Smaak is een belangrijk sensorisch proces dat de aantrekking tot heilzame stoffen en het vermijden van giftige stoffen vergemakkelijkt. Dit protocol beschrijft een eenvoudige innametest voor het bepalen van de Drosophila smaakpreferentie voor een bepaalde chemische verbinding.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Taste Voorkeur Assay voor Volwassenenonderwijs
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reuk- en smaakzintuigen van de omgeving zijn essentieel voor het overleven van dieren. De meest voor de hand liggende toepassing van deze chemosenses is het onderscheid kunnen maken tussen goede voedselbronnen en mogelijk gevaarlijke voedselbronnen. Smaakvermogen vereist fysiek contact met een chemische verbinding die in staat is om signalen te geven via smaakreceptoren die op het oppervlak van neuronen worden uitgedrukt. Bij insecten kunnen deze smaakgewrichten over het hele lichaam van het dier worden gevonden, waardoor smaak een belangrijke rol kan spelen in vele verschillende gedragingen. Insecten hebben meestal de voorkeur voor verbindingen die suikers bevatten, terwijl verbindingen die als bitter van smaak worden beschouwd, worden vermeden. Gezien de fundamentele biologische betekenis van smaak, is er een intense belangstelling voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze sensorische modaliteit. We beschrijven een smaakkeuring bij volwassen Drosophila die de voorkeur van de dieren voor een bepaalde smakende verbinding weerspiegelt. Deze test kan worden toegepast op dieren van elke genetische achtergrond om de smaakvoorkeur voor een gewenste oplosbare verbinding te onderzoeken.
Inleiding
Dieren gebruiken chemosensation om gunstige voorwaarden uit elkaar te onderscheiden van ongunstige omstandigheden. Deze waarneming kan cruciaal voor zaken als de bepaling van de beste voedselbron, het vermijden van giftige stoffen en het bepalen van de beste paring partner 1 zijn. Chemosensation is vaak verdeeld in twee zintuiglijke componenten: reukzin en smaak zintuigen. Een belangrijk kenmerk van deze zinnen is dat olfactie (reuk) wordt gebruikt om de omringende gasvormige chemische omgeving tijdens proeven gustation (smaak) fysiek contact met een niet-vluchtig substraat vereist. Zowel sensorische modaliteiten stimuleren neurologische reacties die worden verwerkt en gedecodeerd in de hersenen om de juiste aantrekkelijk of afstotende gedrag 2 produceren. Deze zintuigen zijn daarom van cruciaal belang voor de overleving van dieren.
De vrucht Drosophila melanogaster is een model organisme dat groeit in populariteit voor gebruik in begrijpening hoe insecten waarnemen geur en smaak. Fruitvliegen bieden enorme voordelen boven andere modelsystemen te wijten aan de rijkdom van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor de dissectie van de moleculaire, cellulaire en gedrags paden. Het werk van de afgelopen 15 jaar heeft vooral instrumenteel in het karakteriseren van de specifieke cellulaire identiteiten, neuronale receptoren en signalering mechanismen die betrokken zijn bij zowel de geur en smaak zijn. Nu wordt het vermogen van Drosophila genetica worden gebruikt om verder te ontrafelen hoe deze processen worden gecodeerd op één neuron en enkel circuit niveau 3-6. Daarom testen die voorzien gemakkelijk scoorde uitlezingen van wijzigingen aan de sensorische wegen zijn van vitaal belang voor de aanhoudende opmars van deze gebieden.
