Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Samenvatting

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Samenvatting

Een verbeterde versie van een polymerase kettingreactie (PCR) -beperking fragment polymorfisme (RFLP) werkwijze voor het genotyperen van giftige kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / electrospray ionisatie massaspectrometrie (LC / ESI-MS) is beschreven. DNA-extractie wordt uitgevoerd met een silica membraan-gebaseerde DNA extractie kit. Na de PCR amplificatie met behulp van een detergens-vrije PCR buffer, worden restrictie-enzymen toegevoegd aan de oplossing zonder zuiveren van de reactieoplossing. Een omgekeerde fase silica monoliet kolom en een Fourier-transformatie hoge resolutie massaspectrometer met een gemodificeerde Kingdon val analyzer worden gebruikt voor de scheiding en detectie, respectievelijk. De mobiele fase, bestaande uit 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7,9) en methanol wordt afgegeven met een stroomsnelheid van 0,4 ml / min. De cyclustijd voor LC / ESI-MS analyse 8 min inbegrip equilibratie van de kolom. Deconvolutie software met een isotoop distributiemodel of het oligonucleotide wordt gebruikt om de corresponderende mono-isotopische massa berekend uit het massaspectrum. Voor de analyse van oligonucleotiden (range 26-79 nucleotiden), nauwkeurigheid van massa's was 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) en een uitstekende nauwkeurigheid en precisie werden volgehouden 180 uur zonder gebruik te maken van een massa-standaard slot.

Inleiding

Massaspectrometrie (MS) is een geaccepteerde techniek voor snelle en betrouwbare identificatie van nucleïnezuren, matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) en electrospray ionisatie (ESI) gebruikt voor ionisatie ^1,2. De MALDI techniek wordt typisch gecombineerd met een time-of-flight (TOF) analyzer; echter de toepassing van MALDI-TOF MS beperkt tot korte oligonucleotiden (~ 25 nucleotiden (nt)) vanwege de volgende fragmentatie adduct vorming en lage ionisatie-efficiëntie ^1,2. Daarentegen ESI geldt voor meer oligonucleotiden (> 100 nt), maar veel ladingstoestanden van meerdere geladen ionen ([M-nH] ^n-) gelijktijdig geproduceerd uit biomacromoleculen en derhalve de massa van de analyt kan het bovenste overschrijden limiet van de m / z van de spectrometer. Dit vereist de interpretatie van de ingewikkelde spectra, dat wil zeggen, transformatie van een laadtoestand serie in de overeenkomstige massavia deconvolutie.

Bij massameting van een klein molecuul, de piek van de mono-isotopische massa, dat wil zeggen de massa van het molecuul dat alleen de meest voorkomende isotoop van elk element de meest voorkomende en waargenomen natuurlijke ^3. Naarmate het molecuulgewicht toeneemt, wordt het isotopische verdeling verschuift naar hogere m / z en de mono-isotopische piek verduisterd door basislijnruis ^3-5. Zodra de mono-isotopische piek niet langer detecteerbaar massa groter dan 10 kDa ^3, wordt het gemiddelde molecuulgewicht voor de metingen plaats van de mono-isotopische massa ^5. In dergelijke gevallen kan de isotopische verdeling waarin elk van de individuele pieken gescheiden door 1 Da alleen waargenomen wanneer een hoge resolutie massa-analysator zoals een TOF een Fourier transformatie gemodificeerde Kingdons val analysator ^6, of een Fourier transform ion cyclotron resonantie analysator wordt gebruikt voor analyse. Echter, de meest overvloedige piek sometimes niet in overeenstemming met de gemiddelde moleculaire massa ^5. Deze problemen kunnen leiden tot problemen voor het nauwkeurig bepalen van analyten.

Gezien de variatie in de natuurlijke overvloed van stabiele isotopen en de moeilijkheden bij de bepaling van de molmassa, het meten van de mono-isotopische massa ideaal voor de massa van biomoleculen ^3,4. In de praktijk, of een mono-isotopische piek kan worden waargenomen of de mono-isotopische massa kan worden geschat door het vergelijken van het patroon van de waargenomen isotopische distributie aan de theoretisch berekend uit een model analyt ^4,7-10. De fitting algoritme ⁸ wordt nu opgenomen in proprietary software.

In de context van ESI-MS, dissociatie van een DNA-duplex, zuivering en ontzouting noodzakelijk zijn voor directe meting aan het falen van ionisatie voorkomen door ion onderdrukking en adductvorming ^2,10-14. Deze procedures zijn troublesome echter volledig geautomatiseerde analysesystemen zijn commercieel ontwikkeld met polymerasekettingreactie (PCR), monstervoorbereiding en ESI-MS voor de detectie van pathogenen ^15-20. Een andere benadering introduceert vloeistofchromatografie (LC) voor de scheiding. LC levert een online scheiding van analyten uit naast elkaar bestaande stoffen en vereist geen bewerkelijke monsterbereiding vóór ionisatie ^21,22. Echter, scheiding van nucleïnezuren met een MS-compatibele mobiele fase is moeilijker dan bij de meeste andere verbindingen zoals geneesmiddelen, peptiden en eiwitten vanwege de polyanionische aard van de nucleotiden. De meest succesvolle voorbeelden van LC / ESI-MS omvatten het gebruik van ionenpaar omgekeerde-fase-LC. Een mobiele fase van 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol werd aanvankelijk Apffel et al voorgesteld. Voor het scheiden en detecteren van korte oligonucleotiden ^23. Toepassing van LC / ESI-MS genotypering voor differentiation van een ziekteverwekker soorten, single-nucleotide polymorfismen en short tandem repeats is gemeld met behulp van een capillair polymeer-monoliet column die langer oligonucleotiden ^1,21,24-33 kan scheiden.

