Methodenartikel

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

DOI:

10.3791/54429

⸱

20 september 2016

 ,  , 
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inzicht in de vroege heterotypische interactie tussen kankercellen en het omliggende niet-kanker stroma is belangrijk bij het ophelderen van de gebeurtenissen die tot stromale activatie en vestiging van de tumor micro-omgeving (TME). Verscheidene in vitro en in vivo modellen van de TME ontwikkeld; In het algemeen deze modellen niet gemakkelijk toe isolatie van afzonderlijke celpopulaties onder niet-storende omstandigheden voor verdere studie. Om dit probleem te omzeilen, hebben wij een in vitro TME model toegepast met een celgroei substraat bestaande uit een permeabele microporeuze membraan inzetstuk toelaat eenvoudige generatie hoog verrijkte celpopulaties innig gekweekt, maar afzonderlijk, aan weerszijden van het membraan het inzetstuk voor uitgebreide co -cultuur tijden. Door het gebruik van dit model, we zijn in staat om het genereren van sterk verrijkt met kanker geassocieerde fibroblast (CAF) populaties van normale diploïde humane fibroblasten volgendeco-kweek (120 uur) met zeer metastatische humane borstcarcinoom cellen, zonder het gebruik van fluorescerende tagging en / of celsortering. Bovendien, door het moduleren van de poriegrootte van het inzetstuk kunnen we controleren voor de wijze van intercellulaire communicatie (bijvoorbeeld, gap-junction communicatie uitgescheiden factoren) tussen de twee heterotypische celpopulaties, die onderzoek naar de mechanismen verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de toestaat TME en de rol van gap-junction permeabiliteit. Dit model dient als waardevol instrument beter inzicht van de initiële gebeurtenissen die leiden tot kanker-stroma initiatie, de vroege ontwikkeling van het TME en de modulerende werking van de stroma van de reacties van kankercellen therapeutische middelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumor micro-omgeving (TME) is een zeer complex systeem omvat carcinoomcellen die naast elkaar bestaan ​​en evolueren naast gastheer stroma. Deze stromale component bestaat typisch uit fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, verschillende immune componenten, en een extracellulaire matrix 1. Een belangrijk bestanddeel, vaak de meerderheid van dit stroma, geactiveerd fibroblasten, vaak aangeduid als kanker geassocieerde fibroblasten of-carcinoom geassocieerde fibroblasten (CAF) 2,3. In tegenstelling tot normale, niet-geactiveerde fibroblasten, cafe's bijdragen aan tumor initiatie, progressie, angiogenese, invasie, metastase en herhaling 4-11 in diverse carcinomen, zoals borst, prostaat, longen, pancreas, huid, darm, slokdarm, en eierstok 5,6,12-17. Toch blijft de precieze aard van de bijdrage van cafe's de hele kanker pathogenese slecht gedefinieerd. Voorts heeft klinische aanwijzingen voorspellende waarde van cafe's aangetoond, Correleren hun aanwezigheid aan high-grade maligniteiten, therapie falen, en over het algemeen een slechte prognose 10,18,19.

