 uitgevoerd. Een belangrijk knelpunt te voeren biochemische en structurele studies van zulke complexen te verkrijgen van een geschikte kwaliteit (dwz homogeniteit) en bij een geschikte concentratie. Het isoleren van een complex van een natieve bron heeft vele voordelen, waaronder behoud relevante post-transcriptionele en / of translationele modificaties van subeenheden en verzekeren goede complex samenstel. Echter grote cellulaire complexen zijn vaak aanwezig in een cel op een klein aantal kopieën en de zuivering zeer efficiënt moeten zijn en optreden onder fysiologische omstandigheden omgeving te waarborgen complex behouden blijft. Zuiveren van een complex van een eukaryote bron is bijzonder uitdagend en financieel kan worden onbetaalbaar. Zo strategieën of methoden die efficiënt zijn en leveren een homogeen complex zijn zeer gewenst.

Een strategie die issuccesvol in het zuiveren van inheemse complexen van eukaryote cellen voor hun eerste karakterisering is de Tandem Affinity Purification (TAP) methode 2,3. TAP methode werd aanvankelijk ontwikkeld met een natief eiwit van gist (S. cerevisiae) zuiveren complex samenwerkende factor (en) 2. TAP methode gebruikt twee labels, elke tag gefuseerd in tandem om hetzelfde eiwit coderende gensequentie. De labels werden geselecteerd om een ​​behoefte voor kleine en selectieve binding aan een affiniteitshars met actieve handhaven dichtbij fysiologische oplossing in evenwicht te brengen. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Het genomisch opgenomen TAP tag aan het uiteinde (C-eindstandige) van een eiwit coderend gen en bestond uit een sequentie die codeert voor een calmoduline-bindend peptide (CBP), gevolgd door Proteïne A - toevoeging van iets meer dan 20 kDa gelabelde eiwit. CBP is kort, 26 aminozuren, en door de ~ 17 kDa eiwit calmoduline (CaM) in aanwezigheid van calcium met een Ko in de orde van 10 -9 M 4. De Proteïne A tag groter is, bestaande uit twee herhalingen van 58 residuen met een korte linker tussen de herhalingen. Elke 58 aminozuur herhaling is erkend door immunoglobuline G (IgG) met een K D ~ 10 -8 M 5. Tussen deze twee labels werd opgenomen een erkenning site voor TEV protease, een endopeptidase van de Tobacco Etch Virus 6,7. Zoals weergegeven in figuur 1, in de eerste affiniteit stap van de werkwijze de TAP gelabeld eiwit gebonden aan een IgG hars via de Proteïne A. De toegevoegde eiwit wordt geëlueerd door op de kolom splitsing na toevoeging van TEV protease, plaatsspecifiek splitsen tussen de twee labels. Dit is een noodzakelijke stap de interactie van IgG en proteïne A is zeer sterk en kan alleen voldoende worden verstoord onder denaturerende oplossingsomstandigheden. Bij gebrek aan een Protein Een tag wordt het eiwit gebonden CaM hars in aanwezigheid van calcium en geëlueerd uit de hars met toevoeging van het metaalion chelerende EGTA (ethyleenglycol-azijnzuur) (figuur 1).

Kort na de invoering van de TAP methode werd in een grootschalig onderzoek gebruikt voor het genereren van een "kaart" van complexe interacties in S. 8 cerevisiae. Belangrijker, als gevolg van deze inspanningen een volledige gist-TAP Tagged open leeskader (ORF) bibliotheek en individuele TAP hebben ORFs 9 kunnen van een commerciële bron. Aldus kan men elke giststam met een gemerkt eiwit voor gist complex te verkrijgen. TAP methode spoorde ook wijzigingen of variaties van de TAP tag, zoals: het gebruik ervan voor de zuivering van complexen uit andere eukaryote evenals bacteriële cellen 10,11; het ontwerp van een "split tag", waarbij het ​​Proteïne A en CBP op verschillende eiwitten 12 worden geplaatst; en de tags veranderd, zodat de noodzaak van de onderzoeker accommoderen, zoals gevoeligheid van het complex Ca2 + of EGTA 13.

Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie en werkwijze hebben geleid tot significante vooruitgang in de toepassing van elektronenmicroscopie (EM) voor structuurbepaling, die hebben geleid tot een hoge, bij atomaire resolutie beelden van macromoleculaire complexen 14. De resolutie verkrijgen van een complex met EM blijft echter afhankelijk van de kwaliteit van het complex onder studie. Deze studie heeft de TAP tag aanpak te zuiveren van S. benut cerevisiae U1 snRNP, een 18-subeenheid (~ 0,8 MDa) laag kopieaantal ribonucleoproteïnecomplex die deel uitmaakt van de spliceosome 15,16. Een aantal maatregelen zijn genomen om dit complex zodanig dat het homogeen en voldoende concentratie zuiveren. Potentiële problemen in diverse stadia van de zuiveringswerkwijze zijn beschreven en strategieën genomen chall overwinnenEnges gemarkeerd. Door het zorgvuldig beoordelen en optimaliseren van stappen in de zuivering, de U1 snRNP gezuiverd is van een kwaliteit en tegen een hoeveelheid die geschikt zijn voor negatieve vlek en elektronenmicroscopie cryo-microscopie (cryo-EM) studies. Een geoptimaliseerde TAP methode protocol voor de zuivering van inheemse complexen voor structurele studies wordt hierin beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol werd ontwikkeld voor de zuivering van een complex van 4 liter celkweek ongeveer 40 g natgewicht van cellen. Na bereiding moeten alle buffers worden opgeslagen bij 4 ° C en binnen een maand na bereiding. Reductiemiddel en proteaseremmers worden alleen buffers juist voor gebruik.

1. Bereiding van Whole Cell Extract voor Tandem Affinity Purification

  1. Groei van S. cerevisiae Cells
    1. Streak de gewenste TAP tag S. cerevisiae stam uit opslag (-80 ° C) op een gist pepton dextrose (YPD) plaat. Incubeer gedurende 3-5 dagen (30 ° C), totdat gistcellen verschijnen wit en pluizig.
    2. Inoculeer een strook van ongeveer 2 mm 2 van de verse cellen van de plaat in 10 ml YPD medium in een 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis. Schud de buis bij 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende de nacht (30 m ° C).
    3. Inoculeren 2 ml van de meer dan's nachts cultuur per liter YPD medium in een 2 L Erlenmeyer of erlenmeyer. Schudden bij 180 rpm (30 ° C). Monitor celgroei bij een optische dichtheid van 600 nm (OD 600) tot late log-fase, OD 600 van 1,8 tot 2, gewoonlijk 20-24 uur.
  2. Oogsten S. cerevisiae Cells
    1. Oogst cellen door centrifugeren bij 5400 xg gedurende 15 minuten (4 ° C).
    2. Snel Decanteer het supernatant en houdt cellen bij 4 ° C of op ijs.
    3. In suspensie liter celpellet met 2 ml gekoeld Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM KCI, 0,2 mM EDTA, pH 8,0, 5 mM imidazol, pH 8,0; 10% glycerol; 0,1% v / v NP-40). Opschorten cellen door zwenken en / of herhaalde pipetteren met een 10 ml serologische pipet.
      Opmerking: Het belang van NP-40 als het gaat om complexe kwaliteit en nazuivering analyse wordt hieronder besproken.
    4. Breng de celsuspensie in een lege 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis kEPT op ijs. Was elke centrifugefles met een additionele 2 ml gekoelde Lysis Buffer en aan de celsuspensie in de 50 ml buis.
    5. Bepaal het natte gewicht van celpellet door weging van de buis af te trekken van het gewicht van de lege buis en de toegevoegde Lysis Buffer.
      Opmerking: Een liter celkweek met een OD 600 van 1,8 is ongeveer 10 gram.
    6. Maak een vloeibare stikstof bad in een 50 ml conische polypropyleen centrifugebuis. Trekken gesuspendeerde cellen in een 5 ml spuit. Sluit een 16 G naald op de spuit. Bevries de celsuspensie door het door de spuit / naald cell genereren "druppeltjes". Snelheid van bevriezing moet ongeveer 1 min / ml zijn.
    7. Bewaar bevroren cel druppeltjes (-80 ° C) of overgaan tot lysis.
  3. Lyseren van cellen en Lysate Verduidelijking
    1. Lyseren van de gistcellen met een koffiemolen. Lyse cellen acht tot negen keer met 25 sec slijpen uitbarstingen onder schudden de coffee molen. Voor gebruik pre-koel de koffiemolen met vloeibare stikstof. Elke twee rondes van slijpen, voeg een dun laagje vloeibare stikstof aan de molen en laten verdampen.
    2. Roer met een vloeibare stikstof gekoelde spatel behoefte om cellen klonteren houden. Wees voorzichtig te ontdooien van de cellen, hetgeen kan resulteren in cel klonteren te voorkomen. De cellen moeten verschijnen als een fijn wit poeder na lysis. Maximaal celpellet van 4 liter gistcultuur (~ 40 g) kan worden gemalen tegelijk.
      Noot: Opmerkingen met betrekking Werkwijze lysis worden hieronder besproken.
    3. Beoordeel de mate van cellyse met behulp van een hemocytometer of alternatieve cel telmethode. Om een ​​adequate analyse te bieden, neem dan de volgende voorbeelden: (1) voor lysis; (2) na vier ronden van lysis; en (3) na lysis. Om deze monsters te controleren, neem een ​​kleine hoeveelheid cellen met een vloeibare stikstof gekoelde spatel en plaats in een 1,5 ml buis.
    4. Zodra de cellen zijn ontdooid, pipet 5 ul cellenen meng met 495 pl water. Als 40-60% lysis van de cellen wordt waargenomen, gaat u naar de volgende stap in het protocol.
      Noot: Opmerkingen met betrekking effect van langere lysis worden hieronder besproken.
    5. Als voldoende lysis waargenomen, opslag gelyseerde cellen (-80 ° C) of doorgaan naar de volgende stap.
    6. Bereid twee 50 ml kegelvormige polypropyleen centrifugebuisjes met elk 15 ml Lysis Buffer, zoals 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT), en een commercieel verkrijgbare cocktail van proteaseremmers.
      Opmerking: Als significante proteolyse is waargenomen, overwegen gebruik van een protease deficiënte stam.
    7. Gebruik een vloeibare stikstof gekoelde spatel schep de bevroren gelyseerde cel poeder in de voorbereide 50 ml buizen. Voeg de celpoeder / vast stapsgewijs de Lysis Buffer, die zowel een reductiemiddel en proteaseremmer (s).
    8. Draai de 50 ml buizen voorzichtig bij kamertemperatuur teneinde ontdooien / ontbinding van de cellen, maar ook om te voorkomen dat luchtbellen de vorming. EENis de cel poeder / vast oplost, voeg extra cel vast / poeder.
    9. Vult elk van de twee 50 ml buisjes tot elk ongeveer 20 g cellen of alle cellen toegevoegd. Verder ontdooien / oplossen totdat er geen ingevroren cel klonten waargenomen in de 50 ml buizen. Dit duurt ongeveer 50 minuten duren.
    10. Centrifugeer de zwevende cellysaat gedurende 20 minuten bij 25.000 xg (4 ° C). Gunstig gelyseerde cellen kan een kleine hoeveelheid zwarte neerslag vertonen.
    11. Breng de 50 ml van de bovenstaande om ultra-centrifuge buizen (26,3 ml buizen gebruikt) polycarbonaat en voeg 10 ul 200 mM PMSF aan elke volle buis.
    12. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 xg (4 ° C). Vier lagen zichtbaar zijn, van onder naar boven: (1) een harde duidelijke pellet, met ribosomale complexen; (2) een zachte vetrijke pellet; (3) een grote heldere gele getinte laag die het grootste deel van oplosbare eiwitten en complexen van de cel; en (4) een 'geschubd' toplaag bestaande uit lipiden.
    13. Voer alle subsequent stappen in een koude ruimte (4 ° C). Verwijder zoveel van de top 'geschubd' lipidelaag mogelijk onder toepassing van een 1 ml pipet en gooi. Gebruik een 10 ml serologische pipet tot de meeste van de gele, heldere laag herstellen.
    14. Herstellen van de laatste paar ml van deze laag met behulp van een 1 ml pipet om te voorkomen dat de onderste twee lagen te verstoren. Vanaf 40 g natte cel pellet wordt ongeveer 48 ml van de middelste laag meestal hersteld en 8 ml lipide laag verwijderd / weggegooid.
      Opmerking: kolomzuivering stroom wordt sterk belemmerd door de aanwezigheid van lipiden, waarbij ook de kwaliteit van het complex kan verminderen, hieronder besproken.