In Japan en de Verenigde Staten, heeft ernstige voedselvergiftiging opgetreden als gevolg van een verkeerde identificatie en onjuiste bereiding van pufferfish, en dit ondanks het feit dat de verdeling en de voorbereiding van de kogelvis streng wordt gecontroleerd door de voedselveiligheid wetgeving ^34,35. Bovendien is een opzettelijke doodslag met behulp van kogelvis extract voorkwamen in Japan ^36. Daarom wordt differentiatie van kogelvis soort vereist van zowel de volksgezondheid als forensisch onderzoekende standpunten. Bovendien, omdat Takifugu rubripes is veel duurder dan andere vormen van kogelvis, een differentiatie capaciteit is ook nodig in het kader van voedsel fraudeonderzoeken.

Hier wordt een gedetailleerde werkwijze voor het bepalen van de monoisotopic massa van een PCR-product met LC / ESI-MS met omgekeerde fase silica monoliet kolom en een hoge resolutie massaspectrometer wordt beschreven. Specifiek is de aanpak ontwikkeld om differentiatie van giftige kogelvis soorten gebaseerd op het gebruik van de PCR-restrictiefragment (RFLP) methode ^37, waarbij het ​​eerste voorbeeld speciesdifferentiatie dieren MS mogelijk.

Protocol

1. DNA Extraction

Opmerking: Gebruik een aparte ruimte voor DNA-extractie en post-PCR onderzoeken, zoals gel-elektroforese en LC / ESI-MS. ethanol toevoegen aan buffer 1 (met guanidine hydrochloride) en wasbuffer 2 (zonder guanidine hydrochloride) volgens de DNA extractie kit protocol wassen. Fish monsters werden verkregen uit vis groothandel en retail-markten in Japan.

1. Plaats 30-50 mg visweefsel in een 0,5 ml of 1,5 ml microcentrifugebuis. Squash het weefsel met behulp van een micro-spatel (behalve vin en huid).
   Let op: In het geval van fin, gebruik dan een 0,5 ml buis voor het weken.
2. Voeg 180 ul van de lysisbuffer en 40 pl proteinase K en vortex kort. Incubeer bij 56 ° C op een blok verwarming voor 2 uur of overnacht. Meng door kort vortexen elke 15 min gedurende de incubatie.
   Opmerking: de volledige lysis is niet noodzakelijk.
3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 13.000 x g. Na centrifugeren als een kleine amount olie bestaat op het oppervlak bij een vette monster zoals lever, weggooien. Transfer supernatans naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
4. Voeg 200 ul van het chaotrope buffer met guanidine hydrochloride en door vortexen gemengd. Voeg 200 gl ethanol (99,5%) en meng door opnieuw vortexen.
5. Breng het mengsel in de spin kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 x g. Gooi het doorstroomkanaal.
   Let op: bleekmiddel niet toe te voegen aan het afval omdat guanidine zeer reactieve verbindingen met bleekmiddel kunnen vormen.
6. Voeg 500 ul van de wasbuffer 1 (met guanidine hydrochloride) en gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 13.000 x g. Gooi de stroom door en de collectie buis.
7. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis die bij de kit. Voeg 500 ul van de wasbuffer 2 en centrifugeer gedurende 3 min bij 20.000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis. Breng de spinkolom in nieuw1,5 ml microcentrifugebuis.
8. Pipetteer 200 ul elutiebuffer naar het midden van de spinkolom membraan. Na 1 min gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 6000 x g.
9. Pipetteer 50 ul van het eluaat om een ​​wegwerp UV cuvet en meet het UV-spectrum van het eluaat bij 220-300 nm en de absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer.
10. Controleer het UV-spectrum van DNA met de piek bij 260 nm. Bereken de geschatte DNA-concentratie met de eenvoudige vergelijking "DNA-concentratie (ng / gl) = absorptie bij 260 nm x 50".
    Opmerking: Typisch DNA-concentratie geëxtraheerd uit de vinnen van de kogelvis is 63 ± 30 ng / ul (n = 20).
11. Als de DNA-concentratie hoger is dan 10 ng / pl verdund DNA monsters met Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8) tot 5 ng / ul.
12. Bewaar het monster bij -20 ° C of overgaan tot PCR-amplificatie (deel 2).

2. PCR

1. Opzetten 25 pi PCR voor elke extrgehandeld DNA monster, positieve controle (0,2 uM gesynthetiseerd oligonucleotide met de doelsequentie in TE pH 8,0) en negatieve controle (ultrapurified water in plaats van DNA-monster) op ijs volgens tabellen 1 en 2 op een schone werkbank om contaminatie te voorkomen.
   Opmerking: Voor eenvoudige bediening, maken voldoende hoeveelheid cocktail bevat alle reagentia zonder matrijs DNA en verdeel het. Gebruik DNA polymerase met proofreading activiteit toevoeging van 3 'A overhangen aan het PCR-product te vermijden.
2. Voer PCR-amplificatie op een thermal cycler met het cyclusprogramma in tabel 3.

3. enzymatische afbraak

1. Voeg 2 ul van de oplossing die 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM _MgCl2, 10 mM dithiothreïtol en 500 mM NaCl aan de oplossing PCR.
2. Voeg 1 pl van elk restrictie-enzym (DraI en MspI) en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C op thErmal fietser.
3. Incubeer gedurende 5 minuten bij 72 ° C om de resterende DNA polymerase, waarin het kleverig lokaal opgewekt door Msp I vult activeren
4. Optioneel: Analyseer elk 2,5 ui van de reactieoplossing door middel van polyacrylamidegelelektroforese onder toepassing van een dwarsschalm verhouding (% C, percentage bisacrylamide) van 3,33 (gew%) en een polyacrylamide gel concentratie (% T) van 15 (% w / v) ^38. Vlekken op de gel met behulp van de fluorescerende DNA vlek en observeren dubbelstrengs DNA op een blauw licht transilluminator met behulp van een amberkleurig scherm.
5. Filtreer de reactieoplossing met 0,2-0,5 urn centrifugale filterinrichting verstopping tegen te gaan, waarbij de analytische kolom zou schaden.
6. Breng het filtraat over in een taps polypropyleen buisje en bewaar bij -20 ° C tot analyse.

