Method Article

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.

This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De darm is het grootste vlak van het lichaam dat is blootgesteld aan de externe omgeving. Enorme arrays van de ingezeten microben koloniseren de menselijke darm de darmflora (of microflora) te vormen. Dit is naar schatting bestaan ​​uit maximaal 100000000000000 microbiële cellen en vormt een van de meest dichtbevolkte bacteriële habitats in de biologie 1-3 bekend. In het GIT bacteriën koloniseren een intestinale niche waar ze kunnen overleven en zich vermenigvuldigen 4. In ruil daarvoor, de microbiota schenkt de gastheer met extra functionele kenmerken niet gecodeerd op zijn genoom 1. Bijvoorbeeld de microbiota stimuleert de prolifera....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het dier faciliteit van Ulm University (Ulm, Duitsland) gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het plaatselijke dierenasiel gebruik en onderhoud commissie en de Nationale Animal Welfare Law.

1. De bouw van de pCFP-OVA Plasmid

  1. Versterken de volledige grootte OVA gen met de primers Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') en Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 met behulp van vector pCI-OVA (ampicilline resistente) 42 als een matrijs. K....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een antigeen gedreven colitis model een E. vestigen coli stam is geconstrueerd dat een plasmide waarin het gen voor het GVB gefuseerd aan de coderende sequentie voor de kippen ovalbumine eiwit en het fusie-construct tot expressie wordt gebracht onder controle van de sterke constitutieve promoter P hyper (Figuur 1A) bevat. Fluorescentiemicroscopie toont dat de recombinante E. coli pCFP-OVA, maar niet de ouderlij.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Net als bij elk ander model, kan de antigeen gedreven colitis model hierboven beschreven enkele kwesties die de onderzoeker het uitvoeren van de techniek zich bewust van moet zijn te presenteren. Bij het ​​injecteren van de OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen in de gastheren, moet de onderzoeker zeer zacht en voorzichtig zijn om de naald in de buikholte. Doet u dit niet kan leiden tot het scheuren van de darm van de muis die kunnen leiden tot de dood, of een subcutane toediening van cel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation KitRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Glacial acetic acidSigma-Aldrich537020 
Gel chamber PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Loading DyeThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo FisherSM0312
Ethidium bromide solutionCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Photo-documentation system Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA sequencing MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS)BiochromL182-50
Fluorescent microscope ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro blotter Biometra GmbH846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody Abcamab181688
Anti-rabbit IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
Ammonium chlorideSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Columns Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Columns Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Feeding Needle 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinSigma-Aldrich1496904
HematoxylinSigma-AldrichH9627
Eosin YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Collagenase type VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediumAppliChemA2044, 9050
Sodium azideSigma-Aldrich438456
Mouse BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 softwareDeNovo
Meta scanning confocal microscope ZeissLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM software Zeissv4.2.0.121
Maxisorp immuno plates NUNC, Roskilde442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphataseJackson Immuno Research016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA readerTecan
EasyWin softwareTecan
DNase I recombinant4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles