Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo's

Samenvatting

Een nieuwe techniek voor de detectie van lage abundantie endogeen receptoren aanwezig in zebravis embryo's wordt beschreven. We hebben het AFLIP genoemd omdat het bestaat uit affiniteitslabeling van de receptor door zijn ligand gekoppeld aan immunoprecipitatie.

Samenvatting

Door de krachten van Affiniteit Labeling en Immunoprecipitatie (AFLIP) te combineren, is een techniek voor de detectie van receptoren met lage abundantie in zebravis-embryo's geïmplementeerd. Deze techniek maakt gebruik van de selectiviteit en gevoeligheid die wordt geboden door affiniteitslabeling van een bepaalde receptor door zijn ligand met de specificiteit van de immunoprecipitatie. We hebben AFLIP gebruikt om de type III TGF-β-receptor (TGFBR3), ook bekend als betaglycan, te detecteren tijdens de vroege ontwikkeling van zebravissen. AFLIP was cruciaal bij het valideren van de werkzaamheid van een TGFBR3-morfant zebravis-fenotype. In de eerste stap worden eiwitextracten van embryo's bereid en gebruikt om ¹²⁵I-TGF-β2-TGFBR3-complexen te genereren die worden gezuiverd door immunoprecipitatie. Later worden deze complexen covalent gekruisverband en onthuld met behulp van SDS-PAGE-scheiding en autoradiografiedetectie. Deze techniek vereist de beschikbaarheid van een gelabeld ligand voor, en een specifiek antilichaam tegen, de te detecteren receptor, en kan eenvoudig worden aangepast om elke groeifactor- of cytokine-receptor te identificeren die aan deze vereisten voldoet.

Inleiding

Specifieke detectie van eiwitten die tot expressie worden gebracht tijdens de embryonale ontwikkeling is vereist om expressieprofielen te valideren die zijn verkregen door hun cognate mRNA's te meten met RT-PCR of in situ hybridisatie (ISH). Dit wordt meestal bereikt door een western blot van embryo-extracten gevolgd door detectie met specifieke antilichamen. Deze benadering is echter moeilijk toe te passen op eiwitten die in zeer lage abundantie voorkomen, of die eigenschappen hebben die hun kwantitatieve overdracht tijdens het blotting belemmeren. Betaglycan, ook bekend als de type III transformatorgroeifactor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is een voorbeeld van deze moeilijkheden. TGFBR3 is een deeltijds membraan-proteoglycaan dat TGF-β bindt via zijn kernproteïne¹, met een opmerkelijk hogere affiniteit voor de isovorm TGF-β2, een eigenschap die het onderscheidt van alle andere TGF-β-bindende eiwitten². TGFBR3 in de zebravis wordt tot expressie gebracht vanaf 8 hpf, met een maximum bij 72 hpf, zoals gedetecteerd door RT-PCR van zijn mRNA³.

Ondanks de beschikbaarheid van een zeer specifiek antilichaam³, was elke poging om zijn vertaalde product door middel van western blot te detecteren, niet succesvol. Uitgaande van het feit dat de proteoglycaan-aard van TGFBR3, evenals de veronderstelde lage abundantie, verantwoordelijk kunnen zijn voor dit falen, werd een detectiemethode, AFLIP, bedacht die gebruik maakt van de hoge affiniteit van TGFBR3 voor TGF-β2. In deze methode wordt een eiwitextract van gepoolde embryo's toegestaan ​​om specifiek te binden aan ¹²⁵I-gelabelde TGF-β2 en de receptor-ligandencomplexen worden gezuiverd door immunoprecipitatie en gekruist voordat ze worden gescheiden door SDS-PAGE. De migratiepatronen die werden waargenomen door autorradiografie van de gels onthulden de aanwezigheid en de aard van de gelabelde receptorspecies. Deze aanpak combineert de ligandspecificiteit van affiniteitslabeling met immunoprecipitatie door specifieke antilichamen, waardoor het detectiebereik wordt vergroot en de inefficiënte overdracht van TGFBR3 wordt vermeden. Vanwege zijn inherente eigenschappen is de AFLIP-test geen kwantitatieve test, maar kan deze worden gebruikt om met vertrouwen relatieve experimentele verschillen in de geanalyseerde receptor te meten.