4. LC / ESI-MS Analysis

1. Weeg 67,2 g (ongeveer 42 ml) van HFIP en 1,52 g (ongeveer 2,0 ml) TEA in een 1 L fles. Voeg 955 ml water ultrapurified (LC / MS grade) en roer met een magneetroerder tot de reagentia volledig opgelost. Neem een ​​monster van de oplossing en controleer de pH (tussen 7,85 en 7,95; ideaal pH = 7,9) met een pH-meter.
   Opmerking: de hoeveelheid niet terug naar de fles om besmetting door metaalionen te voorkomen. Als de pH 7,9 niet, voeg een kleine hoeveelheid hetzij HFIP of TEA om de pH opnieuw meet de pH.
2. Sluit de fles A van de vloeistofchromatograaf onder koeling van de fles met een directe koeling draagbare koelkast (voor huishoudelijk gebruik) verdamping lijn voorkomen. Sluit een andere fles gevuld met methanol op lijn B.
3. Sluit de voorkolom en de analytische kolom (2,0 x 50 mm, mesoporiën size = 30 nm) aan de vloeistofchromatograaf. Gaan stromen de aanvankelijke mobiele fase (95% A en 5% B) aan de kolommen equilibreren.
4. Bereid 0,5 mg / ml natrium trifluoracetaat (pH 3,5) als kalibrant ^39.
   1. Weeg 50 mg (ongeveer 34 ui) trifluorazijnzuur acid in een bekerglas.
   2. Voeg 30 ml water en ultrapurified titreren tot pH 3,5 met 10 mM natriumhydroxide met behulp van een pH meter.
   3. Vul tot 50 ml met ultrapurified water. Voeg 50 ml acetonitril (LC / MS graad) en meng.
   4. Neem een ​​deel van de werkoplossing en het op kamertemperatuur. Bewaar de rest van de oplossing bij 4 ° C.
5. Verlaag de stikstofdruk van de C-trap als volgt.
   Opmerking: Recent Fourier transformatie massaspectrometers, die geschikt zijn voor intacte eiwit analyse hebben regelsoftware druk regelen.
   1. Verwijder de linker bovenkap van de massaspectrometer. De C-trap ventiel is op de hoek van de links op de voorgrond.
   2. Raadpleeg hoge onderdruk waarde instrumentstatus raam van de besturingssoftware.
      Opmerking: De waarde is typisch, 3 x 10 ^-8 bar.
   3. Trek de knop om te ontgrendelen en draai de knop tegen de klok in heel langzaam om de hoge vacuüm druk te verminderenure tot 1/3 (typisch 1 x 10 ^-8 bar). De aangegeven druk moet geleidelijk veranderen op een vertraagde wijze. Negeer de waarschuwing over lage druk. Druk op de knop om te vergrendelen.
   4. Herstel de bovenklep voor de veiligheid.
6. IJk de massaspectrometer met behulp van natrium trifluoracetaat ^39.
   Opmerking: Dagelijks massa calibratie kan worden vervangen door dit protocol, maar de aanbevolen kalibratie door de fabrikant gesuggereerd moeten zijn voorafgaand aan deze kalibratie afgerond.
   1. Stel scan parameters en verwarmd ESI bron parameters in het vak van de tuning software instrument controle als volgt: soort scan volledige MS; scan range m / z 500-4,000; versnippering (in-source botsing geïnduceerde dissociatie (CID) voltage 60 eV, polariteit negatief; Auto Gain Control (AGC) richten 1 x 10 ^6, maximaal injecteren tijd 50 msec; schede gasstroom 5; aux gasstroom 0; sweep gas debiet 0; spuiten spanning 3 kV; capillaire temperatuur 320 ° C; S-lens radiofrequentie (RF) niveau 100; verwarmingstemperatuur 30 ° C.
      1. Voer de lijst met negatieve ionen worden bewaakt als m / z 792,85908, 1.064,80870, 1.336,75832, 1.608,70794, 1.880,65755, 2.152,60717, 2.424,55679, 2.696,50640, 2.968,45602, 3.376,38045.
   2. Verplaats de verwarmde ESI sonde dichter bij de interface van de massa spectrometer (stand B). Sluit de sonde en een spuit met een buis.
   3. Infuseren de kalibrant continu met een stroomsnelheid van 10 pl / min via de geïntegreerde spuitpomp. Controleer alleen de 6 lagere massa-ionen (m / z 792,85908-2152,60717) in de aangepaste kalibratie tafel.
      1. Doorgaan met kalibratie na de intensiteit van de signalen worden gestabiliseerd. Na de kalibratie, controleert alleen de zes hogere massa-ionen (m / z 1.880,65755-3.376,38045) en ga verder met de kalibratie. Vermijd het kalibreren met gebruikmaking van alle ionen in een keer te mislukken vermijden.
7. Verplaats de sonde naar de Aangepast decorte positie voor een stroomsnelheid van 0,4 ml / min (positie D) en sluit de vloeistof chromatograaf met een inerte metalen buis.
8. Stel de verwarmde ESI bron parameters in het vak van de tuning software instrument controle als volgt: schede gasstroom 50; aux gasstroom 15; vegen gasstroom 1; spuiten spanning 2,5 kV; capillaire temperatuur 350 ° C; S-lens RF level 100; verwarmingstemperatuur 350 ° C.
9. Stel acquisitie parameters van de massaspectrometer in de instrumentale setup-venster als volgt: methode duur 8 min; omleiden klep, 3,5-6 min naar massaspectrometer, 0-3,5 en 6-8 min te verspillen; runtime 3,5-6 min; polariteit negatief; in bron CID spanning 15,0 eV; microscans 3; nominaal oplossend vermogen (bij m / z 200) 140000; AGC target 1 x 10 ^6; maximale ion tijd 50 msec; aantal scans 1; scan range m / z 700-3,500; spectrum data type profiel.
10. Parameters van vloeistofchromatograaf als volgt: kolom oventemperatuur 20 ° C; sample tray temperatuur 10 ° C; gradiënt programma 0-0,5 min B 5%, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6.05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; stroomsnelheid 0,4 ml / min.
11. Purge bellen door te tikken op de bodems van de flesjes. Stel monster flesjes op het monster rek en injecteer 1,0 ul van een monster met behulp van de automatische monsternemer de analyse te starten.
12. Open ruwe data bestanden met de browsersoftware en bevestigen dat alle acquisities met succes voltooid, met inbegrip van de positieve en negatieve controles.
    Opmerking: Gewoonlijk is twee of drie pieken in de totale ionenstroom chromatogram bij een retentietijd van 4-5,5 min geboden wanneer kogelvis DNA succesvol wordt geamplificeerd en gedigesteerd.

5. Deconvolutie en interpretatie

1. Start de deconvolutie software. Kies type experiment "auto extract (isotoop opgelost)".
2. Bewerk een werkwijze met de volgende parameters: outputmassastromen M; S / N threshold 3, relatieve overvloed drempel 0; negatieve lading ja; berekenen gewonnen ion huidige chromatogram (XIC) ja; m / z bereik 700-3,500; rekenen carrier H ^+; minimum aantal gedetecteerde lading 3; isotopenverhouding nucleotide; fit factor 80%; restant drempel van 0%; overwegen overlappingen ja; rekenen range 3-50; minimum intensiteit 1; verwachte intensiteit fout 3.
   1. Opslaan als een nieuwe methode en selecteer het.
3. Selecteer de directory waar de ruwe data bestanden bestaan. Selecteer de ruwe data bestanden te analyseren en klik op 'Add to Queue' knop.
4. Klik op 'Uitvoeren' knop op het tabblad 'Run Queue' om deconvolutie starten.
5. Nadat de wachtrij is voltooid, selecteert u een rij en klik op 'Open Result' in de titel om de resultaten van deconvolutie verkrijgen.
6. Interpretatie van de resultaten van de mono-isotopische massa's verkregen uit de pieken bij een retentietijd van 4-5,5 min volgens tabel 4.

