Methodenartikel

Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54409

⸱

28 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor het verminderen ruimtelijke heterogeniteit van ionen signalen in MALDI massaspectrometrie door het regelen substraattemperatuur tijdens droogprocessen monster wordt aangetoond.

Samenvatting

Dit protocol toont een eenvoudige monstervoorbereiding om ruimtelijke heterogeniteit in ionensignalen te verminderen tijdens matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) massaspectrometrie. De heterogeniteit van ionensignalen is een ernstig probleem in MALDI, wat resulteert in slechte reproduceerbaarheid van gegevens en MALDI ongeschikt maakt voor kwantitatieve analyse. Door de temperatuur van de monsterplaat tijdens de monstervoorbereiding te regelen, zijn thermisch geïnduceerde hydrodynamische stromingen in druppels monstersoplossing in staat om het heterogeniteitsprobleem te verminderen. Een monstervoorbereidingskamer op kamertemperatuur, uitgerust met een temperatuurgeregelde koperen basisblok dat MALDI-monsterplaten bevat, maakt nauwkeurige controle van de monsterdroogconditie mogelijk. Na het drogen van monsters op de plaat, wordt de temperatuur van de monsters op kamertemperatuur teruggebracht en uit de kamer verwijderd voor verdere massaspectrometrische analyse. De gebieden van monsters worden onderzocht met MALDI-beeldmassaspectrometrie om de ruimtelijke verdeling van alle componenten in het monster te verkrijgen. In vergelijking met de conventionele dried-droplet methode die monsters voorbereidt onder omgevingsomstandigheden zonder temperatuurregeling, vertonen de monsters die met de hierin beschreven methode zijn bereid significant betere ruimtelijke verdeling en signaalintensiteit. Volgens waarnemingen met koolhydraat- en peptidemonsters kan het verlagen van de substraattemperatuur terwijl de omgeving op kamertemperatuur wordt gehouden tijdens het droogproces effectief de heterogeniteit van ionensignalen verminderen. Deze methode is over het algemeen toepasbaar op verschillende combinaties van monsters en matrices.

Inleiding

Massaspectrometrie (MS) is een van de belangrijkste analytische technieken voor het analyseren van de moleculaire samenstellingen van complexe monsters. Van alle ionisatiemethoden die in MS worden gebruikt, is matrix-ondersteunde laserdesorbentie/ionisatie (MALDI) de meest gevoelige en meest gebruikte methode in bioanalytische toepassingen.1 In vergelijking met andere ionisatietechnieken heeft MALDI de hoogste gevoeligheid en een hoge tolerantie voor zoutverontreinigingen. Dergelijke analytische eigenschappen maken MALDI tot de eerste keuze voor koolhydraatanalyse en vele proteomics-toepassingen. Echter, monstervoorbereiding is een cruciale stap voor het verkrijgen van hoogwaardige gegevens in MALDI-MS.

De meest gebruikte monstervoorbereidingsmethode voor MALDI-MS is de dried-droplet-methode, waarbij monsterdruppels op een oppervlak worden afgezet en onder omgevingsomstandigheden worden gedroogd. Deze droogmethode is eenvoudig en over het algemeen effectief.2-5 Echter, een veelvoorkomend probleem in de dried-droplet-methode is dat de resulterende analyt/matrixkristallen zich normaal gesproken onregelmatig verdelen. In veel gevallen verzamelen de kristallen zich aan de rand van de monsters, wat resulteert in de zogenaamde ring-stain-vorming.6-8 De heterogene kristalmorfologieën beïnvloeden de ruimtelijke verdeling van analytmoleculen, wat resulteert in ernstige fluctuaties in het ionisatie-signaal over monsters. Dergelijke ernstige signaalschommelingen en slechte gegevensreproduceerbaarheid staan bekend als het "sweet spot"-probleem in MALDI-MS.9 Daarom is er een grote behoefte aan het verminderen van ruimtelijke heterogeniteiten in MALDI-MS dried-droplet-toepassingen.

