Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Summary

Hier wordt een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem de effecten van streptolysine S, een uitgescheiden toxine geproduceerd door Groep A Streptococcus bestuderen op keratinocyten beschreven. Dit systeem kan eenvoudig worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden bacteriële eiwitten op verschillende types gastheercel tijdens infectie.

Abstract

Veel bacteriële pathogenen uitscheiden potente toxines te helpen bij de afbraak van gastheerweefsel te signaleren veranderingen in gastheercellen te veroorzaken voor immuunreacties manipuleren tijdens infectie. Hoewel werkwijzen ontwikkeld om succesvol zuiveren en produceren vele van deze belangrijke virulentiefactoren zijn er nog vele bacteriële toxinen waarvan de unieke structuur of extensieve posttranslationele modificaties ze moeilijk te zuiveren en studie in vitro systemen. Zelfs als zuivere toxine kan worden verkregen, zijn er veel problemen verbonden aan het bestuderen van de specifieke effecten van een toxine onder relevante fysiologische omstandigheden. De meeste in vitro celcultuur modellen om de gevolgen van uitgescheiden bacteriële toxines op gastheercellen omvatten evalueren incuberen gastheercellen met een eenmalige dosis toxine. Dergelijke methoden slecht bij benadering wat gastheercellen eigenlijk ervaring tijdens een infectie, waar de toxine voortdurend wordt geproduceerd doorbacteriële cellen en men liet ze hopen zich in de loop van de infectie. Dit protocol beschrijft het ontwerp van een permeabel membraan insert gebaseerde bacteriële infectie systeem om de effecten van streptolysine S, een potent toxine geproduceerd door groep A Streptococcus, menselijke epitheliale keratinocyten bestuderen. Dit systeem nauwer bootst de natuurlijke fysiologische omgeving tijdens een infectie dan methoden waarbij pure toxine of bacteriële bovenstaande vloeistoffen direct worden toegepast op gastheercellen. Belangrijk is dat deze werkwijze elimineert ook de voorspanning van gastheerreacties die als gevolg van directe contact tussen de bacteriën en gastheercellen. Dit systeem is gebruikt om de effecten van streptolysine S (SLS) op gastheer membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid en cellulaire signalering reacties kunnen beoordelen. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden virulentiefactoren op verschillende zoogdierlijke soorten gastheercel de specifieke rol van een uitgescheiden bacteriële factor d onderzoekenijdens het verloop van de infectie.

Introduction

Inzicht in de functie van bacteriële virulentiefactoren in het kader van de gastheercel infectie is een belangrijke focus van bacteriële pathogenese onderzoek. Veel bacteriële pathogenen actief scheiden toxines en andere oplosbare factoren die helpen bij de vernietiging van gastheerweefsel te signaleren veranderingen in gastheercellen te veroorzaken voor immuunreacties manipuleren tijdens infectie ^1-10. Hoewel werkwijzen ontwikkeld om succesvol zuiveren en produceren vele van deze belangrijke virulentiefactoren voor studie, sommige bacteriële producten hebben unieke structuren of extensieve posttranslationele modificaties die hen recalcitrante kandidaat zuiveringsmethoden maken en kan dus niet worden onderzocht geïsoleerd middels in vitro systemen . Bijvoorbeeld, groep A Streptococcus, de bacteriële verwekker voor een groot aantal infecties variërend van faryngitis tot necrotiserende fasciitis en toxische shocksyndroom, produceert een uitgescheidenbacteriële toxine bekend als streptolysine S (SLS) ^11-17. Deze ribosomaal geproduceerde peptide wordt gecodeerd door de streptolysine S geassocieerde gen (sag) cluster en het rijpe product wordt geschat op 2,7 kDa in grootte ^14-17. De protoxine, gecodeerd door saga, wordt gewijzigd post-translationeel door verschillende enzymen (SAGB, SAGC en SAGD) naar de rijpe, functionele vorm te produceren ^15-17. De complexiteit van deze post-translationele modificaties in combinatie met ongewone aminozuurvolgorde het toxine hebben het toxine onverenigbaar met alle zuivering en structuuropheldering inspanningen die geprobeerd hebben tot op heden ^15,17 teruggegeven. Deze uitdagingen zijn ingewikkeld inspanningen om de specifieke rol van deze toxine in gastheer pathogenese bepalen.