Resultaten

Drie in de handel verkrijgbare kolommen werden geëvalueerd voor het scheiden van lange oligonucleotiden met stroomsnelheden van 100-400 gl / min. Een grote poriën octadecyl koolstofketen (C ₁₈₎ -bonded deeltjesvormig silicakolom (a), een commercieel verkrijgbare poly (styreen-divinylbenzeen) (PS-DVB) monoliet kolom (b) en een C ₁₈ -bonded silica monoliet kolom ( c) werden vergeleken (figuur 1). Drie paren van de DNA-duplexen (26, 37 en 53 bp) werden gescheiden met alle kolommen, en C ₁₈ -bonded silica monoliet kolom werd gebruikt in de daaropvolgende studies.

Representatieve resultaten voor de analyse van een DNA monster geëxtraheerd uit de spier van T. rubripes wordt getoond in figuur 2. isotopen gescheiden pieken, zoals getoond in figuur 2a, nodig voor succesvol berekenen van de mono-isotopische massa. De theoretische en MEAgureerd mono-isotopische massa van T. rubripes worden getoond in Figuur 2b. Omdat de digestie met de endonucleasen wordt uitgevoerd direct na PCR amplificatie zonder zuivering, wordt het 3'-kleverige lokaal opgewekt door de Mspl endonuclease gevuld met de overgebleven DNA polymerase. Volgens de analyse van amplicons afgeleid van het synthetische DNA-matrijzen, massanauwkeurigheid varieerde van -2,48 tot 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm gemiddeld n = 280). Dus een massatolerantie van 3 ppm werd gebruikt voor het differentiëren soorten (Tabel 4). Met behulp hiervan alle kogelvis verkregen uit markten en winkels werden goed gedifferentieerd specifieke soorten ^37.

Volgens de periodieke analyse van het monster verkregen uit het synthetische DNA-matrijs van T. chrysops, de mono-isotopische massa's van de analyten werden met succes bepaald binnen ± 3 ppm voor ten least 180 uur zonder enige massa calibratie (figuur 3). Dit betekent dat massa calibratie nodig zou zijn op een wekelijkse basis.

Figuur 1: Totale ionenstroom chromatogrammen van de PCR-RFLP product afgeleid van het gesynthetiseerde DNA-template van T. pardalis met een C ₁₈ -bonded deeltjesvormig silicakolom (a, 3 x 250 mm, deeltjesgrootte 3 micrometer), een poly (styreen-divinylbenzeen) (PS-DVB) monoliet kolom (b, 1,0 x 250 mm) en een C ₁₈ -bonded monoliet silicakolom (c, onderhavige werkwijze) omstandigheden (a). stroomsnelheid 0,2 ml / min; verhouding van methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Voorwaarden voor (b):stroomsnelheid 0,1 ml / min; verhouding van methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. De temperatuur voor beide kolommen was 20 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve resultaten voor het analyseren van ruwe spier van T. rubripes. (a) Typische totale ionenstroom chromatogrammen en massaspectrum. (B) Theoretische en gemeten mono-isotopische massa's van de PCR-RFLP producten afkomstig van het gesynthetiseerde DNA-template van T. rubripes. Klik hier om een grote te bekijkenr versie van deze figuur.

Figuur 3:. Stabiliteitsproef verteerd amplicons verkregen uit de synthetische DNA van T. chrysops werden geanalyseerd om de 10 uur. Massa kalibratie werd tijdens de test niet uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam	Volgorde
lago86F	5'-3'-CCATGTGGAATGAAAACACC
taki114F	5'-3'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA
fugu86-114R	5'-3'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG

Tabel 1: PCR primers.

PCR reagens	Volume gebruikt	eindconcentratie
Ultrapurified water	15.75 pi
Detergent-free 5x Buffer	5,0 pl	1x
dNTP mix (10 mM elk)	0,5 pl	0,2 mM
Primer mix (10 uM elk van lago86F, taki114F en fugu86-114R in TE-buffer pH 8,0)	1,0 gl	0,4 uM elk
DNA-polymerase (2,5 eenheden / ul)	0,25 ul	0,1 eenheid / pl
Template-DNA in TE buffer pH 8,0 (5,0-10 ng / ul voor onttrokken monster 0,2 urn voor synthetische DNA als positieve controle)	2,5 pl	0,5-1,0 ng / gl voor geëxtraheerde DNA en 20 nM voor synthetische DNA
	Totaal: 25 ui

Tabel 2: Onderdelen van een 25 pi schaal PCR.

Fiets	Staat	Functie
1	2 min bij 95 ° C	initiële denaturatie
2	30 seconden bij 95 ° C	Denaturation
3	30 s bij 56 ° C	gloeien
4	30 s bij 72 ° C	verlenging
5	Herhaal 2-4 (totaal 30 cycli)
6	7 min bij 72 ° C	definitieve rek
7	Houden op 12 ° C totdat verwijdering van het monster

Tabel 3: PCR-programma.