Hydrodynamische stromingen in de monstersdruppel spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de ruimtelijke verdeling van monsters die zijn voorbereid met de dried-droplet-methode.10-12 Er werd gevonden dat het verdampen van het oplosmiddel capillaire stromingen naar buiten binnen druppels induceert, die verantwoordelijk zijn voor de ring-stain-vorming.7,10 In tegenstelling hiermee kunnen recirculatiestromingen, veroorzaakt door tangentiale oppervlaktespanningsgradiënten, de naar buiten gerichte capillaire stromingen compenseren.13 Als de recirculatiesnelheden hoger zijn dan die van de naar buiten gerichte capillaire stromingen, kunnen de monsters efficiënt worden herverdeeld om het heterogeniteitsprobleem te verminderen.14

In dit werk demonstreren we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsters met een eenvoudige droogkamer om efficiënte recirculatiestroom te induceren tijdens het droogproces van druppels. Droogcondities voor druppels worden nauwkeurig gecontroleerd, inclusief de temperaturen van de monsterschaal en de omgeving ervan, en de relatieve luchtvochtigheid binnen de kamer. De model-analyten omvatten maltotriose en bradykinine-keten (1-7). De matrix die voor de demonstratie wordt gebruikt, is 2,4,6-trihydroxyacetofenon (THAP). De monsters worden onderzocht met time-of-flight (TOF) MS en de gegevens worden kwalitatief geanalyseerd om de reductie van heterogeniteit te tonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Dit protocol is ontwikkeld voor het verminderen van de ruimtelijke heterogeniteit van maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met de gedroogde-druppel-methode. Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen, inclusief voorbereiding en conditionering, sample depositie en drogen, en massaspectrometrie data-analyse. De procedures zijn beschreven en in meer detail hieronder beschreven:

1. Voorbereiding en Voorconditionering

  1. Het schoonmaken van de Sample Plate
    1. Draag nitril en met de hand wassen van het monster plaat voorzichtig met afwasmiddel en gedestilleerd-gedeïoniseerd water (DDW).
    2. Spoel het monster plaat met methanol (MeOH) en DDW.
    3. Plaats het monster plaat in een bekerglas van 600 ml en vul met DDW.
    4. Ultrasone trillingen het monster plaat DDW gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad (200 W, 40 kHz).
    5. Verwijder DDW uit de beker en vul de beker met MeOH.
    6. Ultrasone trillingen het monster plaat in MeOH gedurende 15 minuten in het ultrasoonbad (200 W, 40 kHz).
    7. Afblazen het oplosmiddel druppels op de plaat met stikstofgas en houden het monster plaat droog is voordat sample depositie.
  2. Reguleren droogkamer Temperatuur
    LET OP:. De droogkamer is een 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) acryl kamer Figuur 1 toont het beeld van dit droogsysteem. De kamer wordt gespoeld met stikstofgas kamertemperatuur door een gas stromingsmeter met een constant debiet een lage relatieve luchtvochtigheid bewaakt door een gekalibreerde hygrometer in de droogkamer de geïnstalleerde. Een koperen basis blok in de droogkamer uitgerust met een geprogrammeerde constante temperatuur water circulatiepomp wordt gebruikt om roestvast stalen monster platen tegemoet te komen. De koperen basisblok kan de monsterplaat temperatuur van 5 regelen tot 25 ° C. De temperatuur van de lucht, koperen basis blok, en het monster plaat worden bewaakt door K-type thermokoppels.
    1. Open de deur en snel zet het monster plaat op de koperenbasis blok en sluit de deur.
    2. Handmatig aanpassen van het gas stroommeter aan het stikstof debiet tot 10 standaard kubieke voet per uur (SCFH) in te stellen.
    3. Bewaken van de relatieve vochtigheid in de droogkamer door de hygrometer en fine-tunen van het gas flowmeter te zorgen voor de relatieve luchtvochtigheid is altijd minder dan 25%.
    4. Bewaken van de temperatuur van het monster plaat door K-type thermokoppels en het water circulatiepomp temperatuur handmatig in te stellen totdat het monster plaat 5 ° C voor experiment of kamertemperatuur (25 ° C) voor de controle bereikt.
      Opmerking: Om de monsterplaat stabiliseren op een temperatuur bedoeld, de watercirculatie temperatuur doorgaans ingesteld 0-5 ° C hoger dan de ontworpen monster. Om bijvoorbeeld 5 ° C te handhaven op de monsterplaat de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 0 tot 2 ° C; het monster plaat bij 25 ° C te houden, de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 23 tot 25 ° C.
    5. Zorg ervoor dat de vereiste temperaturen en de relatieve vochtigheid worden bereikt (tabel 1) voor sample depositie.
      Opmerking: Alle parameters en hun instelwaarden voor droogprocessen met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1.
      LET OP: Bij een lage monster plaat temperatuur, kan water condensatie op het monster plaat optreden als het deurtje is geopend voor een lange tijd. Als er water condensatie optreedt, sluit de deur en GEEN monster op het storten tot condensatie van water is uitgedroogd.
  3. Bereiding van matrix en analyt Solutions
    1. Bereiding van matrix oplossingen
      1. Bereid 0,1 M THAP oplossing met 50% acetonitril (ACN): 50% DDW waterige oplossing.
    2. Bereiding van analyten
      1. Bereid 10 -4 M maltotriose oplossing DDW.
      2. Bereid 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossing in 50% acetonitril(ACN): 50% DDW waterige oplossing.

2. Sample Afzetting en Drogen

  1. Premix 0,25 pl 0,1 M THAP oplossing en 0,25 pl 10 -4 M maltotriose of 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossingen in een microcentrifugebuis.
  2. Vortex de gemengde oplossing gedurende 3 sec.
  3. Centrifugeer de gemengde oplossing gedurende 2 sec (2000 xg) om de oplossing op de bodem van de centrifugebuis verzamelen.
  4. Open de deur van de droogkamer, zorgvuldig deponeren 0,1 ul van de oplossing op het monster plaat met pipet en sluit de deur onmiddellijk.
  5. Wacht tot het monster druppel uit te drogen.
    . Opmerking: De typisch waargenomen droogtijd met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1 voor steekproefplaat temperatuur van 5 ° C, de gemiddelde droogtijd is 800 tot 1.000 sec; voor steekproefplaat temperatuur van 25 ° C, de gemiddelde droogtijd is 100 tot 150 sec.
  6. Na het drogen, open de deur van de droogkamer.
  7. Zet het water circulatiepomp temperatuur tot kamertemperatuur (25 ° C).
    OPMERKING: Sla deze stap als het monster plaat constant op kamertemperatuur (25 ° C) tijdens het droogproces wordt gehouden.
  8. Nadat het monster plaat temperatuur weer op kamertemperatuur (25 ° C), verwijder het monster plaat uit de droogkamer.
  9. Onderzoek het monster morfologie onder een 5X stereomicroscoop en neem beeld snapshot bright-field.
    Opmerking: Als het kristal morfologie niet zoals verwacht, is het noodzakelijk om een ​​nieuw monster te maken met dezelfde procedure. Typische kristal morfologie wordt in de bovenste panelen van figuur 2.
    LET OP: In de gevallen met een lage monster plaat temperaturen, zoals 5 ° C, is het belangrijk om op te warmen het monster plaat op kamertemperatuur alvorens het uit de droogkamer. Bij het afzetten van de monsters, hier niet aan houden de voorgemengde solution in de punt van de pipet meer dan 10 sec. Niet meer gebruik maken van de vooraf gemengde oplossing na het afzetten van de monsters. De bovenste panelen van figuur 2 tonen bright-field beelden van de monsters bereid met verschillende steekproefplaat temperaturen.

3. Mass Spectrometry Data Analysis

  1. Mass Spectrometry Data Acquisition
    LET OP: Na de bereiding kan het monster worden geanalyseerd met behulp van beeldvormende massaspectrometrie. In deze studie worden de beeldvormende MS experimenten met laboratoriumonderzoek ingebouwde gesynchroniseerde dual-polariteit TOF (DP-TOF) massaspectrometer beeldvorming. 15 Commercial MALDI-TOF mass spectrometers met imaging vermogen zijn ook geschikt voor deze experimenten. De massaspectrometer wordt gebruikt in lineaire extractie en positieve ion modi met geoptimaliseerde afzuiging vertragingen. De kinetische energie van ionen 20 kV. De laserstraal grootte 35 pm in diameter op het monsteroppervlak en het spectrum van elke plek is de avewoede van 5 laser shots.
    1. Plaats het monster plaat in de MALDI massaspectrometer.
    2. Voer imaging massaspectrometrie analyse om het monster bereid in stappen 2,1-2,9.
    3. Selecteer een karakteristieke massa piek van de massa lijst weergegeven in het venster resultaat en klik op "2D" om de afbeelding van een twee-dimensionale ion plotten.
      LET OP: Voor maltotriose gemengd met THAP, de karakteristieke pieken sodiated maltotriose, geprotoneerde THAP en sodiated THAP. Voor bradykinine fragment (1-7) gemengd met THAP, omvatten de karakteristieke pieken geprotoneerde bradykinine fragment (1-7), geprotoneerd THAP en sodiated THAP.
    4. Klik op de aanpassing knoppen in het pop-up venster om de bovenste en onderste grenzen van de intensiteit van het signaal te bepalen en klik op "een afbeelding op te slaan". Deze instelling bepaalt het contrast van ionen beelden.
      LET OP: In elke individuele set van gegevens, worden de gebarsten regio's en de nul vlekken toont lage helderheid geëlimineerd.
    5. Observeren en vergelijk de ionafbeelding het beeld helder-veld dat werd genomen op stap met 2.9.
      OPMERKING: Imaging massaspectrometrie en constructie van afbeeldingen van bepaalde ionen kan worden bereikt met commerciële instrumenten. Als gevolg van de verscheidenheid van de data-acquisitie en analyse software, moeten de gebruikers software instructies van de leverancier instrument om beelden van hoge kwaliteit te krijgen volgen.
  2. Gegevensanalyse
    LET OP: De heterogeniteit van de monsters wordt kwantitatief geanalyseerd. In deze demonstratie wordt elk monster verdeeld over meerdere concentrische gebieden door ontwikkelde software in huis om de ruimtelijke verdeling van de ionen te analyseren. De analyse kan ook worden uitgevoerd met zelfstandige gegevensanalyse software.
    1. Klik op de nul vlekken en de gebarsten regio's van de ion afbeelding weergegeven in het venster resultaat in om onbelangrijke gebieden te verwijderen.
      OPMERKING: Deze procedure definieert de essentiële gebied imago ion van.
    2. Klik op "vind edge" knop om de buitenste laag op het ion van te vinden.
    3. Klik op 'aftrekken' om de ion overvloed informatie van de buitenste laag in een database op te slaan en tegelijkertijd verwijder deze laag op de ionen uit. Een selectievakje vertegenwoordigt deze buitenste laag zal verschijnen in de "output data" lijst van het venster resultaat.
    4. Herhaal stap 3.2.2 en 3.2.3 tot het midden van het ion van wordt gedefinieerd.
    5. Klik op en selecteer alle selectievakjes in de "output data" en klik op "export" om de gegevens te exporteren.
    6. Open de geëxporteerde gegevens met behulp van spreadsheet-software om de gemiddelde ion overvloed aan elke laag te berekenen aan de ruimtelijke verdeling van ionen informatie te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De lichte-veldbeelden en de MS afbeeldingen maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met monsterplaat temperatuur van 5 en 25 ° C zijn weergegeven in figuur 1. Bij sodiated maltotriose, het ion signaal voornamelijk bevolkt aan de rand van het waarnemingsveld als het wordt bereid met een monsterplaat temperatuur van 25 ° C. Door verlaging van de monsterplaat temperatuur tot 5 ° C, het signaal vult homogeen over het gehele monstergebied. Het enige merkbare nadeel b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op basis van eerdere theoretische voorspellingen, kan temperatuur geïnduceerde hydrodynamische stromen binnen druppels naar buiten te overwinnen capillair stromen veroorzaakt door verdamping van het oplosmiddel. De efficiëntie van dit interne recirculatie van moleculen wordt versterkt wanneer de temperatuur gradiënten binnen een druppel verhogen. Volgens de voorspelde resultaten bij het houden van de monsterplaat temperatuur onder 5 ° C onder handhaving van zijn omgeving bij omgevingstemperatuur, de gemiddelde snelheid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door het Genomics Research Center, Academia Sinica en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan, de Republiek China (contractnr. 104-2119-M-001-014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
DetergentpoederAlconox242985
MethanolMerck106009
AcetonitrilMerck100003
2,4,6-trihydroxyacetofenon (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Bradykinine fragment (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
PipettipsMettler Toledo17005091
MicrocentrifugebuisAxygenMCT-150-C
Apparatuur
Milli-Q waterzuiveringssysteemMilliporeZMQS6VFT1
Poedervrije nitrilhandschoenenMicroflexSU-690
600 ml bekerDuran2110648
Ultrasone reinigerDeltaDC300H
HygrometerWisewind5330
Stikstofgas flowmeterDwyerRMA-6-SSV
K-type thermokoppelsDigitron311-1670
CentrifugeSelect BioProductsForce Mini 
PipetRaininpipet-lite XLS
StereomicroscoopOlympusSZX16
Temperatuurcontroleerbare droogkamerthis lab
Gesynchroniseerde dubbelpooltijd-of-vlucht beeldvormende massaspectrometer (DP-TOF IMS)this lab
MALDI-TOF roestvrijstalen monsterdoelwitthis lab

Referenties

  1. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
  2. Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
  3. Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
  4. Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
  5. Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
  6. Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
  7. Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  8. Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
  9. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  10. Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
  11. Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020(2009).
  12. Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
  13. Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
  14. Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
  15. Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
  16. Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
  17. Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
  18. Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MALDI monsterpreparatiereductie van ruimtelijke heterogeniteittemperatuurgecontroleerde droginghydrodynamische stromingsregulatieMALDI imaging massaspectrometrieoptimalisatie van de gedroogde druppelmethodestikstofstroomcontrolemonitoring van de relatieve vochtigheidkoeling van de monsterplaathomogenisatie van het ionsignaal

Gerelateerde artikelen