Het is duidelijk dat het verbeteren van ons begrip van de initiërende gebeurtenissen in CAF ontwikkeling, evenals de intercellulaire communicatie bemiddelen hun rol binnen de TME, kan opwindende nieuwe therapeutische targets en verbeterde strategieën die de patiënt resultaten kunnen verbeteren. Teneinde dit doel zijn verscheidene in vivo en in vitro modellen ontwikkeld. Terwijl in vivo benaderingen zijn meer een afspiegeling is van TME patiënten, ze bezitten beperkingen, met inbegrip van de enorme complexiteit en de heterogeniteit binnen en tussen tumoren. Bovendien tumormonsters van proefpersonen vertegenwoordigen vaak hoogontwikkelde TME en geen inzicht in de TME initiërende gebeurtenissen niet toe. Experimentele dierstudies bieden een aantal voordelen, maar veralgemening van gegevens over dieren naar de mens moet worden gedaan met de nodige voorzichtigheid te wijten aan verschillen in physiology tussen mensen en dieren zoals knaagdieren (bijvoorbeeld thiol chemie 20, metabolisme 21, stresstolerantie 22, etc.). Verder in tegenstelling tot de menselijke populatie, die genetisch heterogeen van aard, proefdieren worden typisch gekweekt tot homogeniteit. Ook is het vaak moeilijk om voorbijgaande fysiologische variaties en wijzigingen celfenotype onderzoeken, en om te controleren voor specifieke experimentele parameters met dieren zoals knaagdieren. Dus, in vitro 2- en 3-dimensionale (2D en 3D) weefselkweek modellen worden vaak gebruikt om de basiskennis van TME ontwikkeling bevorderen. Ondanks het ontbreken van een nauwkeurige weergave van de complexiteit van in vivo systemen, deze modellen bieden vele voordelen mechanistische onderzoeken aanzienlijk vergemakkelijken. In vitro apparaten kan een eenvoudiger, gerichte en kosteneffectieve analyse van TME, waarbij statistisch significante gegevens kunnen worden gegenereerdcellen vrij van systemische variaties die zich voordoen bij dieren.

Er zijn verschillende soorten in vitro systemen. De twee meest gebruikte TME in vitro modellen bestaan ​​uit gemengde monolaag of sferoïde celculturen. Beide kweekmethoden zijn voordelig voor fundamentele studies van intercellulaire interacties (bijvoorbeeld normale cellen met tumorcellen) en voor de analyse van verschillende TME specifieke veranderingen cel fenotype (bijv ontstaan ​​van kanker-geassocieerde fibroblasten van normale fibroblasten). Bovendien kunnen de sferoïden kunnen een reflecterende weefsel structuur van het TME maken en kan representatief tumor heterogeniteit 23 zijn. Echter sferoïden leveren vaak zeer uiteenlopende zuurstofspanning gradiënten over lagen, die experimentele conclusies 24 kan bemoeilijken. Jammer genoeg, zijn beide modellen zeer beperkt in hun vermogen om pure cel populaties voor verdere karakterisering en studie volgende samenwerking te isolerencultuur. Anders zou zij ten minste één celtype worden fluorescent-gelabeld of gemerkt met een identificerend maker, en vervolgens onderwerpen van de gemengde co-kweek uitgebreide verwerking en celsortering de celpopulaties te scheiden. Terwijl een cel sorteerder kan isoleren van een vrij zuivere celpopulatie is, moet men zich bewust van cellulaire stress en mogelijke microbiële contaminatie risico 25.

Om het begrip van intercellulaire communicatie te vergemakkelijken, zijn grote inspanningen gewijd aan de ontwikkeling en het optimaliseren van in vitro systemen die nauw nabootsen van de in vivo milieu, terwijl het toelaten van een vereenvoudigde benadering. Een dergelijk instrument is de doorlaatbare microporeuze insert, een membraan substraat dat voor het eerst werd ontwikkeld in 1953 26 en vervolgens aangepast voor uiteenlopende toepassingen en studies (bijvoorbeeld cel polariteit 27, 28 endocytose, drug transport 29, weefsel modelleren 30, FERTilization 31, bystander effect 32,33, etc.). Dit systeem maakt de groei van cellen met in vivo-achtige anatomische en functionele differentiatie en expressie van vele in vivo tellers 34,35 die niet indien gekweekt op ondoordringbare plasticware waargenomen. Bovendien is de zeer dunne poreuze membraan (10 urn dik) maakt snelle diffusie van moleculen en verevening tijden, die de in vivo nabootst en maakt onafhankelijke cellulaire functioneren zowel de apicale en basolaterale domeinen cel. Een bijkomend voordeel van het inzetstuk nut als een TME systeem is de fysische scheiding van twee heterotypische celpopulaties gekweekt op beide zijden van het membraan dezelfde omgevingsomstandigheden, met behoud van verschillende wijzen van intercellulaire communicatie via het membraan poriën. Hoewel fysisch gescheiden, worden de twee celpopulaties metabolisch gekoppeld via uitgescheiden onderdelen en in dehier beschreven, ook door middel van gap-junctie kanalen. Bovendien, door het handhaven van de inzetstukken op de in vivo partiële zuurstofdruk (PO2), het model vermindert de complicaties van zuurstof en chemische gradiënten waargenomen in andere systemen. Eerder, verhoogt het begrip van natuurlijke mechanismen die de TME. Met name kunnen de twee celpopulaties eenvoudig worden geïsoleerd met hoge zuiverheid, zonder fluorescerende tagging en / of celsortering na langere co-cultuur.

