Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

18 september 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In dit artikel

Samenvatting

In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).

Samenvatting

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische ontsteking die het maag-darmkanaal (GIT) aantast. Een van de beste manieren om de immunologische mechanismen die tijdens de ziekte betrokken zijn te bestuderen, is het T-cel overdrachtsmodel van colitis. In dit model worden immunodeficiënte muizen (RAG-/- receptoren) gereconstitueerd met naïeve CD4+ T-cellen van gezonde wildtype gastheren.

Dit model maakt onderzoek van de vroegste immunologische gebeurtenissen die leiden tot ziekte en chronische ontsteking mogelijk, wanneer de darmontsteking zichzelf in stand houdt maar niet afhankelijk is van een gedefinieerd antigeen. Om de mogelijke rol van antigeen-presenterende cellen (APC's) in het ziekteproces te bestuderen, is het nuttig om een antigeen-gedreven ziektemodel te hebben, waarin een gedefinieerd, van commensalen afgeleid antigeen leidt tot colitis. Een antigeen-gedreven colitismodel is daarom ontwikkeld. In dit model worden OT-II CD4+ T-cellen, die alleen specifieke epitopen in het OVA-eiwit kunnen herkennen, overgedragen naar RAG-/- gastheren die worden uitgedaagd met CFP-OVA-expresserende E. coli. Dit model maakt onderzoek van de interacties tussen APC's en T-cellen in de lamina propria mogelijk.

Inleiding

De darm is het grootste vlak van het lichaam dat is blootgesteld aan de externe omgeving. Enorme arrays van de ingezeten microben koloniseren de menselijke darm de darmflora (of microflora) te vormen. Dit is naar schatting bestaan ​​uit maximaal 100000000000000 microbiële cellen en vormt een van de meest dichtbevolkte bacteriële habitats in de biologie 1-3 bekend. In het GIT bacteriën koloniseren een intestinale niche waar ze kunnen overleven en zich vermenigvuldigen 4. In ruil daarvoor, de microbiota schenkt de gastheer met extra functionele kenmerken niet gecodeerd op zijn genoom 1. Bijvoorbeeld de microbiota stimuleert de proliferatie van epitheelcellen, produceert vitaminen die gastheer kan produceren op zichzelf metabolisme reguleert en beschermt tegen pathogenen 4-6. Gezien deze voordelige relatie, hebben sommige auteurs gesuggereerd dat de mens zijn "super-organismen" of "holobionts", dat zijn een mix van bacteriële en menselijke genen 7,8. Gezien de gunstige invloed van de microbiota van de (menselijke) gastheer, de intestinale immuunsysteem moet commensal microben tolereren om hun bestaan ​​in het lumen mogelijk te maken, maar ook de dood van de ziekteverwekkers die binnenvallen van luminale kant 9-11. De intestinale immuunsysteem mechanismen om onderscheid te maken tussen onschadelijke en potentieel schadelijke microben luminaal ontwikkeld; Maar deze mechanismen zijn nog niet goed begrepen 12. Handhaven intestinale integriteit vereist een strak gereguleerd immuunhomeostase het evenwicht tussen tolerantie en immuniteit 13 houden. Een onbalans bij immuun homeostase bij aan de inductie van intestinale ziekten zoals inflammatoire darmziekten (IBD) 3,14.

Er zijn twee belangrijke types van IBD: ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). Patiënten met deze ziekten vaak lijden aan rectaal bloeden, ernstige diarree en buikpijn 15,16. De oorzaak van IBD is nog steedsonbekend, maar een combinatie van genetische factoren, omgevingsinvloeden en ontregelde immuunreacties kunnen de belangrijkste gebeurtenis ziekteontwikkeling 15 zijn.