Piekaantal op retentietijd van 4,0-5,5 min	Mono-isotopische massa van de derde piek in het bereik (Da)		Mono-isotopische massa van de tweede piek in het bereik (Da)		Pufferfish species
	kleinere streng	grotere streng	kleinere streng	grotere streng
2	→	→	15890,707-15890,803	16177,531-16177,629	L. inermis
			15921,702-15921,797	16146,537-16146,634	L. gloveri
			15930,713-15930,809	16137,525-16137,622	L. Lunaris
			15937,697-15937,792	16131,537-16131,634	L. wheeleri
			24173,034-24173,179	24566,905-24567,053	T. chrysops
3	16295,706-16295,804	16467,610-16467,709	11341,851-11341,919	11466,875-11466,944	T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus
			11654,908-11654,978	11770,920-11770,991	T. niphobles
	16296,701-16296,799	16468,605-16468,704	→	→	T. rubripes
	16311,701-16311,799	16452,610-16452,709	→	→	T. poecilonotus T. exascurus
	16320,713-16320,811	16443,599-16443,697	→	→	T. porphyreus T. obscurus
	16599,751-16599,851	16780,667-16780,767	→	→	T. vermicularis

Tabel 4: Differentiatie van pufferfish van mono-isotopische massa afgeleid van LC / ESI-MS.

Tabel 5: Geamplificeerd DNA sequentie (a) de sequentie identiek.die van de andere kogelvis soorten zoals beschreven in Tabel 4. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

Discussie

Om DNA te extraheren, wordt een commerciële kit voor het extraheren van DNA uit bloed en weefsels gebruikt volgens het protocol van de fabrikant met geringe wijziging (hoeveelheid proteïnase K en centrifugeren van de lysis oplossing). Echter kan elke extractie kit zolang cellulair DNA kunnen worden geëxtraheerd met voldoende herstel en zuiverheid voor PCR gebruikt. Deze methode is conform spier, vin, lever, eierstok en huid ^37. Fin is bijzonder geschikt vanwege de grote oppervlakte, die een snelle lysis maakt met proteinase K. Vers, bevroren, gedroogd gekookt en gebakken kogelvis monsters werden met succes ³⁷ getest.

De PCR-primer set (tabel 1) is ontworpen voor pufferfish en versterkt het mitochondriale 16S ribosomaal RNA gen van kogelvis. Het doel DNA te amplificeren is 114-115 bp (genus Takifugu) en 86 bp (genus lagocephalus) (Tabel 5). Methode developme vergemakkelijkennt, gesynthetiseerde oligonucleotiden met de doelsequenties werden gebruikt voor de plaatsreferentie verzamelen kogelvis authentieke monsters. De primer set kan worden vervangen door een andere primer in reactie op het doel echter uiteindelijke DNA lengte na enzymatische digestie moet kleiner zijn dan 100 nt in termen van behoud van de kwaliteit van het massaspectrum vereiste voor een succesvolle deconvolutie. Daarnaast moet stikstofdruk in de C-trap afnemen wanneer het beoogd oligonucleotide langer dan ongeveer 75 nt en de kwaliteit van het massaspectrum onvoldoende is voor een succesvolle deconvolutie. Dergelijke beperkingen kunnen worden gecontroleerd door de recente ontwikkelingen in Instrumentsoftware, anders wordt de klep voor de C-trap in het chassis moet worden afgestemd zoals beschreven in de sectie protocol. Voor monster voorbereiding, gebruik van detergent-vrije reagentia is van cruciaal belang voor de verdere LC in termen van de juiste vorm van de piek, voldoende piekintensiteit en stabiele retentietijd ^31.

A PS-DVB-monoliet capillaire kolom ^21,24-33, een C ₁₈ omgekeerde fase deeltjesvormig silicakolom ^23,40,41 en een hydrofobe interactiechromatografie (HILIC) kolom ⁴² zijn gebruikt voor de LC / ESI-MS analyse van oligonucleotiden. Onder hen, de capillaire monoliet column is superieur aan de anderen in termen van scheiding capaciteit, maar de capillaire monoliet kolom gebruikt in eerdere studies werd gemaakt in-house en werken bij een lage stroomsnelheid (2 pl / min), die instrumentatie vereist gewijd aan micro LC. Gemakkelijk te vergemakkelijken, werden commercieel verkrijgbare kolommen geëvalueerd voor het scheiden van lange oligonucleotiden bij hogere stroomsnelheden (100-400 gl / min). Drie paren van DNA-duplexen (26, 37 en 53 bp) werden gescheiden onder toepassing van de bovengenoemde kolommen echter de cyclustijden van de -bonded deeltjesvormige silicakolom C ₁₈ en PS-DVB-monoliet kolom waren 65 en 70 minuten respectievelijk , terwijl die van de C _{18 -bonded silica monoliet kolom werd 8 min (figuur 1). Rekening houdend snelle analyse, werd de silica monoliet kolom C 18 -bonded gekozen voor onze doeleinden ondanks de beperkte scheiding capaciteit; maar de resterende twee kolommen kunnen worden toegepast bij verbeterde scheiding vereist. Theoretisch bij een monoliet kolom, is er geen interstitieel volume en de mobiele fase zou worden gedwongen te stromen door de poriën van de vaste fase met behoud van een constante weglengte, waardoor een efficiënte scheiding ^27. Dergelijke werkwijzen worden geopenbaard, met name bij de analyse van biomacromoleculen zoals een oligonucleotide, zoals de langzame diffusie van grote moleculen. Een van de praktische voordelen van een monoliet kolom dat de tegendruk lager is dan die van een deeltjesvormig silicakolom ^27. Ondanks de hoge stroomsnelheid (400 pl / min) en lage temperatuur kolom (20 ° C), maximale tegendruk van desysteem was 12,5 MPa ^37. Dit is de eerste demonstratie van de voordelen van een C 18 -bonded silica monoliet kolom voor de snelle analyse van een lang oligonucleotide. Vanwege de hoge stroomsnelheid, zijn een speciaal instrument voor micro LC en nauwkeurige uitlijning op het raakvlak niet vereist. In plaats daarvan wordt een verwarmde ESI probe vereist om de DNA-duplex dissociëren en ionisatie van DNA helpen zoals later beschreven.}