Wanneer de bereiding van toxines of andere uitgescheiden factoren om complexe onmogelijk, mechanismenophelderen van de functie van deze producten zijn van oudsher onderzocht door de bereiding van gefilterde bacteriële supernatanten, die vervolgens worden toegepast om gastheercellen ^18-20. Er zijn verscheidene problemen geassocieerd met deze techniek. Eerste, veel van deze uitgescheiden factoren, zoals SLS, houden geen maximale en constante activiteit wanneer bewaard en toegepast om gastheercellen later. Bovendien, wanneer supernatanten op één tijdstip worden verzameld en daarna op gastheercellen, is het moeilijk om fysiologische relevantie te bepalen en directe conclusies over het natuurlijke infectieproces, waarbij uitgescheiden factoren mogen accumuleren tijdens infectie een trekken fysiologisch relevante concentratie. Dit tweede probleem geldt niet alleen voor het gebruik van bacteriële supernatanten, maar ook voor het gebruik van de toxines in gastheercel studies ^{1 - 3,8.} Om deze problemen, een permeabel membraan inse pakkenrt-gebaseerde infectiesysteem is ontwikkeld om de effecten van SLS op gastheercellen op een manier die optimale toxine activiteit behoudt, en voorkomt dat de variabele direct contact tussen bacteriën en gastheercellen beoordelen. In dit systeem worden menselijke epitheliale cellen gekweekt in een monolaag in de onderste kamer van een tweekamer goed en bacteriën worden ingebracht in de bovenste kamer van dezelfde put. Een poreus membraan (0,4 urn poriën) scheidt de bovenste en onderste kamers, waardoor uitgescheiden die moeten worden uitgewisseld tussen de twee kamers, maar het passeren van bacteriën. Dit systeem heeft het mogelijk gemaakt voor een effectieve evaluatie van de gastheer reacties die uitsluitend zijn te wijten aan aanhoudende uitgescheiden bacteriële componenten terwijl het elimineren van alle reacties die kunnen optreden door direct contact tijdens Groep A streptokokken-infectie. Hoewel andere uitgescheiden bacteriële factoren naast SLS ook door het poreuze membraan kan passeren, het gebruik van een isogene mutant panel inclusief wild-type (WT), een SLS-knockout (ΔsagA) en een Saga aangevuld stam (ΔsagA + SAGA) zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de gastheer reacties die strikt SLS-afhankelijke ^21.

Hoewel vergelijkbaar permeabel membraan insert systemen zijn toegepast voor het onderzoek van uitgescheiden factoren betrokken bij virale infecties, kanker biologie en immune celmigratie ^22-26, weinig studies met bacteriële interacties met gastheercellen hebben deze benadering ^6,27,28 gebruikt. Zelfs studies die dergelijke systemen gebruikt om interacties tussen bacteriën en gastheercellen staand zijn voornamelijk gericht op migratie van ontstekingscellen of bacteriën door een epitheliale of endotheliale monolaag uitgeplaat op de permeabele membraan insert. Het permeabele membraan insert gebaseerde infectiesysteem hierin beschreven is een eenvoudige en effectieve methode die is gebaseerd op de scheiding van bacteriën en gastheercellen via een poreus membraan de effe beoordelencts van de uitgescheiden toxine, SLS, op host membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid, cellulaire signaaltransductie en uitgescheiden gastheercel factoren. Deze techniek kan worden aangepast aan de studie van andere uitgescheiden virulentiefactoren op verschillende zoogdierlijke soorten gastheercel om de rol van een specifieke bacteriële factor in de loop van een infectie te onderzoeken.

Protocol

1. bacteriekweek

1. Genereren isogene mutante stammen worden gebruikt voor de studie van de specifieke afgegeven factor van belang ^21.
   Opmerking: De GASM1T1 5448 stammen gebruikt voor deze experimenten opgenomen WT GAS ', een Saga Δ kat SLS-deficiënte mutant (afgekort in tekst als Δ Saga), en een Saga aangevuld stam (afgekort in tekst als Δ Saga + Saga) ^21.
2. Bereid overnacht vloeibare culturen van bacteriestammen van belang. Groeien GAS M1T1 5448 stammen -10 ml Todd-Hewitt bouillon bij 37 ° C gedurende 16-20 uur vóór infecteren humane cellen.
3. Centrifuge overnacht bacterieculturen (2400 RCF gedurende 10 min) en resuspendeer in verse bacteriële medium.
   Opmerking: Resuspension in hetzelfde volume als de overnacht kweken in (5-10 ml) werden gekweekt algemeen produceert een gewenste initiële optische dichtheid.
4. Normaliseren bacterieculturen aangelijke uitgangspunt concentraties door verdunning van de geresuspendeerde kweken in toegevoegde bacteriële medium tot dezelfde optische dichtheid bij 600 nm (OD ₆₀₀₎ wordt verkregen voor alle stammen te testen _(OD600 van ongeveer 1,0 aanbevolen wordt genoemd).
   Opmerking: In deze studies werden stationaire fase bacterieculturen gebruikt om gastheercellen te infecteren onmiddellijk na normalisering. Echter, zoals sommige bacteriestammen exit stationaire fase nonsynchronously kan het beter zijn om te beginnen gastheer infecties met log-fase culturen als dit wordt gevonden om het geval voor de stammen van belang zijn.
5. Voordat er verdere analyse uitvoeren van een kolonie tellen bepaling om de kolonievormende eenheden (CFU) per milliliter in de startcultures vastleggen, zodat de multipliciteit van infectie (MOI) of verhouding van bacteriën per gastheercel, kan worden bepaald.
   1. Bereid 1 ml seriële verdunningen van bacterieculturen die zijn genormaliseerd naar de gewenste optische verbty in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of geschikte bacteriële groeimedium (Todd-Hewitt bouillon werd gebruikt in deze studies). Bereid verdunningen variërend van 10 tot 10 ^{-1 -6} tenminste één set agarplaten met telbare kolonies (30-300 kolonies) produceren. Voer alle verdunningen in drievoud.
   2. Breng 100 pi van elke seriële verdunning op een agarplaat met passende medium voor de bacteriële soorten worden geanalyseerd.
      Opmerking: Todd-Hewitt agar werd gebruikt in deze studies.
   3. Gebruik een glazen of plastic bacteriële spreader gelijkmatig over het gehele oppervlak van de agarplaat distribueren 100 pl monster, en verder verspreiden totdat de vloeistof in de agar geabsorbeerd. Presteren onder vlam met steriele techniek.
   4. Incubeer de agar platen bij 37 ° C geïncubeerd of totdat telbare kolonies verschijnen.
   5. De kolonies die groeien op elke plaat en bereken de CFU / ml in de oorspronkelijke cultuur door formula: aantal kolonies x inverse van de seriële verdunning / cultuur volume verzilverd in milliliters.
      bijvoorbeeld (200 kolonies x 1/10 ^-5 verdunning) / 0,1 ml uitgeplaat = 2,0 x 10 ⁸ CFU / ml

2. Host Cell Culture

1. Verkrijg een geschikte gastheer cellijn voor de gewenste analyses.
   Opmerking: HaCaT menselijke epitheliale keratinocyten ^29, een vriendelijke gift van V. Nizet werden gebruikt voor deze studies.
   1. Handhaven HaCaT cellen in 100 mm kweekschalen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2.