Diermodellen voor IBD zijn al meer dan 50 jaar. In de afgelopen decennia nieuwe IBD modelsystemen ontwikkeld om de verschillende hypothesen met betrekking tot de pathogenese van IBD 17,18. De meest bestudeerde van chronische colitis is de T-celoverdracht model verstoring van T-cel homeostase 19,20 induceert. Dit model gaat overbrengen naïeve T-cellen van muizen in immunocompetente gastheer die T- en B-cellen (bijvoorbeeld RAG - / - muizen en SCID) missen 16,21. De ontwikkeling van de ziekte in dit model wordt gecontroleerd 3-10 weken door onderzoek van de aanwezigheid van diarree, verminderde fysische activiteit, en verlies van lichaamsgewicht. Dit wordt zo genoemd het wasting syndroom 16. In vergelijking met de gezonde muizen de dikke weefsel van getransplanteerde gastheren is Thicker, korter en zwaarder 16. DE T celoverdracht model, is het mogelijk om te begrijpen hoe verschillende T cel populaties kan bijdragen tot de pathogenese van IBD 22. De T celoverdracht model niet de interactie tussen APC en T-cellen in het ziekteproces analyseren een antigeen-specifieke wijze. Het is aangetoond dat een interactie tussen myeloïde cellen en lymfoïde cellen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van darmontsteking 23 zijn. Hoewel veel aspecten van IBD zijn opgehelderd, de initiële gebeurtenissen die leiden tot de ontwikkeling van de ziekte moet nog duidelijk worden begrepen.

Aangetoond is dat bij het ​​uitblijven van microbiota overdracht colitis kan niet worden vastgesteld 24. Onlangs heeft een aantal theorieën komt IBD gevolg van een immuunrespons tegen commensale bacteriën 25 zijn. Auteurs hebben voorgesteld dat commensale bacteriën noodzakelijk om ontsteking te induceren in de distale darm26. In kiemvrij (GF) dieren de intestinale immuunsysteem verzwakte 27,28, maar een kolonisatie van deze muizen met een mengsel van specifiek-pathogeenvrije bacteriën resulteert in de ontwikkeling van de volledig competent intestinaal immuunsysteem 29. Vandaar de microbiota lijkt een sleutelelement in de pathogenese van IBD, hetzij als een mechanisme dat predisponeert voor of beschermen tegen de ontwikkeling van darmontsteking 30,31. Huidige theorieën komt IBD is een gevolg van microbiële onbalans, genoemd dysbiose in genetische aanleg 32 patiënten, maar het is niet duidelijk of de dysbiosis de oorzaak of gevolg van de ziekte 12. Gezien de rol van micro-organismen in de ontwikkeling van IBD, in vitro experimenten toonden aan dat CD4 + T-cellen kunnen worden geactiveerd door APCs gepulst met darmbacteriën 33,34.

Bovendien is aangetoond dat antigenen vanverschillende commensale bacteriën, zoals E. coli, Bacteroides, Eubacterium en Proteus, kunnen CD4 + T-cellen 35 activeren. Dit geeft aan dat de presentatie van bacteriële antigenen aan T-cellen van belang is voor de ontwikkeling van IBD. De complexiteit van meerdere antigenen verkregen door de microflora in de ziekte te verminderen, heeft E. coli stam gecreëerd die het OVA antigen produceert. Overdracht colitis werd geïnduceerd door injectie van OVA-specifieke T-cellen in RAG - / - dieren gekoloniseerd met OVA tot expressie E. coli.

Dit model is gebaseerd op de recente aanwijzingen dat CX 3 CR1 + Kamerleden, een grote mobiele subgroep in het colon lamina propria (CLP) 36, zijn interactie met CD4 + T-cellen tijdens de overdracht colitis 37. MPs proeven het darmlumen voor deeltjesvormig antigeen, zoals bacteriën, met behulp van hun dendrieten 36, 38,39. Vorige studiesaangetoond dat MPs ook kan opnemen oplosbare antigenen, zoals OVA, ingebracht in het darmlumen 40,41. Gezien de overvloed van CX 3 CR1 + MPs in de CLP, is het mogelijk dat deze cellen luminale bacteriën monster en interactie met CD4 T-cellen. Confocale beeldvorming van muizen getransplanteerd met OVA-specifieke CD4 + T-cellen gekoloniseerd met E. coli CFP-OVA, blijkt dat CX 3 CR1 + MPs in contact met OT-II CD4 + T-cellen tijdens de ontwikkeling van antigeen gedreven colitis. Dit model maakt de studie van de antigeenpresentatie proces tussen intestinale APC's en T-cellen die specifiek alleen voor specifieke antigeen expressie bacteriën in het darmlumen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het dier faciliteit van Ulm University (Ulm, Duitsland) gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het plaatselijke dierenasiel gebruik en onderhoud commissie en de Nationale Animal Welfare Law.