Hoewel veel bekend over hoe olfactorische signalen worden gecodeerd en verwerkt in de hersenen, is veel minder begrepen land dezelfde mechanismen in de smaak route. We beschrijven hier een protocol dat kan worden gebruikt om smaak preferen vernemence in Drosophila. Drosophila, zoals zoogdieren, in het algemeen de voorkeur aan zoete smaak verbindingen in tegenstelling tot bitter smakende verbindingen. Elke combinatie van deze voedselbronnen kunnen worden gebruikt in deze proefopzet te bepalen hoe bekende genetische veranderingen beïnvloeden smaak keuze. Bovendien kunnen farmacologische interventiestrategieën eveneens worden beoordeeld op hun effect op smaak dieren voorkeur. Het gemak en flexibiliteit van deze test maakt het een nuttig model voor het begrijpen van de aard van smaak- perceptie bij Drosophila.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Honger
- Bereid je honger flesjes vliegen verzadigen een katoenen bal met 18,2 MQ water op de bodem van een standaard vlieg flacon. Als alternatief, net verzadigen een smalle strook filterpapier met 18,2 MQ water en plaats onder een hoek binnen het flesje.
- Verzamel vliegt in sets van ~ 100 dieren op een CO 2 pad en voeg vervolgens de vliegen om een voorbereide flacon.
Opmerking: De beste resultaten worden bereikt met dieren die minder dan 5 dagen oud zijn. Echter, de exacte leeftijd van de dieren worden bestuurd als een experimentele variabele smaakveranderingen voorkeur boven te bepalen. - Gebruik een watje of schuim stop te beveiligen de flesjes gesloten. Plaats flesjes op hun kant op een milieuvriendelijke gecontroleerde incubator. Handhaaf de temperatuur bij 25 ° C en de vochtigheid boven 70%. Laat flacons onaangeroerd gedurende 24 uur.
2. Taste Voorkeur Assay
- Bereid alle tastants de assay op dezelfde dag eens testen.
Opmerking: De exacte tastants om gebruikt te worden zal variëren afhankelijk van de experimentele vraag wordt gesteld. De volgende voorbeeld tastants gebruikt in dit protocol. Zie hoofdstuk 4 voor optimalisaties.- Bereid controle tastant (1 mM sucrose) door het combineren van 10 pi van 100 mM sucrose-oplossing, 13 ul van rode kleurstof, en 977 ul van 18,2 MQ water.
- Bereid experimentele tastant (5 mM sucrose) door het combineren van 50 pi van 100 mM sucrose-oplossing, 10 ul van blauwe kleurstof, en 940 ul van 18,2 MQ water.
- Voeg assay kamers met een standaard 100 mm x 15 mm plastic petrischaal bereid op de volgende wijze:
- Plaats drie 10 ul druppels controle tastant dichtst bij de rand van de plaat bij 00:00 en nog 3 druppels op 06:00. Waarborgen dat de afstand tussen de druppels vergelijkbaar.
- Plaats drie 10 ul druppels experimentele tastant dichtst bij de rand van de plaat bij 03:00 en eenandere 3 druppels op 9:00. Waarborgen dat de afstand tussen de druppels vergelijkbaar.
- Herhaal stap 2.2.1 en 2.2.2 voor zo veel herhalingen als gewenst.
- Lege 1 flesje van ~ 100 uitgehongerd vliegt op een CO 2 pad net lang genoeg om alle dieren (ongeveer 10 sec) verdoven. Borstel de dieren in het midden van een voorbereide test kamer en dek af met de schotel deksel.
Opmerking: Langere periodes van CO 2 blootstelling moet worden vermeden om de hersteltijd en te beperken verstoring van het eetgedrag te verbeteren. Blootstelling aan ijs (~ 5 min) worden gebruikt voor het verdoven van CO 2 gedragseffecten die zich bij zelfs beperkte blootstelling vermijden. - Plaats de analysekamer in een ondoorzichtige kartonnen doos. Zorg ervoor dat de buitenkant van de doos label met de aandoening en genotype wordt getest.
- Plaats de volledige setup (analysekamer opgenomen in kartonnen doos uit stap 2.4) in een 25 ° C incubator met ten minste 70% vochtigheid gedurende 2 uur.
- Herhaal stap 2,3 tot 2,5 voor alle replicaten.
- Na 2 uur, plaats de assay kamers, nog steeds verspreid kartonnen dozen, rechtstreeks in een -20 ° C vriezer tot klaar voor kwantificering.