3. Host Cell Infectie met permeabel membraan Insert System

1. Plaat cellen in de juiste weefselkweek gerechten en hen in staat stellen om te groeien tot ze 90% confluentie bereiken.
   Opmerking: De HaCaT cellen die in deze studies gewoonlijk bereikt binnen 2-3 confluentie degen na plateren.
   1. Voor lysaat inzameling (bijv signalering analyse en adenosine trifosfaat (ATP) bepaling assays), plaat HaCaT cellen in 6 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 3 x 10 ⁵ cellen / putje.
   2. Voor immunofluorescentie imaging experimenten, plaat cellen op steriele dekglaasjes binnen 6 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 3 x 10 ⁵ cellen / putje.
   3. Voor ethidiumhomodimeer membraan permeabilisatie en lactaat dehydrogenase (LDH) vrijgave assays, plaat HaCaT cellen in 24 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 5 x 10 ⁴ cellen / putje.
2. Onmiddellijk voorafgaand aan behandeling, was cellen met 1x steriele PBS.
3. Solliciteer vers groeimedium aan cellen. Voor de hier beschreven voorwaarden van toepassing 2 ml medium per putje voor 6 well platen of 0,5 ml medium per putje voor 24 well platen. Als farmacologische behandelingen worden getest, mengen met vers medium en toe te passen in deze step.
   Opmerking: Sommige tests kunnen alternatieve media vereisen. Bijvoorbeeld zoals fenolrood en hoge serumconcentraties interfereren met de LDH-afgifte assay, fenolrood-vrij DMEM aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA) (w / v), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat was gebruikt voor deze experimenten.
4. Na vers medium is aangebracht, plaatst u voorzichtig een steriel 0,4 urn permeabel membraan insert in elk putje. Voer deze stap in een laminaire stroming kap, en het gebruik van een steriel pincet om het doorlaatbare membraan insert te zetten in elk putje.
5. Toepassen vers celcultuurmedium om de bovenste kamer van elk putje volgens de instructies van de fabrikant. Voor de hier beschreven voorwaarden van toepassing 1 ml medium per putje voor 6 well platen of 0,1 ml medium per putje voor 24 well platen.
6. Breng een geschikt volume van genormaliseerde bacterieculturen (zie punt 1) om de bovenste kamer van de permeabel membraan insert systeem. Gebruik bacteriële medium voor niet-geïnfecteerde control behandelingen. Voor de hier beschreven resultaten, voeg 25 ul van de genormaliseerde culturen per kamer gedurende 24 putjesplaten en voeg 100 ul van de culturen per kamer voor 6 well platen.
   Opmerking: In deze studies, wild-type of mutant GAS aangebracht aan gastheercellen bij een MOI van 10. MOI werd berekend op basis van de uiteindelijke eukaryotische cel aantallen (bv 2 x 10 ⁶ cellen / putje), zodanig dat 10 keer zoveel bacteriën per gastheercel werden bij het ​​begin van de infectie periode (bijvoorbeeld 2 x 10 ⁷ CFU per putje). Geschikte MOI zal variëren met verschillende bacteriële soorten en de gewenste follow-up analyses.
   Opmerking: Naast het gebruik van bacteriële medium voor geïnfecteerde controles andere nuttige besturingen voor bepaalde toepassingen van deze techniek kunnen hitte gedode bacteriën of verbruikte bacterieel medium voor vergelijking.
7. Incubeer geïnfecteerde cellen bij 37 ° C met 5% _CO2.