2. Kolom Zuivering stap 1: IgG Chromatography

  1. Hars Evenwicht en Binding
    1. Bereid een 300 ul IgG-Sepharose suspensie van 40 g celpellet. Snijd het uiteinde van een 1 ml pipet tip vergemakkelijking pipetteren de suspensie. Wassen / equilibreren de IgG hars drie keer met telkens 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, een proteaseremmer tablet per 50 volume ml).
      1. Spin tot pellet bij 160 xg (4 ° C) tussen de wasbeurten en verwijder supernatant.
    2. Draai de IgG hars met de middenfase supernatant en twee mini proteaseremmer tabletten per 40 g cellen met een geschikte rotator, gedurende 2 uur (4 ° C). Dit is de IgG batchoplossing.
    3. Bereid twee 10 ml poly-prep kolommen voor gebruik door het snijden van het uiteinde van de kolom een ​​vlakke snede produceren. De verpakking en wassen van de kolom door zwaartekracht versnellen, laadt maximaal 200 ui gepakte IgG hars of ~ 25 ml van de IgG batchoplossing per 10 ml kolom.
    4. Giet de IgG batchoplossing in de kolom en laat bezinken door zwaartekracht. Als sedimentatie langer duurt dan 30 minuten, is er zeer waarschijnlijk was lipide-besmetting bij het herstellen van het midden fase uit de centrifuge tUbes.
    5. Was de gepakte kolom met vier opeenvolgende 10 ml volumes van IgGD150 Buffer.
  2. Op Column TEV Splitsing
    1. Sluit de onderkant van de kolom en voeg 1 ml IgGD150 buffer en 100 ul van TEV protease (0,6 mg / ml bouillon, mutant variant S219V van TEV geproduceerd in-house). Dicht de top van de kolom en meng gedurende 20 min (18 ° C) met een thermische mixer, schudden bij 750 rpm. Resuspendeer hars en meng opnieuw gedurende 20 min, herhaal opnieuw gedurende een totaal van 1 uur incubatie.
      Opmerking: Het is cruciaal om de incubatietijd tot een minimum.
    2. Zet de kolom 4 ° C en elueer het eiwit / complex met zwaartekracht. Elueer de dode-volume met een extra 200 ul van IgGD150 Buffer.

3. Kolom Zuivering Stap 2: calmoduline affiniteitschromatografie

  1. Hars Evenwicht en Binding
    1. Bereid 200 pi calmoduline affiniteit hars per 40 g celpellet. Was de hars drie keer met telkens 5 ml calmoduline bindingsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1 % v / v NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol), centrifugeren bij 160 xg (4 ° C) tot pellet per wasbeurt.
    2. Aan elk 1 ml IgG eluaat, voeg 3 volumes Calmodulin Binding Buffer. Het calciumgehalte constant te houden, voeg CaCl 2 en β-mercaptoethanol overeenkomt met het ontbreken van deze bestanddelen in de IgG elutie. Eindconcentraties moet 2 mM CaCl2 en 10 mM β-mercaptoethanol.
    3. Voeg het monster op de hars en calmoduline bindt gedurende 1 uur (4 ° C) met een buis rotator.
  2. Verpakking en het elueren van Calmodulin Resin
    1. Bereid een 2 ml poly-prep kolom per 100 pl calmoduline slurry door het snijden van het einde van de kolom tot vlakke opening te creëren. Laad niet meer dan 100 ul Calmodulin slurry per column de hoeveelheid hars van het monster te minimaliseren in contact komt tijdens elutie.
    2. Verpak de kolom door de zwaartekracht en was de hars in de kolom driemaal met 5 ml Calmodulin Binding Buffer.
    3. Elueer eiwit met toevoeging van 200 gl calmoduline elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0, 0,08% v / v NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol). Herhaal zesmaal de toevoeging van 200 pl elutiebuffer Calmodulin.
    4. Voor eluties 1-3, passen het volume op de kolom en verzamel het eluaat onmiddellijk. Eluering 4, sluit de bodem van de kolom en incubeer met elutiebuffer voor 2,5 minuten en daarna ontsluiten en laat elueren door zwaartekracht. Voor elutie 5, incubeer gedurende 5 minuten en daarna ontsluiten en te elueren. Voor elutie 6, incubeer gedurende 10 minuten en daarna ontsluiten en te elueren.
      Opmerking: De integriteit van het complex kan variëren eluties / fracties (zie representatieve resultaten sectie) <./ Li>
    5. Dialyseren eluties 2-6 individueel 's nachts met behulp van een geschikte micro dialyse methode. Dialyseer de fracties tegen dialysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 mM imidazool, pH 8, 10 mM β-mercaptoethanol).
      Opmerking: NP-40 niet merkbaar passen, of helemaal door het dialysemembraan.

4. Post-Purification Analyses Complex kwaliteit te beoordelen

  1. Inheemse Gel en zilverkleuring
    1. Bereid een 4-16% geprefabriceerde natieve gel analyse van het complex volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik van een geschikt molecuulgewicht eiwitstandaard en belasting 15 pi van elk van de gedialyseerde Calmodulin elution / fracties op de gel.
    2. Electrophorese de gel bij 150 V gedurende ongeveer 3 uur (4 ° C).
    3. Zilverkleuring de gel om de kwaliteit van elk van de zes eluties beoordelen. U kunt ook gebruik maken van even gevoelig commercieelfluorescerende vlek (s). In deze fase, de concentratie van het complex is waarschijnlijk beneden het detectieniveau van Coomassie blauw kleuring.
  2. Extra Gel Analysis Methods
    1. Om eiwit door Western blotting te sporen, het oplossen van het complex door middel van SDS of inheemse PAGE en vervolgens sonde de gel voor de Calmodulin Binding Peptide (CBP) epitoop met behulp van een TAP tag antilichaam volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Met een specifieke fluorescentiekleurstof (s), bevestigt de aanwezigheid en integriteit van eiwit en / of nucleïnezuur in een TAP gezuiverde complex. Zorg ervoor dat er geen spectrale overlap wordt gedetecteerd tussen deze vlekken.
  3. Negative Stain Electron Microscopy Visualization
    1. Gebruik continu carbon grids glow-ontladen bij -15 mA voor 30 sec, binnen 30 minuten van complexe applicatie.
    2. Toepassen 3 pl TAP gezuiverde complex (kenmerkend bij een concentratie van 1 nM) op raster. Incubeer gedurende een minuut. blot from de zijkant van het rooster om overtollige buffer te verwijderen.
    3. Was tweemaal met 20 ul druppels gedemineraliseerd water. Side vlek tussen de wasbeurten.
    4. Solliciteer grid naar een 50 ui negatieve daling vlek en incubeer gedurende een min. Kleuring met uranyl acetaat (2%) of uranyl formiaat (0,75%) aanbevolen.
      Let op: Uranyl zouten en oplossingen zijn zwak radioactief en bevatten heavy metal. Deze moeten met zorg worden behandeld en al het materiaal dat in contact komt met deze oplossingen dienen te worden vernietigd volgende institutionele aanbevolen richtlijnen afval.
    5. Solliciteer grid naar een frisse 50 pi druppel negatieve vlek, zonder te deppen. Incubeer voor een min, daarna side vlek, en ten slotte de lucht drogen en te visualiseren.
  4. Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) Visualisatie
    1. Uitvoeren cryo-EM TAP gezuiverde complex, maar optimalisatie nodig, volgens het protocol van de fabrikant.
      Let op: Aanwezigheid van detergent bij hoge concentraties may belemmeren vooruitgang en wordt hieronder besproken.

5. Complex opslag

  1. Het voorbereiden van Complex voor opslag
    1. Concentreer het complex, indien nodig, onder toepassing van een centrifugaal filter met een geschikte molecuulgewicht cut-off van het complex. Spin bij 14.000 xg gedurende stappen van 1 minuut tot de gewenste concentratie is bereikt.
      Opmerking: NP-40-concentratie zal toenemen in de concentratie tijdens het concentreren, omdat het niet door het filter noch dialysemembraan niet doorstaat.
    2. Flash bevriezen het complex in 30 gl aliquots in vloeibare stikstof of droogijs gekoelde ethanol bad en bewaar bij -80 ° C.
  2. Optioneel Post-Zuivering Verwijdering van Wasmiddel

Opmerking: De aanwezigheid van een detergens zoals NP-40 en bij een concentratie boven die van de kritische micelconcentratie kunnen belemmeren of voortgang remmen voor sommige toepassingen. De gevolgen van zijn verwijdering uit de protocol en vervanging door andere additieven of co-oplosmiddelen worden hierna besproken. Als er geen NP-40 gewenst, de mogelijkheid om een ​​commerciële toepassing voor het verwijderen gebruiken, bijvoorbeeld Bio-parels.

  1. Pre-equilibreert in de handel verkrijgbaar detergent absorberende korrels in Dialyse buffer. Meng vijf korrels per 30 gl complex (meestal 10 nM concentraties).
  2. Incubeer geëquilibreerd korrels uit stap 5.2.1 TAP gezuiverde complex voor 15 min op ijs. Gebruik complex binnen een paar uur na het verwijderen van het wasmiddel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een gewijzigde TAP methode werd gebruikt voor het zuiveren uit S. cerevisiae de U1 snRNP, een 18-subunit ribonucleoproteïnecomplex. Een eerste TAP zuivering van het complex na het gepubliceerde protocol 2,3 leverde een complex dat heterogene verschenen, migreren drie banden op een met zilver gekleurde natieve polyacrylamidegel (Figuur 2A). Meerdere ronden optimalisatie TAP methode leverde een complex dat primair als een enkele band migreerden op een n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De TAP-methode maakt gebruik van twee tags die een behoefte in evenwicht te brengen voor kleine en selectieve binding aan een affiniteit hars met een verlangen om te handhaven in de buurt van fysiologische oplossing omstandigheden. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Tevens is een TAP hebben ORFs zijn verkrijgbaar bij een commerciële bron, zodat men elke giststam te verkrijgen met een gemerkt eiwit voor gist complex....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn dankbaar voor de steun en adviezen van Nikolaus Grigorieff. We danken Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu en Mike Rigney voor nuttige discussies en EM-begeleiding. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, Award No. 1157892. De Brandeis EM-faciliteit wordt ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie P01 GM62580.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
S. cerevisiae TAP tagged strainOpen BiosystemsYSC1177Dit is de primaire giststam die werd gebruikt om het TAP-protocol te ontwikkelen. Zijn achtergrond is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
KoffiemolenMr. CoffeeIDS77Gebaat voor cel lysis
Hemocytometer, Bright LineHausser Scientific3120Gebaat om cel lysis te beoordelen
JA 9.100 centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc.Gebaat om de gistcellen te oogsten
JA 20 fixed-angle centrifuge rotorBeckman Coulter, Inc.Gebaat om het cellextract van niet-oplosbaar cellulair materiaal te zuiveren
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotorBeckman Coulter, Inc.Gebaat om het oplosbare cellextract verder te zuiveren
ThermomixerEppendorfR5355Temperatuurgestuurde shaker
Novex gelsysteemThermo Fisher Scientific 
IgG resinGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resinAgilent Technologies, Inc.214303Affiniteitsresin
Protease inhibitor cocktail, mini tabletsSigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA-vrije tablets
Protease inhibitor cocktail, grote tabletsSigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA-vrije tablets
Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)Opgelost in isopropanol
2 ml Bio-spin kolomBio-Rad Laboratories, Inc.7326008Gebaat om de Calmodulin resin te vullen en te wassen
10 ml poly-prep kolomBio-Rad Laboratories, Inc.7311550Gebaat om de IgG resin te vullen en te wassen
Precast native PAGE Bis-Tris gelsLife TechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standardThermo Fisher ScientificLC0725Ongekleurde proteïne standaard gebruikt voor native PAGE. Laad 7.5 μl voor een zilvergekleurde gel en 5 μl voor een SYPRO Ruby gekleurde gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gelsLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels 
PageRuler proteïne standaardThermo Fisher Scientific26614Ongekleurde proteïne standaard gebruikt voor Western blotting
SDS running bufferLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibodyThermo Fisher ScientificCAB1001Primaire antilichaam tegen CBP tag
Secundair antilichaamThermo Fisher Scientific31341Geiten anti-konijn alkalisch fosfatase geconjugeerd
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfaat/nitro blauw tetrazoliëum 
Dialys unitsThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer mini dialyse units
Centrifugale filter units, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit met Ultracel-100 membraan
Detergentia absorberende kralenBio-Rad Laboratories, Inc.1523920Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564Fluorescente kleurstof voor nucleïnezuurkleuring, bij detectie met SYPRO Ruby aanwezig, gebruik excitatiegolflengte van 488 nm en emissiegolflengte van 532 nm
SYPRO RubyMolecular ProbesS-12000Fluorescente kleurstof voor proteïnekleuring, bij detectie met SYBR Green II aanwezig, gebruik excitatiegolflengte van 457 nm en emissiegolflengte van 670 nm
KoperroostersElectron Microscopy SciencesG400-CP

Referenties

  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  3. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  4. Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
  5. Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
  6. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  7. Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
  8. Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  9. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  10. Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
  11. Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
  12. Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
  13. Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
  14. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  15. Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
  16. Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
  17. Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Tandem affiniteitszuiveringZuivering van natieve complexenBeoordeling van structurele homogeniteitLysis van gistcellenIgG Sepharose bindingTEV protease splitsingCalmoduline affiniteitsbindingNegatief contrast EMSDS PAGE analyseIdentificatie via massaspectrometrie
Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.