Hier beschrijven we een in vitro TME protocol bestaat uit humaan borstcarcinoom cellen en humane fibroblasten gekweekt, respectievelijk aan weerszijden van een permeabele microporeuze membraan insert, maar toch continu bidirectionele communicatie via het membraan poriën. We tonen aan dat door membranen met verschillende poriegroottes, de bijdrage van een bepaald type intercellulaire communicatie (bijvoorbeeld uitgescheiden versus factoren gap junctions) de ontwikkelingvan het TME kan worden onderzocht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van Cultuur Media en cellen

  1. Bereid 500 ml Eagle's minimaal essentieel medium aangevuld met 12,5% (vol / vol) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamine en 100 eenheden penicilline en 100 pg streptomycine per ml.
    LET OP: Het groeimedium en toeslag (s) kan eenvoudig worden verwisseld voor de groei eisen van de andere cel stammen of cellijnen.
  2. Bereid 70 pi celkweekmedium voor elke insert (6 putjes insert): Eagle's minimaal essentieel medium aangevuld met 50% (vol / vol) door warmte geïnactiveerd FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine en 100 eenheden penicilline en 100 pg streptomycine per ml.
    OPMERKING: Het medium wordt aangevuld met 50% FBS om celhechting aan de onderzijde (dat wil zeggen, onderzijde) van het inzetstuk te vergemakkelijken. Het groeimedium en toeslag (s) kan eenvoudig worden verwisseld voor de groei eisen van de andere cel stammen of cellijnen.
  3. Bereid een celsuspensie van de cellen bestemd om te worden uitgeplaat op de onderkant van het inzetstuk.
    OPMERKING: Hier werden de resultaten verkregen met AG1522 normale menselijke fibroblasten gekweekt in 75 cm2 celkweekkolven en deze cellen zal dus de focus van beschrijving van de bereiding celsuspensie te zijn.
  4. Om cellen te verzamelen, verwijder het groeimedium en was de cel monolaag met 2 x 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Verwijder de PBS en verdeel 1 ml 0,25% (vol / vol) trypsine met 2,21 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), vooraf verwarmd tot kamertemperatuur (RT) over de cellen gedurende 2 minuten bij RT (kamertemperatuur).
  6. Quench trypsine activiteit 9 ml compleet kweekmedium (bereid in stap 1.1) en laat cellen door voorzichtig pipetteren de celsuspensie over het oppervlak van de kolf 10x.
  7. Bepaal de cel concentratie met behulp van een hemocytometer of elektronische teller en pipet de celsuspensie volume dat zal provide 250.000 cellen per inzetstuk in een steriele 15 ml centrifugebuis.
  8. Pellet de celsuspensie door centrifugeren (800 x g, 2 min). Suspendeer de celpellet met groeimedium (bereid in stap 1,2) tot een concentratie van 250.000 cellen per 70 ul maken.
    OPMERKING: celkweek permeabele microporeuze membraan inserts is gebaseerd op 2D substraten wordt zaaien van cellen op soortgelijke wijze uitgevoerd, behalve de cellen eerst worden gesuspendeerd in medium dat 50% (vol / vol) FBS om bevestiging te vergemakkelijken.

2. Voorbereiding van Inserts

OPMERKING: Om ervoor te zorgen steriele omstandigheden, het werk in een laminaire stroming bioveiligheidskast gewijd aan de celkweek.

  1. Select inzetstukken met een membraan poriegrootte van 0,4 pm, 1 pm of 3 pm (bepaald volgens de experimentele belang (en), de poriegrootte kan worden gebruikt om de rol van verschillende vormen van intercellulaire communicatie staand).
    Attentie: de 0.4 micrometer porie is small genoeg om de vorming van functionele gap junctions tussen cellen beperken aan weerszijden van het inzetstuk membraan en kan worden gebruikt om intercellulaire communicatie van uitgescheiden factoren te bestuderen. Dat het 1 urn en 3 urn poriën groot genoeg om de vorming van functionele gap juncties laten en kan worden gebruikt om intercellulaire communicatie zowel gap junctions en uitgescheiden factoren te bestuderen.
  2. Verwijderen individuele inserts uit de verpakking en het in een gelijke grootte met meerdere putjes.
    LET OP: er wordt zijn beschikbaar met verschillende membraanoppervlak gebieden om specifieke behoeften te passen (bijvoorbeeld 6-well, 12-well, en een 24-well inserts.). Hier werden de resultaten verkregen met de 6-well insert, en dus de focus van het model beschrijving.
  3. Dek de schaal af met het wisselplaten met de schotel deksel. Houd de multi-well schotel met beide handen voorzichtig omkeren de schotel zodanig dat het inzetstuk bodems (dat wil zeggen, de onderkant) zijn nu naar boven.
  4. Verwijder the bodem van de multi-putjes, waardoor de onderzijde van de inzetstukken. Werken met een insert in een tijd, gebruik dan een steriel pincet en voorzichtig houd de insert in plaats. Met de vrije hand, gebruik dan een pipet met een brede mond tip tot 70 ul van de celsuspensie (bereid in stappen 1,3-1,8) te trekken, met 250.000 cellen.
  5. De cellen bord, plaats de pipetpunt voorzichtig op het midden van het membraan inzetstuk en langzaam de pipet 70 pi celsuspensie terwijl langzaam de pipetpunt rond het oppervlak van het membraan. Zorg ervoor dat u de pipet tip en celsuspensie uit te breiden tot de rand van het inzetstuk.
    OPMERKING: Wat betreft de rand van het inzetstuk kan leiden capillaire spanning van de celsuspensie die naar de cellen uitdroging tijdens de bevestiging.
  6. Herhaal dit voor de resterende inserts, met zorg worden uitgeoefend niet direct over de blootgestelde inserts werken om mogelijke bacteriële besmetting te voorkomen.
  7. Voorzichtig de terugkeer van de multi-wellschotel beneden om de inzetstukken te dekken. Het houden van de schaal met inserts omgekeerde incuberen in een bevochtigde atmosfeer van 5% (vol / vol) CO 2 bij 37 ° C gedurende 30-45 min.
    Opmerking: Als de celsuspensie op de insteekcontacten de bodem van de put, til de schotel bodem en rust deze op de rand van de schaal boven, zodat het vormt een kleine hoek en maakt een grotere afstand tussen het oppervlak van de schaal en de onderzijde van de inzetstukken (waar de cellen worden). Dit voorkomt dat de cellen hechten aan het oppervlak van de putjes in plaats van het inzetstuk.
  8. Na de 30-45 min incubatietijd, verwijder voorzichtig het schaaltje met de inserts en plaats deze in de laminaire stroming bioveiligheidskast.
  9. Met twee handen en houden van de schaal deksel vast voorzichtig opnieuw omkeren van de schotel, zodat de onderzijde van de inzetstukken met de aangehechte cellen nu geconfronteerd beneden.
  10. Langzaam en voorzichtig voeg 2 ml (1 ml voor 3 micrometer porie voegt naar migrati voorkomenop van cellen door de poriën insert) voorverwarmde compleet medium (zie stap 1,1) aan elk putje zodat de bodem van het inzetstuk is ondergedompeld.
  11. Na het toevoegen van groeimedium in alle putjes die inserties, zet de schaal terug in de bevochtigde incubator.
  12. Laat de inzetstukken ongestoord blijven in de incubator gedurende 48 uur. Na 48 uur, voeden de cellen door het opzuigen 2 ml van medium vanaf de bodem van de put en het toevoegen van 2 ml vers groeimedium.
  13. Na toevoeging van vers medium aan de bodem van de put, zaad 1 ml van de tweede celpopulatie suspensie (~ 250.000 cellen / ml) aan de bovenzijde van het inzetstuk, dat reeds de eerste celpopulatie groeien op de onderzijde (deze experimenten, AG1522 (controle) cellen of kanker (experimenteel) cellen worden uitgeplaat op de bovenkant van de inserts, die al AG1522-cellen, bestemd voor CAF worden, groeien op de onderzijde van de inserts). Zet de schaal terug in de bevochtigde incubator.
    LET OP: Als het werking met cellen die niet goed hechten aan de bodem van het inzetstuk, kunnen deze cellen ook worden gekweekt op de bovenzijde van het inzetstuk.
  14. Verander het medium bij 24, 72 en 96 uur na het enten van de tweede populatie van cellen aan de bovenzijde van het inzetstuk door opzuigen van het medium boven het inzetstuk en de bodem van de put. Voorzichtig voeg 1 ml vers medium aan de bovenzijde van het inzetstuk en 2 ml aan de bodem van de put. Laat de twee celpopulaties in co-cultuur blijven aan weerszijden van het permeabele microporeuze membraan inzetstuk voor 120 uur.

3. Het verzamelen van Cellen van Insert door behandeling met trypsine

OPMERKING: Naast het gemak van het verkrijgen verrijkte celpopulaties, het inzetstuk TME model maakt het ook mogelijk voor soortgelijke experimentele behandelingen (bijvoorbeeld incubatie met chemicaliën, blootstelling aan zuurstof omstandigheden die boven of onder omgevingsatmosfeer, ioniserende stralingsbehandeling, etc.) andere in vitro TME co-cultuur modellen. Bovendien kan het permeabele insert gezamenlijke kweek substraat worden geanalyseerd door procedures reeds voor standaard 2D weefselkweek modellen. Bijvoorbeeld kunnen cellen worden geoogst uit elke zijde van het inzetstuk membraan sterk verrijkte populaties te verkrijgen, die vervolgens kan worden gebruikt voor de analyse van eindpunten (bijvoorbeeld in situ immunodetectie, Western blotting) en gekweekt gedurende 36 volgende experimenten.

  1. Om cellen te verzamelen, verwijder het inzetstuk van het groeimedium en plaats deze in een 35 mm celkweek schotel met 1 ml PBS. Was de onder- en bovenzijde van het inzetstuk 1x met 1 ml PBS.
  2. Verwijder de PBS en voeg 200 ul 0,25% (vol / vol) trypsine met 2,21 mM EDTA, voorverwarmd tot kamertemperatuur.
    1. Indien het verzamelen van de cellen gegroeid op de onderzijde van het inzetstuk, plaats de trypsine oplossing in de 35 mm schaal en plaats voorzichtig de onderkant van het inzetstuk in de trypsine oplossing gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Indien het verzamelen van de cels geteeld op de bovenzijde van het inzetstuk, plaatst het inzetstuk in een 35 mm schaal en voeg de trypsineoplossing naar de top van het inzetstuk en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Quench trypsine activiteit door toevoeging van 800 pl compleet groeimedium.
    1. Indien het verzamelen van de gekweekte cellen op de bodem van het inzetstuk, voeg het groeimedium op de mm schaal 35 en het verzamelen van de cellen door voorzichtig pipetteren de 1 ml celsuspensie over het oppervlak van het inzetstuk 10x, waarbij het inzetstuk vastgehouden op geringe hoek, zodat de celsuspensie verzameld in de schaal.
    2. Indien het verzamelen van de cellen van de bovenkant van het inzetstuk, voeg het groeimedium aan de bovenzijde en voorzichtig pipet 1 ml van de celsuspensie over het oppervlak van het inzetstuk 10x.

4. Karakterisering van de Cel Zuiverheid door flowcytometrie

Opmerking: Om het vermogen van het permeabele microporeuze membraan inserts om de zuiverheid van t handhaven karakteriserenhij twee celpopulaties (dat wil zeggen, boven en onder) gedurende 120 uur, secties 1-3 werden uitgevoerd, met groen fluorescerend eiwit (GFP) gemerkte MDA-MB-231 cellen die zijn uitgeplaat op de bovenzijde van het inzetstuk, en non-GFP-gelabeld AG1522-cellen worden uitgeplaat op de onderkant van 0,4 μm-, 1 μm- of 3 urn poriën inserts.

  1. Zodra de cellen van de onderzijde van het inzetstuk verzameld (procedure beschreven in hoofdstuk 3), de pellet celsuspensie door centrifugeren (500 g, 30 sec).
  2. Verwijder de supernatant en suspendeer de celpellet in 400 gl Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 1% (vol / vol) FBS.
  3. Cytometrische analyse uitvoeren op een flowcytometer uitgerust met een 488 nm laser om GFP en een 530/30 banddoorlaatfilter van GFP fotonemissie 37 detecteren wekken.
  4. Voor cel identificatiedoeleinden gebruiken AG1522 controle celpopulaties om vooruit te passen en zijwaartse verstrooiing spanningen op de flowcytometer. aanpassenhet GFP-kanaal spanning naar de cellulaire autofluorescentie waarde als de onderste detectiegrens voor GFP sein.
  5. Bepaal venstertijd drempel met behulp van controle cellen. Beoordelen zuiverheid van elke celpopulatie basis van de aanwezigheid van GFP-positieve cellen versus controle.
    OPMERKING: Een zuivere populatie zou een afspiegeling is van geen GPF-positieve cellen gedetecteerd.

5. Karakterisering van cellen door in situ Immunofluorescentie

  1. Na behandeling met trypsine van cellen uit het inzetstuk (zie punt 3), het verzamelen van cellen, plaat 5 x 10 4 cellen in 250 ul groeimedium (zie stap 1.1) op steriele glazen dekglaasjes, en laten hechten gedurende 1 uur in een vochtige atmosfeer van 5% (vol / vol) CO 2 bij 37 ° C incubator.
  2. Aan het einde van de incubatie, verwijder voorzichtig het schaaltje met het dekglaasje en plaats het in de laminaire stroming bioveiligheidskast.
  3. Voeg voorzichtig 2 ml voorverwarmde compleet medium (zie stap1,1) aan elke schotel, zodat het dekglaasje wordt ondergedompeld.
  4. Na toevoeging van groeimedium alle schalen met dekglaasjes terug de schalen in een bevochtigde atmosfeer van 5% (vol / vol) CO 2 bij 37 ° C in een incubator gedurende 48 uur.
  5. Na 48 uur incubatie, was het monster 3x met PBS en bevestig met 4% (w / v) formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Spoel 5x met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) en vervolgens doorlaatbaar met 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (gew / vol) saponine gedurende 5 minuten bij RT.
  7. Blok niet-specifieke bindingsplaatsen met 2% (vol / vol) normaal geitenserum (NGS), 1% (gew / vol) runderserumalbumine (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (blocking oplossing) gedurende 1 uur bij KT.
  8. Incubeer met primair antilichaam (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) in blokkeeroplossing bij 4 ° C overnacht.
  9. Afwassen ongebonden primaire antilichamen (3x, 5 min / was) met 0,2% NGS (vol / vol), 1% (w / v) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (wasoplossing).
  10. Incubeer met secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het blokkeren van oplossing (zie paragraaf 5.4).
  11. Afwassen ongebonden secundair antilichaam (3x, 5 min / was) met wasoplossing (zie stap 5.6).
  12. Mount coverslips op een dia met een anti-fade montage medium met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), en afdichting met nagellak.
  13. Acht cellen met een 63x olie vergroting doelstelling op een omgekeerde microscoop uitgerust met een externe lichtbron voor fluorescentie excitatie en beelden vastleggen met een aangesloten digitale camera voor verdere analyse.

6. Karakterisering van cellen door Western Blot

NB: De Western blot procedure wordt elders 38 beschreven. Een korte schets wordt hier beschreven:

  1. Na losmaken van cellen uit het inzetstuk door behandeling met trypsine (zie punt 3), pellet de celsuspensie door centrifugeren (500 g, 30 sec).
  2. Verwijder supernatant en schorten de celpellet 2x met 100 pi PBS.
  3. Verwijder supernatant en lyseren cellen in 50 ul van gemodificeerde radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), natriumdeoxycholaat monohydraat (DOC) 0,5% (vol / vol), natriumdodecylsulfaat (SDS) 0,1% (vol / vol)), die protease en fosfatase-inhibitor cocktail.
  4. Incubeer gedurende 20 min op ijs en gecentrifugeerd bij 19.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C.
  5. Bepaal de concentratie van eiwitten in het supernatant met een optische dichtheid eiwit assay, verenigbaar met de detergentia in RIPA buffer.
  6. Afzonderlijke eiwitten door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en electroblot op een 0,2 um nitrocellulose membraan.
  7. Incubeer membranen in TBS bevattende 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) en 4% (w / v) afgeroomde melk (blokkeeroplossing) gedurende 60 min en reageren met primaire antilichaam bij 4 ° C overnacht (anti-CAV1, 1: 1000).
  8. Was membraan 3x met TBST bij kamertemperatuur (5 min / was).
  9. Incubeer membranen gedurende 30 min in blokkerende oplossing die een anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) (1: 5000).
  10. Was membraan 3x met TBST bij kamertemperatuur (5 min / was).
  11. Visualiseren reactieproducten met behulp van een chemiluminescentie Western blotting detectiesysteem.

7. Karakterisering van intercellulaire communicatie door middel van flowcytometrie

OPMERKING: Om het aanpassingsvermogen van het doorlaatbare microporeuze membraan karakteriseren voegt aan verschillende vormen van intercellulaire communicatie (bijvoorbeeld uitgescheiden factoren, gap junctions) te onderzoeken. 1-2,12 secties werden uitgevoerd met niet-fluorescerende AG1522-cellen worden uitgeplaat op de onderkant van 0,4 μm-, 1 μm- of 3 urn poriën inserts.