Ionenpaar chromatografie wordt gewoonlijk gebruikt voor de MS-compatibele scheiding van oligonucleotiden. Echter een ionenpaar-reagens interfereert algemeen de ESI proces en vermindert de gevoeligheid van ESI-MS. Daarom wordt HFIP vaak gebruikt voor de mobiele fase om de gevoeligheid van het oligonucleotide te verbeteren. Echter, HFIP (kookpunt 59 ° C) verdampt snel aan het grensvlak voor methanol (kookpunt 65 ° C) en derhalve het verlies aan oplosmiddel verhoogt pH en bevordert de dissociatie van het ionenpaar-reagens (bijv TEA)van het oligonucleotide. Omdat de huidige werkwijze een verwarmde ESI sonde, die het eluaat met heet stikstofgas bij 350 ° C nebulizes in dienst heeft, kan dit effect worden benadrukt. In plaats van HFIP-TEA buffer, Erb en Oberacher aanbevolen cyclohexyldimethylammonium acetaat (CycHDMAA; pH 8,4) voor genotypering analyse als gevolg van een vermindering van de adduct formatie met sporen metaalionen ^33. De auteurs afgeleid dat CycHDMAA zich onderdrukt de vorming van het adduct metaal. Ondanks de literatuur is significant adductvorming niet waargenomen bij de onderhavige werkwijze. Bovendien, het opmerkelijke voordeel van de HFIP-TEA-methanol is dat het piekoppervlak verkregen met HFIP-TEA-methanol systeem was 17 maal groter dan die verkregen uit de CycHDMAA-acetonitrile systeem bij het ​​analyseren van een 86 bp amplicon van T. poecilonotus (gegevens niet getoond). Een nadeel van de HFIP-TEA-methanol systeem is echter de verhoogde kosten ten opzichte van de CycHDMAA-acetonitrile systeem.

Berekening van de mono-isotopische massa vereist de scheiding van isotopische pieken van meervoudig geladen ionen. Daarom is de resolutie is van cruciaal belang voor de huidige analyse. Hoewel vereiste oplossend vermogen is afhankelijk van de basepaar lengte van de analyt, conventionele TOF analysatoren, die een oplossend vermogen van enkele tienduizenden hebben, kunnen worden beperkt voor de analyse van korte oligonucleotiden.

De theoretische mono-isotopische massa getoond in Tabel 4 werden berekend uit de overeenkomstige base samenstellingen van de analyten. Als alternatief Muddiman et al. Ontwikkelde een softwaretoepassing naar de basis samenstelling berekenen op basis van de juiste massa ^43. Een soortgelijk programma geïntegreerd in de geautomatiseerde ESI-MS systeem ^16-18. Het gebruik van deze algoritmen kan de robuustheid van de onderhavige werkwijze te verbeteren omdat een gecontroleerde mono-isotopische massa niet altijd overeen met een unieke basissamenstelling ovleugel aan de massatolerantie van 3 ppm als gevolg van de onvermijdelijke meetfout. Helaas, we konden niet deze softwareproducten te krijgen voor de huidige studie.

De onderhavige mono-isotopische massa gebaseerde determinatie mag niet alleen geschikt voor de differentiatie van kogelvis, maar ook voor de detectie van andere DNA-polymorfismen omdat de onderhavige werkwijze is gebaseerd op de analyse van de basissamenstelling en geen die speciaal op kogelvis betrekken. Voor de detectie van DNA polymorfisme, de specifieke ESI-MS systeem is volledig geautomatiseerd en eenvoudig te bedienen, die geschikt zijn voor diagnostisch gebruik kan zijn zoals detectie van pathogenen ^{15,17,18,20,30.} Omgekeerd, de onderhavige werkwijze uitvoerbaar gemeenschappelijke onderzoeksinstrumenten en apparaten en daarom geschikt voor research doeleinden. ESI-MS is al toegepast op menselijke DNA polymorfisme zoals enkele nucleotide polymorfisme ^13,28,32, short tandem herhaling ²⁶En mitochondriaal DNA analsis ^16,19. Micro RNA werd geanalyseerd via capillair LC / ESI-MS ^44. Deze gepubliceerde toepassingen kunnen ook worden gerealiseerd door de onderhavige werkwijze. Bovendien kan deze werkwijze geschikt voor het bewaken van de interactie tussen oligonucleotide en laag molecuulgewicht verbindingen, zoals de interactie van antibiotica en ribosomaal RNA ⁴⁵ vanwege de scheiding lage temperatuur. In dergelijke gevallen, oligonucleotiden en laag molecuulgewicht verbindingen tegelijkertijd worden gedetecteerd, wat een voordeel van het gebruik van LC / ESI-MS.

Er is een beperking die de instrumentatie is niet geschikt voor het uitvoeren van parallelle analyse zoals in conventionele technieken zoals Sanger sequentiebepaling en real-time PCR. Bovendien is de onderhavige werkwijze identificeert alleen basissamenstelling en elke base substitutie in hetzelfde molecuul kan niet worden onderscheiden. Echter kan het MS-gebaseerde DNA-analyse beschreven nog verdienste in termens nauwkeurigheid ten opzichte van de DNA-bindende kleurstof gebaseerde technieken zoals gelelektroforese en real-time PCR.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Qiagen	69504	DNA extractie kit
Proteinase K	Qiagen	19131
Ethanol (99.5+ vol%)	Wako	054-07225	Voor het verdunnen van wasbuffers
TE buffer (pH 8.0)	Wako	310-90023	Voor het verdunnen van DNA-monster
PCR primer	Fasmac	NA	Gezuiverd met reverse-phase cartridge kolom door de leverancier
Template DNA	Eurofins Genomics	NA	Gezuiverd door HPLC door de leverancier
Ultragezuiverd water	NA	NA	Geproduceerd met een Milli-Q Direct waterzuiveringssysteem (Merck Millipore), gebruikt voor monstervoorbereiding
Detergent Free 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	Gebruik in plaats van de geleverde buffer van DNA-polymerase
Pfu-X DNA polymerase	Jena Bioscience	PCR-207S
dNTP mix (20 mM elk)	Jena Bioscience	NA	Meegeleverd met de DNA-polymerase
10× Universal buffer M	Takara Bio	NA	Bevat 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol en 500 mM NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Restrictie-enzym
Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Restrictie-enzym
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Fluka	42060-50ML	Eluentadditief voor LC-MS-kwaliteit.
Triethylamine (TEA)	Fluka	65897-50ML	Eluentadditief voor LC-MS-kwaliteit.
Trifluorazijnzuur	Sigma-Aldrich	T6508	Voor de bereiding van het ijkmiddel.
Natriumhydroxide (1,0 M)	Fluka	72082	Verdun tot 10 mM met ultragezuiverd water en gebruik voor titratie van trifluorazijnzuur.
Acetonitril	Fluka	34967	Voor de bereiding van het ijkmiddel, LC/MS-kwaliteit.
Methanol	Kanto	25185-76	Voor mobiele fase, LC/MS-kwaliteit.
Water	Thermo Fisher	W6-1	Voor mobiele fase, LC/MS-kwaliteit.
Microcentrifugebuis (0,5 ml)	Eppendorf	0030123301	PCR clean grade
Microcentrifugebuis (1,5 ml)	Eppendorf	0030123328	PCR clean grade
UVette	Eppendorf	0030106300	Voorwerpbare UV-cuvet.
Gel Green	Biotium	41004	Fluorescente DNA-kleuring
Cosmospin filter G (0,2 μm)	Nakalai Tesque	06549-44	Gemaakt van hydrofiele polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan. Elke centrifugale filtereenheid (poriegrootte, 0,2–0,5 μm) gemaakt van hydrofiel PTFE of een andere laagbindende membraan is toepasbaar.
300 μl PP schroefdop	American Chromatography Supplies	V0309P-1232
Voorassemberde schroefdop en septum	Finneran	5395-09R
Monobis C18 analytische kolom (2,0×50 mm, mesopore grootte = 30 nm)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	Buiten Japan, beschikbaar voor aankoop bij GL Sciences via zijn distributeurs. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard kolom	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Inclusief houder.
Cadenza CW-C18 (3,0×250 mm)	Imtakt	CW036	C18-gebonden silicasadeeltje kolom
ProSwift RP-4H (1,0×250 mm)	Thermo Fisher	066640	Poly(styreen-divinylbenzeen) monolith kolom
Themo Mixer C	Eppendorf	5382 000.023	Voor de vertering van visweefsels.
Spectrofotometer	Shimadzu	UV-3150	Kwantificering van DNA-concentratie.
Thermische cycler	Bio-Rad	T100
Draagbare koelkast	Twinbird	D-CUBE	Voor vloeibare mobiele fase om verdamping van HFIP te voorkomen. Dit kan worden vervangen door een ijsbox.
Ultimate 3000 vloeistofchromatograaf	Thermo Fisher	NA
Q Exactive massaspectrometer	Thermo Fisher	NA	Fourier-transformatie-massaspectrometer uitgerust met de gemodificeerde Kingdon-trap-analysator.
Eiwitdeconvolutie 3.0	Thermo Fisher	NA	Gebruik versie 3.0 of hoger met een isotopisch patroonmodel van nucleotide.