3. Taste Voorkeur Assay kwantificering
- Sta een analysekamer opwarmen tot kamertemperatuur (ongeveer 5 min).
- Onder een dissectie microscoop, met een kwast of tang, groep dieren basis van de kleur van de buik: rood, blauw, paars of duidelijk (figuur 1).
- Noteer het aantal dieren in elke groep. Overweeg duidelijk dieren die niet hebben deelgenomen aan de test en dus ze niet op in berekeningen.
- Bereken de voorkeur index volgens een van de volgende vergelijkingen:
- Als de experimentele tastant van de rente wordt toegevoegd aan de rode kleurstof, gebruik dan (N rood + 0,5 N paars) / (N + N rood blauw + N purple).
- Als de experimentele tastant wordt toegevoegd aan de blauwe kleurstof, pas dan de vergelijking (N blauw + 0,5 N paars) / (N blauw + N rood + N paars).
- Herhaal de berekeningen voor alle experimentele condities en herhalingen.
4. Optimalisering van de Smaak voorkeur Assay
- Empirisch bepalen van de concentratie van de kleurstof indicatoren die moeten worden gebruikt, zodat kleurstof heeft geen invloed op de uitkomst van de smaak test, als volgt:
- Bereid 4 tastants met dezelfde base verbinding (bijvoorbeeld 5 mM sucrose) zoals aangegeven in stap 2.1, maar laat de kleurstof.
- Voeg 1,3% rode kleurstof aan één van de tastants. Voeg de resterende 3 tastants met blauwe kleurstof van variërende concentraties in elke buis (bijvoorbeeld 0,6%, 1% en 1,3%).
- Compleet protocol stappen 2.2 tot 3.4 voor elke tastant pair: 1,3% versus 0,6% rood blauw; 1,3% red vs. 1% blauw en1,3% rode vs. 1,3% blauw.
- Herhaal stap 4.1.1-4.1.3 met verschillende percentages van blauwe kleurstof totdat de index voorkeur gemiddeld een waarde van 0 (figuur 2).
Let op: Als uitgangspunt, 1,3% rode kleurstof in combinatie met 1% blauwe kleurstof meestal goede resultaten oplevert. Indien geen bevredigende concentratie van blauwe kleurstof kan worden aangepast aan 1,3% kleurstof, dan stap 4.1.1 tot 4.1.3 kan worden herhaald met verschillende concentraties van rode kleur en een constante concentratie van blauwe kleurstof. - Analyseren van alle voorwaarden waaraan moet worden getest met dezelfde geoptimaliseerde kleurstof concentraties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Enkele typische resultaten van smaak voorkeur assays worden hieronder weergegeven. In de meeste experimenten enige variatie in de intensiteit van abdominale kleuring wordt waargenomen (figuur 1). Elke kleurstof in de buik of intens of zwak wordt als positief inslikken. Het verdient daarom aanbeveling dat onderzoekers dieren, terwijl blind voor de experimentele conditiescore teneinde mogelijke vertekeningen beperken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben beschreven een eenvoudige maar effectieve protocol voor het bepalen van de smaak voorkeur in Drosophila. Versies van deze test worden routinematig gebruikt in experimenten om de bijdragen van smaak receptoren (GR) vast te stellen in het waarnemen van de verschillende kwaliteiten (bitter, zoet, zuur, zout en umami) van smaak verbindingen. De Drosophila genoom bevat ongeveer 60 genen die 68 geïdentificeerde smaak receptoren coderen door alternatieve splicing 8,9. Echter, andere eiwit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We willen de leden van het Tessier-lab bedanken voor het kritisch lezen van dit manuscript en de nuttige suggesties tijdens de voorbereiding van dit protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Blauwe voedselkleurstof (Water, Propyleenglycol, FD&C Blue 1 en Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Vriesdozen zonder Verdelers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glazuur Azijnzuur | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscoop | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petrischaal (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Herbruikbaar indien grondig gewassen en gedroogd |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Rode voedselkleurstof (Water, Propyleenglycol, FD&C Reds 40 en 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
Referenties
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