  1. Cultuur non-gelabelde AG1522 cellen in een 35 mm schaal tot 90% samenvloeiing met behulp van medium in paragraaf 1.1 beschreven.
  2. Rinse 1x cellen met 1 ml HBSS.
  3. Load cellen met Calcein AM door incubatie van cellen in HBSS dat 30 uM calceïne AM.
  4. Incubeer gedurende 15 min in een bevochtigde atmosfeer van 5% (vol / vol) CO 2 bij 37 ° C.
  5. Was cellen 2x met 1 ml HBSS.
  6. Trypsinize cellen door toevoeging van 200 pi oplossing van 0,25% (vol / vol) trypsine met 2,21 mM EDTA gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Quench trypsine activiteit door toevoeging van 800 pl compleet medium dat 12,5% (vol / vol) FBS.
  8. Breng cellen in suspensie door herhaalde pipetteren.
  9. Bepaal celconcentratie met behulp van een hemocytometer of elektronische teller en plaat 250.000 cellen beladen met calceïne AM aan de bovenzijde van inserts die al AG1522 cellen groeien op de onderzijde.
  10. Incubeer de inzetstukken in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C 6 uur.
  11. Na 6 uur, laat cellen van de onderzijde van de inserts, zoals beschrevenin hoofdstuk 3.
  12. Pellet de celsuspensie door centrifugeren (500 g, 30 sec).
  13. Verwijder de supernatant en suspendeer de celpellet in 400 ui HBSS aangevuld met 1% (vol / vol) FBS.
  14. Analyseer de cellen op een cytometer uitgerust met een laser en filter kunnen opwekken en detecteren van de emissie van Calcein (496 nm en 516 nm respectievelijk), per fabrikant protocol.
  15. Voor cel identificatie, gebruik een ongekleurde AG1522 controle celpopulatie om vooruit en zijwaartse verstrooiing spanningen cytometer aan te passen op de stroom. Stel de Calceïne kanaal spanning naar de cellulaire autofluorescentie waarde als de onderste detectiegrens voor Calcein sein.
  16. Bepaal de bovenste drempelwaarde met behulp van calceïne geladen controle cellen. Beoordelen communicatie per tussenvoegen basis van calceïne-positieve cellen versus controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier aangepast we een permeabele microporeuze membraan inzetstuk een in vitro heterotypic cel co-kweeksysteem dat in vivo tumor micro (figuur 1) nabootst ontwikkelen. Dit systeem maakt twee verschillende celpopulaties worden gekweekt op beide zijden van het inzetstuk poreuze membraan gedurende langere tijd (tot 120 uur, in ons gebruik). Vooral het stelsel kan handhaven van de zuiverheid van de celpopulaties, zoals bepaald door uitplating GFP-gelabeld MD...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven protocol een eenvoudig, flexibel in vitro procedure (figuur 1) die gebruik maakt van een permeabele microporeuze membraan insert te hoog verrijkt afzonderlijke celpopulaties van een co-kweek van cellen heterotypische genereren. Belangrijk is het model geschikt voor het onderzoeken van verschillende wijzen van intercellulaire communicatie. De kritische stappen omvatten het kiezen van de juiste poriegrootte insert specifieke experimentele belang (s), enten van de eerste celpopu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende of tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), de National Institutes of Health (CA049062) en de National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor celkweek
AG01522 (d.w.z. AG1522) menselijke diploïde fibroblastCoriell107661Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 borstcarcinoom cellijnPerkinElmer119261Moederlijn: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP borstcarcinoom cellijnCell BiolabsAKR-201
Eagle's minimaal essentieel medium (MEM)Corning Cellgro15-010-CV
Foetaal bovien serum (FBS), gekwalificeerdSigmaF6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)Corning Cellgro25-015-Cl
Penicilline Streptomycine Oplossing, 100xCorning Cellgro30-002-Cl
Transwell Insert (d.w.z. permeabele microporeuze membraaninsert) (0,4 μm porie)Costar3450
Transwell Insert (d.w.z. permeabele microporeuze membraaninsert) (1 μm porie)Greiner bio-one657610
Transwell Insert (d.w.z. permeabele microporeuze membraaninsert) (3 μm porie)Costar3452
6-well Cultuur PlaatGreiner Bio-One Cellstar657160-01
75 cm2 celkweekkolfCellStar658 170
Fosfaat-Buffered Saline (PBS), 1xCorning Cellgro21-040-CVzonder calcium & magnesium
0,25% (vol/vol) Trypsine, 2,21 mM EDTA, 1xCorning Cellgro25-053-Cl
15 ml CentrifugebuisCellTreat229411
35 mm x 10 mm Celkweek SchaalGreiner bio-one627 160
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor immunofluorescente microscopie
Muis anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406In situ Immunofluorescence - 1:5.000
Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundaire Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaatThermoFisher ScientificA-11029In situ Immunofluorescence - 1:2.000
Rundserum Albumine - Fractie VRocklandBSA-50Vrij van immunoglobuline en protease
16% (wt/vol) Formaldehyde OplossingThermoFisher Scientific28908Verdun tot 4% met 1x PBS
Premium Dekglas (22 mm x 22 mm No.1)Fisher12548B
Triton X-100SigmaT8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagens met DAPIInvitrogenS36938
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor flowcytometrische analyse
Calcein, AMMolecular ProbesC3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-076
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor Western Blot analyse
Muis anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406Western Blot - 1:1.000
Tween-20BioRad170-6531
Nitrocellulose Membraan (0,2 μm)BioRad162-0112
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL104001EA
BioRad DC Protein AssayBioRad500-0116
Natrium dodecylsulfaat (SDS)BioRad161-0302
Natrium deoxycholaat monohydraat (DOC)SigmaD5670
IGEPAL CA-630 (NP40)SigmaI8896
30% Acrylamide/Bis Oplossing, 37,5:1BioRad161-0158

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407(2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638(2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387(2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540(2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65(2002).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  39. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  40. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  41. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  42. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102(2013).
  43. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  44. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  45. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  46. Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313(2011).
  47. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  48. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310(2013).
  49. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  50. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  51. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cancer Associated FibroblastsCell Culture InsertsGap Junction PermeabilityCo Culture ModelMicroporous MembranePore Size ModulationFluorescence Microscopy

Gerelateerde artikelen