4. Sample Collection

1. Om celkweekmedium, gastheercellysaten of dekglaasjes verzamelen met intacte cellen voor de follow-up analyses, te beginnen door het zorgvuldig verwijderen van de permeabel membraan insert met een steriel pincet.
2. Voor de beoordeling van uitgescheiden Host protiens:
   1. Verzamel het medium uit de onderste kamer in 1,5 ml buizen. Vermijd de monolaag te storen tijdens het verzamelen.
   2. Centrifugeer monsters bij 14.000 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
   3. Verwijder alles behalve 50 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buisje en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk gebruik.
3. Voor de beoordeling van Host Cell Lystates:
   1. Zuig het medium boven de monolaag van gastheercellen. Vermijd het verstoren van de monolaag, omdat dit kan leiden tot een monster verlies.
   2. Spoel cellen eenmaal met 1x PBS.
   3. Zuig PBS. Onmiddellijk breng een geschikt volume ijskoude lysis buffer tot de gewenste eiwitconcentratie bereiken, en incubeer demonsters op ijs gedurende 15 min. Toepassing tussen 200 pl en 350 pl lysisbuffer per putje van elke plaat met 6 putjes bij proteïneconcentraties tussen 0,5 en 1,5 mg / ml te bereiken.
      Opmerking: De lysis buffer gebruikt in deze studie bestond uit gedeïoniseerd water, 1% (v / v) Nonidet P40 plaatsvervanger, een fosfatase-inhibitor cocktail en een cocktail van proteaseremmers. Specifieke reagentia zijn vermeld in de sectie materialen en apparatuur.
   4. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken van het plaatoppervlak van elk putje en pipet de volledige inhoud van elk putje in een 1,5 ml buis.
   5. Centrifugeer monsters bij 14.000 RCF gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
   6. Oplosbare lysaat onderdelen te beoordelen, verwijder het supernatant naar een nieuwe buis en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken.
   7. Nucleaire of andere onoplosbare lysaat componenten te evalueren, behouden de pellet en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken.
4. Voor Beoordeling door Immunofluorescentie Imaging:
   1. Alspiraat medium en was cellen in 1x koude PBS.
   2. Fix cellen overnacht in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS-oplossing (w / v).
      Noot: In deze studies, 1 ml PFA werd toegevoegd per putje van elke plaat met 6 putjes.

5. Aanbevolen toepassingen

1. Host signaaltransductie analyse door SDS-PAGE en Western Blotting
   1. Verzamel gastheercellysaten zoals beschreven in paragraaf 4.3.
   2. Bepaal de eiwitconcentratie van elk monster lysaat van bicinchoninezuur (BCA) assay of gelijkwaardige behulp eiwitstandaarden ^30.
   3. Normaliseren eiwit concentraties van de monsters voorafgaand aan het laden en draaien van de monsters op een 4-15% polyacrylamidegel of passende alternatieve ^31.
      1. Normaliseren monster concentraties door pipetteren hetzelfde eiwit hoeveelheid van elk monster (bijvoorbeeld 20 ug) in een nieuwe 1,5 ml buis en het toevoegen van variabele volumes van lysis buffer (buffer volume = totaal volume - monstervolumetoegevoegd) aan elke buis tot het totale volume (bijvoorbeeld 50 pi) en uiteindelijke eiwitconcentratie in gelijke monsters te maken.
   4. Doorvoermonsters een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (of gelijkwaardig). Voor de hier beschreven resultaten, doorvoermonsters bij 25 volt gedurende 2 uur voor het verhogen van de spanning tot 70 volt gedurende nog 45 min. Gebruik overdracht buffer bestaat uit 200 mM Tris-base, 1,5 M glycine en 20% methanol (v / v) in gedemineraliseerd water.
   5. Blok membranen in 5% BSA + 0,1% Tween 20 in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS). Dienovereenkomstig aan te passen gebaseerd op aanbevelingen van de fabrikant voor het antilichaam te gebruiken.
   6. Incubeer membranen met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. Gebruik bij de fabrikant aanbevolen verdunning.
   7. Was membranen voor 1,5 uur in TBS + 0,1% Tween 20; refresh buffer elke 10-15 min.
   8. Incubeer met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam in een verdunning van 1: 5000 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur temperature.
   9. Was membranen voor 1,5 uur in TBS + 0,1% Tween 20; refresh buffer elke 10 - 15 min.
   10. Incubeer membranen chemiluminescentie detectie reagens voorafgaand aan ontwikkeling op film volgens de instructies van de fabrikant. Andere detectiewerkwijzen kunnen naar wens worden gebruikt.
2. Gastheercel immunofluorescentiekleuring en Imaging
   1. Fix dekglaasjes met gastheercellen zoals beschreven in paragraaf 4.4.
   2. Verwijderen PFA oplossing en wassen dekglaasjes met behandelde cellen tweemaal in PBS, opzuigen tussen wasbeurten.
      Let op: PFA is zeer giftig en moet worden afgevoerd naar behoren.
   3. Blokkeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in PBS met 1% (w / v) normaal geit serum, 2% (v / v) Triton X-100 en 0,5% (v / v) Tween 20.
   4. Was dekglaasjes met PBS gedurende 30 min, het vernieuwen van de buffer elke 10 min.
   5. Incubeer de dekglaasjes met primair antilichaam in een 01:50 verhouding (of zoals aanbevolen door de fabrikant) in het blokkeren van solution overnacht bij 4 ° C.
   6. Was de dekglaasjes gedurende 1,5 uur in PBS, het vernieuwen van de buffer elke 30 min.
   7. Incubeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG AlexaFluor488 werd gebruikt voor deze studies) met een 1: 200 verhouding van antilichaam tegen blokkeeroplossing.
   8. Wash coverslips gedurende 1 uur, het vernieuwen van de buffer elke 20 min.
   9. Solliciteer gewenste vlekken.
      Let op: Deze studies gebruikt DAPI (nucleaire vlek) en rhodamine-phalloidin (actine kleuring) bij verhoudingen van 1: 1000 in het blokkeren van oplossing.
   10. Incubeer dekglaasjes nucleaire actine en vlekken gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   11. Wassen dekglaasjes in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, het vernieuwen van de buffer elke 10 min.
   12. Monteer de dekglaasjes op glasplaatjes met behulp van montage medium.
   13. Laat dekglaasjes in te stellen op de dia's 's nachts voorafgaand aan het afdichten en beeldvorming. Voor de hier beschreven resultaten, afbeeldingen te verzamelen over een fluorescentiemicroscoop using een standaard 20x doelstelling. Gebruik ImageJ en microscoop imaging software om de vastgelegde beelden te verwerken.
3. Ethidiumhomodimeer Dood van de Cel Assay
   1. Zuig medium uit elk putje en was cellen tweemaal met steriele PBS.
   2. Toepassen 4 uM ethidium homodimeer-1 in PBS.
   3. Incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
   4. Bepaal het niveau van fluorescentie met behulp van een plaat lezer ingesteld op 528 nm excitatie en 617 nm emissie met een cut-off waarde van 590 nm.
   5. Voeg 0,1% (w / v) Saponine aan elk putje na de beginstand en laat de platen incuberen gedurende nog 20 minuten bij kamertemperatuur (met schommelende) voeren voordat de plaat een tweede keer bij dezelfde instellingen.
   6. Bepaal procent membraan permeabilisatie afzonderlijk voor elk putje door het verdelen van de eerste fluorescentie lezen (post-behandeling) door de tweede fluorescentie lezing (post-Saponine).
4. ATP Bepaling Assay
   1. Verzamel lysaten zoals beschreven in paragraaf 4.3.
   2. Normaliseren eiwitgehalten in de lysaten via BCA-test of iets dergelijks ^30.
   3. Bepaal cellulaire ATP niveaus met een op luminescentie gebaseerde ATP bepaling kit of gelijkwaardig volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Normaliseren behandelde waarden voor de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controlemonsters.
5. LDH afgifte assay
   1. Na infectie, verzamel supernatanten zoals beschreven in paragraaf 4.3.
   2. Evalueer LDH afgifte met een cytotoxiciteit detectiekit voor LDH afgifte volgens de instructies van de fabrikant.

Results

Het permeabele membraan-insert gebaseerde infectiesysteem protocol ontwikkeld voor de studie van uitgescheiden bacteriële factoren wordt toegelicht in figuur 1. Dit systeem is gebaseerd op de scheiding van bacteriën en gastheercellen via een poreus membraan om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren in aanmerking, in casu streptolysine S (SLS), op gastheerreacties als gastheer membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid, cellulaire signaaltransductie en uitgescheiden gastheercel factoren. Figuur 2 geeft representatieve Western blot gegevens die aantonen dat dit systeem kan worden gebruikt om wijzigingen in de activering van contact beoordelen -onafhankelijke gastheer signalering eiwitten. In het bijzonder, tonen de representatieve gegevens aanzienlijk verbeterde p38 MAPK activatie in de aanwezigheid van SLS producerende GAS-stammen. Dit systeem kan ook worden toegepast om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren gastheereiwit lokalisatie van immunofluorescentie microscopie (visualiseren Figuur 3). De gegevens tonen SLS-afhankelijke activering van de belangrijkste inflammatoire mediator Nucleaire Factor kappa B (NFKB), welke translokeert van het cytoplasma naar de kern ²¹ bij activering. De resultaten in Figuren 2 en 3 geven aan dat zowel de SLS-afhankelijke signalering inflammatoire responsen geen direct contact tussen de bacteriën en gastheercellen vereisen. Zoals eerdere experimenten reeds aangetoond SLS-afhankelijke p38 en NFKB activering in directe infectiemodellen ^21, soortgelijke niveaus van p38 of NFKB activering van de drie GAS stammen in het doorlaatbare membraan-insert systeem zou hebben aangegeven dat de reactie vereiste direct contact tussen de bacteriën en gastheercellen. Figuur 4 toont dat deze infectie systeem kan worden toegepast op toxine-afhankelijke veranderingen in ontvangst cytotoxiciteit via ethidium homodimeer en LDH-afgifte assays beoordelen. Dit blijkt uit de aanzienlijke stijging in zowel membraan permeabilisatie en in het vrijkomen van LDH uit gastheercellen blootgesteld aan een stammen bevattende SLS tegenover ongeïnfecteerde cellen of cellen blootgesteld aan de SLS-deficiënte stam. Deze veranderingen in cytotoxiciteit zich niet onmiddellijk als significant effect niet duidelijk tot 12 uur na infectie bij membraan permeabilisatie en 16 uur bij LDH-afgifte. De representatieve gegevens illustreren het belang van het selecteren van passende tijdstippen en infectie voorwaarden voor de evaluatie van deze gastheerreacties. Naast het feit dat voor de beoordeling van gastheer signalering veranderingen en cytotoxiciteit, het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde infectiesysteem geldt voor de studie van metabole veranderingen zoals nauwkeurige bepaling van ontvangst ATP door het voorkomen van bacteriële besmetting van lysaten van gastheercellen (figuur 5) . Deze gegevens laten een aanzienlijk verlies van keratinocyten ATP in reactie op infectie door GAS 16 uur na infectie met verhoogde ATP verlies in de aanwezigheid van SLS. Deze resultaten zijn consistent met de waargenomen toxine-afhankelijke toename in ontvangst stressrespons signalering en cytotoxiciteit.

Figuur 1: Schema van permeabel membraan Insert-Based infectiesysteem Protocol: Effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheercellen cijfer Menselijke keratinocyten uitgeplaat in het onderste compartiment en gekweekt tot 90% confluentie.. Een collageen beklede membraan met 0,4 urn poriën scheidt de bovenste en onderste kamers, en bacteriën worden toegevoegd aan de bovenste kamer van het permeabele membraan inzetstuk voor de gewenste infectieperiode. Cel kweeksupernatanten en gastheercellen kunnen worden verzameld na de infectie periode en gebruikt voor diverse analyses. Klik hier om een grotere versie te bekijkenvan dit cijfer.