1. De bouw van de pCFP-OVA Plasmid

  1. Versterken de volledige grootte OVA gen met de primers Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') en Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 met behulp van vector pCI-OVA (ampicilline resistente) 42 als een matrijs. Kloon het PCR product (de OVA coderende sequentie) in een in de handel verkrijgbaar faag mid-vector met behulp Spel en Clal restrictieplaatsen van de vector en primers aan de specifieke OVA-plasmide verkregen.
  2. Versterken de GVB-coderende gen samen met de sterke constitutieve promotor P hyper behulp van plasmide pad 1 -cCFP (chlooramfenicolresistente) 43 als een matrijs en primers CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') en CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Kloon de CFP-coderende gen in de specifieke OVA-plasmide (ampicilline resistente) met de Spel en SacI restrictieplaatsen van de vector primers en 37. Dit introduceert een spacer van 6 glycine residu's tussen de GVB-codering van OVA-coderende sequentie.

2. Constructie van E.coli pCFP-OVA

  1. Kweek E. coli stam DH10B in 100 ml Luria Bertani (LB) -medium aeroob bij 37 ° C op een roterende schudder overnacht.
  2. Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pl glycerol glycerol en opslag te creëren bij -80 ° C.
  3. Voeg 50 pl E.coli stam DH10B uit glycerol voorraad in 5 ml LB medium en groeien ze aëroob bij 37 ° C op een roterende schudinrichting overnight.
  4. Breng de kweek in een van schotten 1 L erlenmeyer met 250 ml LB-medium bij 37 ° C in een roterende schudden.
  5. Groeien bacteriën tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van 0,5 en dan chill de cultuur op ijs gedurende 30 min. Centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  6. Resuspendeer bacteriën met 100 ml van ijskoud steriel H2O en gecentrifugeerd bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 minuten bij 4 ° C Resuspendeer bacteriën met 100 ml ijskoude 10% glycerol en centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal deze laatste stap twee keer.
  7. Na de laatste wasstap, resuspendeer bacteriën in 700 pi 10% glycerol. Freeze 50 gl aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
  8. Ontdooi een 50 pi aliquot op ijs en overbrengen in een voorgekoeld elektroporatie cuvette (2 mm elektrodeafstand).
  9. Voeg 5 ul plasmide-DNA (100 ng) met de 50 pl E. coli aliquots. Voer elektroporatie met een enkele puls bij 25 uF, 200 ohm (Ω) en 2,5 kV.
  10. Resuspendeer bacteriën in 1 ml voorverwarmde SOC medium (5 g / l gistextract, 2 g / l trypton, 10 mM natriumchloride, 2,5 mM kaliumchloride, 10 mM magnesiumchloride, 10 mM magnesiumsulfaat) en incubeer bij 37 ° C aëroob gedurende 1 uur.
  11. Plaat bacteriën op LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml (voeg 100 ul van een 100 mg / ml ampicilline bouillon aan 100 ml LB-agar) en incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C.
  12. Pick enkele kolonies en opnieuw streak ze in LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml. Incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C.
  13. Pick enkele kolonies en groeien ze overnacht in 10 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml voor plasmide-isolatie. Gebruik in de handel verkrijgbare plasmide mini prep kit en elueer plasmide DNA met 30 pi dH 2 O (gedestilleerd water) volgens de fabrikant '; S protocol. Controleer plasmiden door restrictie-analyse en DNA-sequencing 37,42,43.
  14. Het opzetten van een cultuur van positieve klonen van E. coli pCFP-OVA in 100 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml. Grow aëroob bij 37 ° C op een roterende shaker 's nachts.
  15. Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pi zuivere glycerol en bewaar bij -80 ° C.
  16. Centrifugeer de rest van de kweek gedurende de nacht bij 5000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en resuspendeer de pellet in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng 10 ul van de suspensie op glasplaatje en bedek het met een dekglaasje.
  17. Let op de monsters in een standaard fluorescentie microscopie om de expressie fluorescentie van de GVB-OVA (GVB excitatie bij 450 nm, emissie bij 480 nm) te bevestigen. Analyseer de bacteriën beginnen met vergroting 400X.
  18. Centrifuge 1 ml bacteriën overnacht kweken bij 5000 xg gedurende 10 min, RT. Resuspendeer de pellet in 40 glPBS en kookt bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
  19. Centrifugeer de monsters bij 30.000 xg gedurende 10 min en de supernatanten gebruikt voor Western blot-analyse 37. Gebruik de-konijn verhoogde anti-OVA polyklonaal antilichaam verdund 1: 400.