Protocol

Alle experimenten uitgevoerd bij dieren uitgevoerd werden goedgekeurd door het Comité voor Laboratory Animal Care en gebruik van de Autonome Nationale Universiteit van Mexico (UNAM), in het kader van de CICUAL-protocol nummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autònoma de México").

1. Bereiding van Embryo Protein Extract

1. Verzamel 100-200 embryo's voor elke voorwaarde om te vergelijken (morphants vs. wild-type) op de gewenste stadium, bijvoorbeeld 72 uur na de bevruchting (HPF).
2. Plaats embryo's in Petri gerechten met vis water (zie tabel 1) en handmatig dechorionate embryo's met behulp van fijne punt tang. Gebruik geen pronase tijdens deze stap (of een ander protease gehele protocol) omdat de beoogde receptor kunnen verteren.
3. Plaats embryo in een 1,5 ml microfugebuis en was embryo twijs met 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) (zie tabel 1).
4. Voeg 500 pl deyolk buffer (zie tabel 1).
5. Vrijgeven meeste dooier door zachtjes en neer te pipetteren (ongeveer 30-40 keer) de embryo's in de oplossing. Voor 72 HPF en 48 HPF embryo's te gebruiken blauw en geel pipetpunten, respectievelijk. Gele tips kan nodig zijn om iets te snijden om te voorkomen dat het vernietigen van embryo's. De succesvolle dooier vrijlating kan worden gecontroleerd door het observeren van embryo's onder de microscoop.
6. Verzamel embryo door centrifugatie bij 600 g gedurende 15 sec.
7. Gooi supernatant voorzichtig met een pipet.
8. Wassen embryo tweemaal met 500 ui wasbuffer (zie tabel 1) door voorzichtig vortexen op de laagste snelheid.
9. Verzamel embryo door centrifugatie bij 600 g gedurende 15 sec.
10. Vanaf hier, blijven de procedure bij 4 ° C.
11. Gooi supernatant voorzichtig met een pipet.
12. Resuspendeer embryo's in 350 ul lysisbuffer (zie tabel 1) en homogeniseer met een plastic stamper.
13. Incubeer 30 min gelyseerd embryo onder schudden op een reageerbuis rocker bij 4 ° C.
14. Centrifugeer gelyseerd embryo bij 11.000 g gedurende 15 minuten om onoplosbare resten te verwijderen.
15. Overdracht heldere supernatant met een pipet naar een nieuwe buis.
16. Vaststellen van totaal eiwit door Bradford eiwittest ⁴ of een andere geschikte procedure. Als Bradford assay wordt gebruikt, voert de ijkcurve in aanwezigheid van equivalente concentraties van detergentia in de lysisbuffer mocht een onderschatting van de eiwitstandaard ⁴ veroorzaken.

2. Detectie van endogene Receptor Protein

1. Affiniteit Labeling en Immunoprecipitatie (al deze stappen bij 4 ^° C)
   1. Place 400-500 ug totaal eiwit embryo in een 1,5 ml microfugebuis en verdun tot 1 ug / ul met buffer 1 (zie tabel 1).
      Let op: Met het oog op het verkrijgen van 500 ug totaal embryo eiwit, ongeveer 100-200 embryo's moeten in eerste instantie worden verwerkt. 72 HPF embryo routinematig op ~ 5 ug totaal eiwit embryo, wat voldoende is voor betaglycan detectie.
   2. Voeg voldoende hoeveelheid gelabeld TGF-β2 voorraad tot een eindconcentratie van 150 pM bereiken en incubeer onder schudden op een reageerbuis rocker 2 uur bij 4 ° C. TGF-β2 moeten worden geëtiketteerd voordat AFLIP wordt gestart met ¹²⁵ I de chlooramine T methode, beschreven Cheifetz et al. ^5.
      LET OP: Gebruik afscherming om blootstelling te minimaliseren tijdens het hanteren van ¹²⁵ ik gemerkt ligand.
   3. Voeg voldoende volume onverdunde antilichaam tegen de receptor van belang om ook in een 1: 100 verdunning en verder incubatie gedurende nog 2 uur bij 4 ° C (incubatie kan O / N). Dit is de optimale verdunning van antiserum # 31, die in deze studie en elders ^3, maar afhankelijk van de kwaliteit van eentibody, een grotere of kleinere verdunning optimaal zijn.
   4. Voeg 50 ul van geschikte immunoglobuline bindende kralen (bijvoorbeeld G-eiwit-Sepharose, die voorheen TNTE werd geëquilibreerd en opnieuw gesuspendeerd 1: 5 van het oorspronkelijke volume in TNTE) en incubeer gedurende 50 min onder roeren op een reageerbuis rocker bij 4 ° C.
   5. Herstel de kralen door microcentrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 sec.
   6. Gooi supernatant in een geschikt radioactief afval container.
   7. Was de IP-parels driemaal met 1 ml van IP wasbuffer (zie Tabel 1), door wervelen en microcentrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 seconden per keer.
   8. Resuspendeer IP-kralen in 250 ul IP wasbuffer.
   9. Voeg 1,5 pl disuccinimidylsuberaat (DSS, opgelost in DMSO bij 10 mg / ml). Bereid de DSS oplossing vlak voor het gebruik ervan in deze stap.
   10. Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C onder roeren.
   11. Teneinde de verknopingsreactie te blussen, voeg 500 ul of IP wasbuffer, aangevuld met voldoende Tris-Cl pH 7,4 voorraad tot 25 mm Tris-Cl te bereiken. De vrije amino-groepen in Tris vangen ongereageerd DSS.
   12. Centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 20 seconden aan IP-kralen te verzamelen en gooi supernatant.
   13. Resuspendeer IP-kralen in 30 ul reducerende Laemmli buffer.
   14. Kook monsters 5 min bij 94 ° C.
   15. Eventueel analyseren monsters in een gammateller behulp protocol van de fabrikant.
2. monsteranalyse
   1. Onderworpen monsters denaturerende SDS-PAGE. Gebruik polyacrylamide op het juiste percentage van de massa van de receptor en werking gel onder standaardprocedure.
   2. Dompel gel in fixatief (zie tabel 1) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Was de gel met gedestilleerd water gedurende 15 min.
   4. Plaats de gel in eerder gehydrateerd filter papier en dek af met saran wrap film.
   5. Droge gel bij 80 ° C gedurende 1 uur.
   6. Expose gel op een witte fosforimager screen bij RT O / N.
   7. Scan blootgesteld scherm met behulp van een fosforimager met behulp van het protocol van de fabrikant.

Resultaten

Figuur 1 toont een representatief resultaat verkregen met AFLIP. Signalen in baan 1 uit de ^125I-ligand covalent gebonden aan ofwel de zebravis betaglycan kerneiwit (BG kern onder de 150 kDa marker) of BG kern die aan zijn proteoglycan vorm verwerkt door bevestiging van glycosaminoglycanen (GAG, uitstrijkje variërend van 170 kDa tot de bovenkant van de gel). Het migratiepatroon, een scherpe kerneiwit en een besmeurd proteoglycan (door heterogeniteit in de lengt...

Discussie

Het gebruik van Western blots met een specifiek antilichaam tegen een eiwit van belang een waardevol instrument zijn expressie ⁷ bestuderen tijdens embryogenese. Echter, immunoblotting van sterk geglycosyleerde eiwitten niet erg succesvol geweest vanwege hun inefficiënte overdracht en zwakke binding aan nitrocellulose of PVDF-membranen ^8,9.

Proteoglycanen zijn een goed voorbeeld van deze tekortkoming, vanwege hun covalent gehecht glycosaminoglycan ketens (GAG), die nega...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Disuccinimidyl suberaat (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gammateller	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix