Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Summary

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Abstract

Affiniteit zuivering benaderingen zijn succesvol in het isoleren van inheemse complexen voor proteomics karakterisering geweest. Structurele heterogeniteit en een mate van heterogeniteit samenstelling van een complex meestal niet belemmeren vooruitgang bij het uitvoeren van dergelijke studies. Daarentegen zou een complex bestemd voor structurele karakterisering worden gezuiverd in een staat die zowel qua samenstelling en structureel homogeen en bij een hogere concentratie dan vereist voor proteomics. Recent zijn er aanzienlijke vooruitgang bij de toepassing van elektronenmicroscopie voor structuurbepaling van grote macromoleculaire complexen zijn. Dit heeft interesse in benaderingen verhoogde inheemse complexen van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor structurele bepaling te zuiveren door elektronenmicroscopie. De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is geoptimaliseerd te extraheren en te zuiveren een 18-subunit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein assemblage uit gist (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Veel grote cellulaire processen worden uitgevoerd door grote eiwit en eiwit-RNA-complexen ¹ uitgevoerd. Een belangrijk knelpunt te voeren biochemische en structurele studies van zulke complexen te verkrijgen van een geschikte kwaliteit (dwz homogeniteit) en bij een geschikte concentratie. Het isoleren van een complex van een natieve bron heeft vele voordelen, waaronder behoud relevante post-transcriptionele en / of translationele modificaties van subeenheden en verzekeren goede complex samenstel. Echter grote cellulaire complexen zijn vaak aanwezig in een cel op een klein aantal kopieën en de zuivering zeer efficiënt moeten zijn en optreden onder ....

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol werd ontwikkeld voor de zuivering van een complex van 4 liter celkweek ongeveer 40 g natgewicht van cellen. Na bereiding moeten alle buffers worden opgeslagen bij 4 ° C en binnen een maand na bereiding. Reductiemiddel en proteaseremmers worden alleen buffers juist voor gebruik.

1. Bereiding van Whole Cell Extract voor Tandem Affinity Purification

1. Groei van S. cerevisiae Cells
   1. Streak de gewenste TAP tag S. cerevisiae stam uit opslag (-80 ° C) op een gist pepton dextrose (YPD) plaat. Incubeer gedurende 3-5 dagen (30 ° C), totdat gistcellen verschijnen wit en pluizig.

Results

Een gewijzigde TAP methode werd gebruikt voor het zuiveren uit S. cerevisiae de U1 snRNP, een 18-subunit ribonucleoproteïnecomplex. Een eerste TAP zuivering van het complex na het gepubliceerde protocol ^2,3 leverde een complex dat heterogene verschenen, migreren drie banden op een met zilver gekleurde natieve polyacrylamidegel (Figuur 2A). Meerdere ronden optimalisatie TAP methode leverde een complex dat primair als een enkele band migreerden op een n.......

Discussion

De TAP-methode maakt gebruik van twee tags die een behoefte in evenwicht te brengen voor kleine en selectieve binding aan een affiniteit hars met een verlangen om te handhaven in de buurt van fysiologische oplossing omstandigheden. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Tevens is een TAP hebben ORFs zijn verkrijgbaar bij een commerciële bron, zodat men elke giststam te verkrijgen met een gemerkt eiwit voor gist complex........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain	Open Biosystems	YSC1177	This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder	Mr. Coffee	IDS77	Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor	Beckman Coulter, Inc.		Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Temperature controlled shaker
Novex gel system	Thermo Fisher Scientific
IgG resin	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)			Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7326008	Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels
PageRuler protein standard	Thermo Fisher Scientific	26614	Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31341	Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium
Dialaysis units	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids	Electron Microscopy Sciences	G400-CP