3. Productie van OT-II / Rode Muizen

  1. Cross een man / vrouw OT-II muis met een vrouwelijke / mannelijke muizen tot expressie rood fluorescerend eiwit (beide stammen in de handel verkrijgbaar) om de OT-II / Red 37 muizen te genereren.

4. Spleen Cell Isolation

  1. Euthanize de OT-II / Red muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar.
  2. Knip met een schaar de linker superieure buikgedeelte van de muis gesneden. Op grond van deze abdominale deel is er de milt (ovale vorm met een donker-rode kleur). Gebruik een schaar en pincet om het te verwijderen.
    1. Pak de milt van de OT-II / Red muizen en doorgeven door een 100um zeef cel geplaatst op een 50 ml buis met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit teneinde een enkel celsuspensie te verkrijgen. Was het filter tweemaal met 10 ml PBS aangevuld met 1% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS).
  3. Centrifugeer de celsuspensie bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met 5 ml voorverwarmde lysisbuffer (144 mM NH4Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) om de rode bloedcellen te lyseren. Incubeer 10 min bij 37 ° C.
  4. Was het monster met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 10 ml PBS aangevuld met 1% FBS.
  5. Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
    1. Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Tellen cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 vierkantjes van één kamer en determine het gemiddeld aantal cellen per vierkante. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.

5. CD4 + CD62 L + T Cell Verrijking

  1. Verrijken miltcellen voor CD4 + CD62L + T cellen via magnetische isolatie kit volgens de principes van negatieve of positieve selectie. Hier, Gebruik negatieve selectie aan CD4 + T-cellen te isoleren en te gebruiken positieve selectie verder te verrijken in de CD62L + populatie in de CD4 + T-cel pool.
    Opmerking: In de negatieve selectieprocedure, de cellen, die niet geïsoleerd worden (hier: alle CD4 negatieve cellen) gelabeld met specifieke antilichamen gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen zullen de CD4 + T-cellen door de kolom passeren zodat ze kunnen worden easily verzameld. In de positieve selectieprocedure cellen geïsoleerd worden gelabeld zijn met geschikte antilichaam gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen de gemerkte cellen blijft in de kolom en ze kunnen worden verzameld door het verwijderen van de kolom uit het magnetische veld en spoelen met buffer.
  2. Voor de negatieve selectieprocedure, resuspendeer 10 7 totale miltcellen in 40 ul koude PBS aangevuld met 0,5% runderserumalbumine (BSA). Voeg 10 ul met biotine gelabelde antilichaam cocktail met de magnetische isolatie kit (specifieke antilichamen die niet-CD4 + T-cellen) en incubeer 15 min op ijs.
    1. Voeg 30 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA en 20 pl anti-biotine microbolletjes. Incubeer 20 min op ijs.
    2. Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de cellen in 1 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSEEN.
    3. Plaats de kolom specifiek voor de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg de celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA.
    4. Centrifugeer cellen van het effluent bij 390 xg gedurende 5 minuten. Effluent passeren door de kolom bevat ongelabelde CD4 + T-cellen. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en tel de cellen.
    5. Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
      1. Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen / mL vermenigvuldigen cel bepalenl aantal met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.
  3. Voor de positieve selectieprocedure, voeg 10 ul van CD62L microkralen per 10 7 voorverrijkte CD4 + T celfractie. Incubeer 15 min op ijs.
    1. Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer in 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA.
    2. Plaats de bepaalde kolom van de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA.
    3. Verwijder de kolom uit het magnetische veld en plaats het op een geschikte collectie buis. Voeg 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom en spoel CD4 + CD62L + T cels vastgehouden in de kolom door stevig op de zuiger in de kolom.
      OPMERKING: De geïsoleerde CD4 + CD62L + T cellen zijn nu klaar voor verdere toepassingen, zoals in vivo experimenten. Volgens de instructies van de fabrikant van de CD4 + CD62L + T cellen isolatiekit de microkralen niet toxisch. Vanwege de geringe omvang (ongeveer 50 nm), doen ze niet cellen te activeren en zij zullen niet te verzadigen celoppervlak epitopen. Dus de geïsoleerde cellen kunnen worden overgebracht in immunodeficiënte muizen colitis 37,44,45 induceren.
    4. Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
      1. Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen appear wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten is berekend, delen door het aantal kwadranten.

6. Inductie van Antigen-driven Colitis

  1. Injecteren intraperitoneaal 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T cellen in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen. Voor inductie van antigenspecifieke colitis toedienen E. coli pCFP-OVA om de dag met een dosis van 1 x 10 8 kolonievormende eenheid (CFU) in 100 pl PBS per dier sonde of orale instillatie achter de snijtanden.
  2. Monitor tweemaal per week het lichaamsgewicht van getransplanteerde muizen en hun klinische toestand (aanwezigheid van bloed in de ontlasting, ontlasting en de activiteit van muizen).

7. Tissue Monsters voor histopathologisch onderzoek

  1. Neem weefselmonsters van the dikke darm van muizen, vast te stellen in neutraal gebufferde formaline (10%) en insluiten in paraffine zoals eerder beschreven 36,46.
  2. Section de paraffine monsters op een microtoom, monteren op dia's, en het uitvoeren van de H & E stain 47,48.
  3. Categoriseren de histologie van de dikke darm, zoals eerder 47,48 gepubliceerd: normaal (score 0); milde colitis (score 1), matige colitis (score 2) en ernstige colitis (score 3).

8. Isolatie van de dikke darm Lamina Propria Cells

  1. Euthanaseren getransplanteerde muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar.
  2. Plaats het dier af met de buik naar boven. Gebruik een tang om de huid naar voren te grijpen om de urethra opening. Gebruik schaar om het huidsnede langs de ventrale middellijn van de lies tot de borst. Trek de huid weer aan de zijkanten.
  3. Snijd door de doorzichtige peritoneale spierwand enopenstelling van de lichaamsholte. Identificeer de colon die gaat van de anus tot de blindedarm 49. Snijd de 2 extremiteiten en bevrijden van het weefsel van een vet.
  4. Open de colon langsrichting met een dissectie schaar. Gebruik een pincet om het darmweefsel schud in een petrischaal met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS om vuil en slijm te verwijderen. Snijd de dikke darm in 5-8 mm stuks.
  5. Plaats de colon segmenten in een 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. The Wash buffer bevat 500 ml DPBS, 10 mM Hepes en 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
  6. Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
  7. Incubeer de buis met het colon segmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 10 minuten.
  8. Na de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
  9. Gooi de supernatanten en plaats de weefselmonsters in een nieuwe 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. Herhaal stappen 6-9 driemaal
  10. Gooi de supernatants en plaats de weefselmonsters in een petrischaal met 25 ml PBS. Gebruik een pincet om voorzichtig de weefselmonsters te schudden in de petrischaal gedurende enkele seconden om de resterende epitheliale cellen te verwijderen. Herhaal deze stap drie keer.
  11. Snijd colonic weefsels in 2 x 2 mm stukjes 2 en verteren door incubatie in 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium met 0,5 mg / ml collagenase type VIII van Clostridium histolyticum en 10 U / ml DNasel.
  12. Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
  13. Incubeer de colon fragmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 35 min en vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid om de 5 min.
  14. Aan het einde van de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
  15. Verzamel de verkregen fragmenten met ze door een 70 um cel zeef geplaatst op een nieuwe 50 ml buis.
  16. Was het monster door het toevoegen van 20 ml DPBS en centrifugeer bij 400 g gedurende 5 minuten. Dan resuspendeer thij cellen in 1 ml van DPBS.
  17. Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
    1. Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.

9. Extracellulaire kleuring voor FCM Analyse

  1. Centrifuge de CLP-cellen 5 min bij 390 x g. Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS A (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,1% natriumazide)
    OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Het kan hypotensie, hypothermie, hoofdpijn convulsies of de dood veroorzaken. Verdunde oplossing van natriumazide (00,1-1,0%) meestal niet bijzonder gevaar voor de gebruiker, maar zij zijn ogen en huid irriterend. Gebruik daarom natriumazide alleen in de chemische kap terwijl het dragen van een laboratorium jas en een dubbele paar disposable nitril handschoenen.
  2. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met het monoklonale antilichaam (mAb) tegen de 2.4G2 FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug mAb / 10 6 cellen) verdund in FACS A.
  3. Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Incubeer de cellen met 0,5 ng / 10 6 cellen van de toepasselijke mAb gedurende 20 min bij 4 ° C. Verdun de antilichamen in FACS A.
  4. Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de monsters in 100 ui FACS A.
  5. Analyseer T-cellen van CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen gereconstitueerd met OT-II / Red CD4 T-cellen in de flowcytometer 37.
  6. data analyseren met behulp van commercieel verkrijgbare software.

10. Confocale microscopie Analyse

  1. Analyseer de dikke darm van de CX 3 CR1 GFP / + muizen opgelost of niet met de OT-II / Red CD4 + CD62L + T-cellen en mondeling gevoerd om de dag met 1 x 10 8 CFU E. coli-stam DH10B pCFP-OVA.
  2. Verwijder het colon van muizen met een schaar en pincet. Openen lengterichting met een dissectie schaar.
  3. Knip een 5-8 mm stuk colon monster met behulp van een schaar, zet op glas dia's en dek af met dekglaasjes.
  4. Analyseer de colon monsters met een confocale microscoop bij een vergroting van 40 / 1,30.
  5. Detecteren de CX 3 CR1 + Kamerleden, gelabeld met groene fluoresceïne eiwit (GFP), met behulp van een filter set met excitatie bij 488 nm en emissie bij 509 nm.
  6. Detecteren van CD4 + T-cel die rood proteïne met een filter set met excitatie bij 554 nm en emissie bij 586 nm.
  7. Detecteren E.coli pCFP-OVA met een filter set met excitatie bij 450 nm en emissie bij 480 nm.
  8. Definieer een gebied van belang en het genereren van scatter diagrammen zoals eerder beschreven 50 de co-lokalisatie analyse uit te voeren. Gebruik 2 verschillende formules: de Overlap Coëfficiënt volgens Manders en de Pearson's coëfficiënt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een antigeen gedreven colitis model een E. vestigen coli stam is geconstrueerd dat een plasmide waarin het gen voor het GVB gefuseerd aan de coderende sequentie voor de kippen ovalbumine eiwit en het fusie-construct tot expressie wordt gebracht onder controle van de sterke constitutieve promoter P hyper (Figuur 1A) bevat. Fluorescentiemicroscopie toont dat de recombinante E. coli pCFP-OVA, maar niet de ouderlij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Net als bij elk ander model, kan de antigeen gedreven colitis model hierboven beschreven enkele kwesties die de onderzoeker het uitvoeren van de techniek zich bewust van moet zijn te presenteren. Bij het ​​injecteren van de OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen in de gastheren, moet de onderzoeker zeer zacht en voorzichtig zijn om de naald in de buikholte. Doet u dit niet kan leiden tot het scheuren van de darm van de muis die kunnen leiden tot de dood, of een subcutane toediening van cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

JHN wordt ondersteund door de Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation KitRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Glacial acetic acidSigma-Aldrich537020 
Gel chamber PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Loading DyeThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo FisherSM0312
Ethidium bromide solutionCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Photo-documentation system Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA sequencing MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS)BiochromL182-50
Fluorescent microscope ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Electro blotter Biometra GmbH846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody Abcamab181688
Anti-rabbit IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
Ammonium chlorideSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Columns Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Columns Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Feeding Needle 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinSigma-Aldrich1496904
HematoxylinSigma-AldrichH9627
Eosin YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Collagenase type VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediumAppliChemA2044, 9050
Sodium azideSigma-Aldrich438456
Mouse BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 softwareDeNovo
Meta scanning confocal microscope ZeissLSM 710 
Zeiss WorkstationZeissLSM 7
Zeiss ZEM software Zeissv4.2.0.121
Maxisorp immuno plates NUNC, Roskilde442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphataseJackson Immuno Research016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN microplate-ELISA readerTecan
EasyWin softwareTecan
DNase I recombinant4536282001

Referenties

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

T celtransfermodelcolonic lamina propriaOT II CD4 T cellenCFP OVA expresserende E coliflowcytometrie analyseconfocale microscopie beeldvormingcelisolatieprotocolweefseldigestiemethode
Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.