Figuur 2:. Het permeabele membraan Insert-Based infectiesysteem kan worden gebruikt voor gastheer cellysaat Analyse door SDS-PAGE en Western Blotting De representatieve gegevens tonen aan dat SLS verbetert activatie van de p38 MAPK route in geïnfecteerde keratinocyten. (A) HaCaTs werden geïnfecteerd met GAS 7 uur via het doorlaatbare membraan insert infectiesysteem (MOI = 10) en lysaten werden getest op activering van p38. (B) densitometrische drie onafhankelijke Western blots werd uitgevoerd om de relatieve activering van p38 kwantificeren reactie op GAS'infection. Gemiddelden van drie biologische herhalingen worden getoond, met error bars vertegenwoordigt standaarddeviatie. Relatieve activering van p38 wordt weergegeven als gefosforyleerd / totaal eiwitgehalte. Statistische significantie werd bepaald ten opzichte vangeïnfecteerde cellen. De totale p-waarde werd bepaald met ANOVA (p = 0,0063). Dunnett's werden uitgevoerd post hoc aan elke voorwaarde om de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controle te vergelijken betekenen. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 ^21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt het mogelijk voor de visualisatie van Host wijzigingen in de signalering door Immunofluorescentie microscopie De representatieve gegevens tonen aan dat streptolysin S verbetert de pro-inflammatoire signalering via activering van NFKB. HaCaT menselijke keratinocyten geïnfecteerd met GAS bij een M OI van 10 tot 8 uur via het doorlaatbare membraan insert gebaseerde infectiesysteem. (A en B) Nucleaire lokalisatie van NFKB werd beoordeeld door immunofluorescentie beeldvorming. Het percentage nucleair gelokaliseerde cellen werd berekend door het tellen van het aantal cellen waarin NFKB uit het cytoplasma was translocatie naar de kern voor een gegeven gebied en delen dat getal met het totale aantal cellen voor hetzelfde veld. Schaalbalken geven 100 urn. (A) Het gemiddelde van drie herhalingen biologische vertegenwoordigd voor elke conditie met foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. De totale p-waarde werd bepaald met ANOVA; p <0,0001. Dunnett's proeven werden uitgevoerd om elke conditie te vergelijken met de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controlegroep. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 ^21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4:. De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt het mogelijk voor de bepaling van de bacteriële-Mediated Membraan Permeabilisatie en cytotoxiciteit in de afwezigheid van direct contact tussen bacteriën en gastheercellen De representatieve gegevens tonen aan dat keratinocyten levensvatbaarheid afneemt in de aanwezigheid van actieve SLS toxine . GAS - geïnduceerde celdood in HaCaT cellen beoordeeld op aanwezigheid van WT, SLS-deficiënte of Saga aangevuld GAS keratinocyten blootgesteld aan gas via het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde infectiesysteem voor 8-16 uur bij een MOI van 10. (. A) Levensvatbaarheid werd bepaald door ethidium homodimeer assay of (B) LDH-afgifte assay. In beide panelen, 3 replicates worden gemiddeld en fout balken geven standaarddeviatie. Significantie voor elk tijdstip werd bepaald door ANOVA (A) 8 hr, p = 0,0241; 12 uur, p <0,0001 (B) 8 uur, p = 0,0287; 12 uur, p = 0,1977; 16 uur, p = 0,0031. Dunnett's werden uitgevoerd om gemiddelden te vergelijken van elke conditie aan het wildtype infectie van het overeenkomstige tijdstip. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 ^21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt nauwkeurige bepaling van Host ATP Levels door te voorkomen Bacterial Besmetting van gastheercellysaten. De representatieve gegevens tonen SLS-afhankelijke verlies van ATP in Groep A streptokokken-infectie. HaCaT-cellen werden geïnfecteerd met GAS 8-16 uur via het doorlaatbare membraan insert gebaseerde infectiesysteem. Technische replicaten (n = 3) tussen gemachtigden biologische repliceren (2 x 10 ⁶ cellen per monster) werden gemiddeld voor elke conditie, met foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. De totale p-waarden werden bepaald met ANOVA (12 hr, p <0,0001; 16 h, p <0,0001). Dunnett's proeven werden uitgevoerd om elke conditie met wildtype infectie Vergelijk het overeenkomstige tijdstip. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 ^21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Hierin wordt beschreven een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem om de effecten van het bacteriële toxine streptolysine S menselijke epitheliale keratinocyten in een in vitro systeem te onderzoeken. Dit protocol kan worden aangepast voor de studie van andere uitgescheiden bacteriële virulentiefactoren en alternatieve gastheercel. Dit recent ontwikkelde systeem biedt een aantal voordelen ten opzichte van experimentele methoden die gezuiverd toxinen of gefilterd bacteriële supernatanten ¹ gebruiken ^{- 3,8,18 - 20.} Het permeabele membraan insert-systeem zorgt voor een constant gehandhaafd dosis van de betreffende bacteriële toxine aan gastheercellen tijdens het produceren, waardoor maximale toxineactiviteit te handhaven en verhoogt ook de samenhang tussen experimenten. Bovendien, dit systeem nabootst fysiologische omstandigheden doordat de afgegeven factor te accumuleren in de tijd als infectie voortschrijdt en Elimisprong uit de noodzaak om willekeurig selecteren specifieke toxine concentraties gelden voor gastheercellen. Bovendien zou dit systeem ook middelen voor onderzoekers te beoordelen of een bacteriële factor van belang is afgeleverd aan gastheercellen in een contact-afhankelijke wijze. Contact-afhankelijkheid wordt vaak getest door het genereren van isogene mutanten die deficiënt zijn in bacteriële hechting of door het gebruik van reagentia die hechting verhinderen. Het hier beschreven systeem zou een eenvoudig alternatief voor aanvulling of vervanging van deze traditionele benaderingen.

In aanvulling op de geteste applicaties in hoofdstuk 5 van het protocol beschreven, andere toepassingen waarvoor deze infectie systeem kan eenvoudig worden aangepast onder meer het verzamelen van monsters voor cytokine-arrays en ELISA assays. In beide gevallen kan een soortgelijk protocol als beschreven voor LDH-afgifte assays worden gevolgd. Hoewel hier niet getoond, is dit systeem gebruikt om effectief te verzamelen gastheercel monsters te zijn eennalyzed door flowcytometrie. In deze toepassing wordt het permeabele membraan insert verwijderd na de infectie periode worden de cellen gewassen om celkweekmedium te verwijderen en trypsine wordt toegepast het verzamelen van de cellen voor analyse mogelijk. De fysieke scheiding van bacteriën uit gastheercellen bijzonder bruikbaar voor deze toepassing omdat het helpt bij de vorming van grote aggregaten omvat gehecht bacteriën en gastheercellen die anders met nauwkeurig celtelling kunnen storen met de stroom cytometer voorkomen.

Hoewel zeer consistente gastheer responsen bij vergelijking van de resultaten van het permeabele membraan-insert gebaseerde infectie studies met traditionele direct infectie studies waargenomen werden enkele opvallende verschillen in de kinetiek van deze gastheerreacties waargenomen ^21. Bijvoorbeeld veranderingen in gastheer signalering en membraan-gebaseerde cytotoxiciteit nemen 30-50% meer voor te komen in de permeabel membraan-insert gebaseerde infectie model dan correageert direct infectie modellen. Omdat het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde systeem vereist medium wordt toegepast om de bovenste en onderste compartimenten van elk putje, de ontwikkelde voor de hier beschreven studies systeem vereist een toename van 30% in totaal gemiddeld volume per putje vergeleken met overeenkomstige rechtstreekse infectiemodellen voorheen ^21. Dit verschil in totaal gemiddeld volume, in combinatie met de grotere afstand tussen bacteriën en gastheercellen bij direct contact is verboden, waarschijnlijk verhoogt de tijd die SLS diffunderen door het medium gastheercellen bereiken en wekken de waargenomen effecten. Daarnaast is de permeabel membraan insert-systeem verwijdert vele GAS virulentie factoren die kunnen bijdragen tot beschadiging van cellen te hosten zijn; de afwezigheid van deze bijkomende factoren in dit systeem kan bijdragen aan de vertraging in de gastheercel dood en de start van de gastheer signalering gebeurtenissen in vergelijking met directe infectie ²¹ ook. Deze factoren worden overwogenbij het ontwerpen van experimenten met ander uitgescheiden bacteriële bestanddelen beoordelen.

De meest betekenisvolle voorwaarden aangeeft voor het testen van de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheercellen, het testen van een reeks van tijdstippen voor elke toepassing van het permeabele membraan-insert gebaseerde infectiesysteem aanbevolen. Het is belangrijk na te gaan onder welke omstandigheden het specifieke virulentie factor van belang is optimaal om de gevolgen succesvol observeren geproduceerd (bijv log fase stationaire fase, als reactie op bepaalde omgevingssignalen, etc.). In experimenten gericht op het evalueren van veranderingen in ontvangst signaaleiwitten, was het noodzakelijk om tijdstippen dat voldoende tijd voor SLS gastheercellen bereiken en worden in voldoende hoeveelheden voor het induceren signaal verandert ²¹ toegestaan ​​te selecteren. Tegelijkertijd, worden gelet op wijzigingen in de ontvangende signalen moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan SLS geïnduceerde membraan permeabilisatie, omdat dit effect complicates het verzamelen van gastheercellysaten voor analyse. Celdood geïnduceerd door SLS optimaal kunnen worden waargenomen in zowel directe als permeabel membraan-gebaseerde insertie infectiemodellen enkele uren na het begin van de gerapporteerde signaleringsgebeurtenissen ^21. Bovendien bij het selecteren tijdstippen plaats, is het ook belangrijk dat de bacteriën bestudeerd in staat zijn het poreuze inzetstuk penetreren tijdens de studieperiode. De productie van bepaalde bacteriële bestanddelen gedurende een langere periode kan de integriteit van het membraan verstoren en laat de doorgang van bacteriën aan het onderste compartiment. Om te bepalen of dit een probleem in het systeem van belang, kan de bacteriestammen te onderzoeken worden toegepast om de bovenste kamer van het permeabele membraan insert-systeem op verschillende tijdstippen. Op elk tijdstip, kan het inzetstuk voorzichtig worden verwijderd en het medium uit de onderste kamer kan worden verzameld en gebruikt in een standaard kolonie counting assay (zie paragraaf 1.5). Als er geen kolonies worden gevormd uit het celkweekmedium in het onderste compartiment, kan het inzetstuk membraan worden aangenomen dat effectief het passeren van bacteriën op het tijdstip en bacteriële verontreiniging getest.

Andere experimentele opzet onderdeel dat wil optimalisering vereisen voor efficiënte analyse van uitgescheiden bacteriële factoren is de multipliciteit van infectie (MOI). De MOI verwijst naar de verhouding van bacteriële cellen per gastheercel, en wordt derhalve beïnvloed door de gastheercel confluentie op het moment van infectie en het aantal bacteriële kolonievormende eenheden (CFU) bij de cellen gevoegd. In deze studies werden keratinocyten gekweekt tot 90% confluentie, waardoor deze cellen een samenhangend monolaag met intacte tight junctions vormen. Doordachte overweging van de fysiologische organisatie van de gastheercellen te bestuderen moet een geschikte confluentie geïnfecteerd experimenten selecteren. Zodra een KREDIETENiate aantal gastheercellen per putje wordt bepaald, kan een geschikte bacteriële CFU berekend worden op basis van de gewenste MOI. In de hier beschreven studies werd GAS aangebracht aan gastheercellen in een MOI van 10. Geschikte MOI zal variëren met verschillende bacteriën en de gewenste follow-up analyses. Een lage begin MOI is meestal meer fysiologisch relevante en zorgt voor de bacteriële factor van belang langzaam genoeg om subtiele veranderingen in de gastheercel signaling vast te leggen voordat dramatische veranderingen in levensvatbaarheid van de gastheercel zijn duidelijk te accumuleren. Hogere MOI's worden in veel studies beoordeling van cytotoxiciteit, maar dit effect kan ook worden bereikt door te beginnen met een lage MOI en waarbij de infectie vooruitgang voor een langere periode. Het is belangrijk een nauwkeurige CFU bepaling van optische dichtheid uitvloeisel alle bacteriestammen worden getest, als isogene mutanten een veranderde groei kan hebben in vergelijking met wildtype bacteriën en kunnen dus eisen dat een hogere of lagere CFU worden per putje toegevoegd aanzorgen voor een passende vergelijking van de gastheer respons tussen stammen. Wanneer de zoogdiergastheercellen bestudeerd zijn in staat bacteriën te doden of remmen van de groei of nonsynchronous groei tussen bacteriestammen wordt vermoed, kan het ook nuttig zijn studies uit te voeren om de uiteindelijke bacteriële belasting op het einde van de infectieperiode beoordelen. Dit kan worden bereikt door het verzamelen van de inhoud van de doorlatende inzetstuk en het uitvoeren van een kolonie telling assay vergelijkbaar met die in punt 1.5 van de beschreven procedure.

Selecteren geschikte grootte putjes de gewenste test is ook van belang voor het verkrijgen van een optimaal resultaat. Permeabel membraan inserts zijn verkrijgbaar in verschillende afmetingen, maar de meest consistente resultaten voor de hier getoonde studies werden waargenomen middels inzetstukken ontworpen 24 goed en 6 putjes weefselkweekplaten. Dit insert maten zijn relatief gemakkelijk te hanteren met steriele pincet en gemak van manipulatie kritisch preventing ongewenste overdracht van bacteriën uit het bovenste compartiment naar het onderste compartiment van de put. Voor experimenten met het verzamelen van gastheercellysaten, 6 putjes een passend aantal cellen per voorwaarde voor de meeste analyses en zijn groot genoeg om cel schrapers voor monstername tegemoet te komen. Op cytotoxiciteit assays waarin de gastheercellen blijft hechtende en gelabeld met een fluorescente of colorimetrische kleurstof die kan worden gemeten op een plaatlezer (bijvoorbeeld ethidium homodimeer assay trypan blauw exclusietest), gebruik van een 24 wells plaat met de overeenkomstige inserts is aanbevolen. Voor experimenten waarbij celkweekmedium worden verzameld en geanalyseerd (bijv LDH-afgifte, cytokine studies) hetzij de 24 put of 6 well platen kunnen worden gebruikt, hoewel de kleinere putjes geven doorgaans voldoende monstervolumes voor deze analyses en het gebruik van de vereiste minimaliseren reagentia. Kortom, de methode is zeer veelzijdig en kan worden aangepast nodig sampl bereidenes voor tal van follow-up-toepassingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Acumedia	7161A	Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer	Eppendorf	basic model	Any UV-Vis spectrophotometer is suitable.
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713	Other brands are suitable.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes			Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S162H	Use appropriate media additives for cell line of interest.
10 cm tissue culture dishes	Nunc	150350	Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7506	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7524	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips	Fisherbrand	12-541-B	These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamine	Gibco	25030149	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate	Gibco	BP356100	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well)	Corning	3540
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well)	Corning	3595
Forceps	Fisher	3120018	These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers	Fisherbrand	08-100-241	These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500	TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit	Pierce	23227	Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels	BioRad	4561083	Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies	BioRad	1658063	Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette	BioRad		Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	Only required for Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
Rabbit IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Mouse IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody	Cell Signaling	4511	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody	Cell Signaling	8690	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488	Molecular Probes	A-11034	Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent	KPL	54-61-00	Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film	Biodot	BDB57	Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope	Nikon		Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI nuclear stain	Cell Signaling	4083	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain	Molecular Probes	R415	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1	Molecular Probes	E1169	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader	Molecular Devices		Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin	Sigma	47036-50G-F	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit	Life Technologies	A22066	Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release	Roche	11644793001	Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385-1L	Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420B	Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free	Sigma	S8830-2TAB	Other cocktails are likely to be suitable.