Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

Inzicht in de vroege heterotypische interactie tussen kankercellen en het omliggende niet-kanker stroma is belangrijk bij het ophelderen van de gebeurtenissen die tot stromale activatie en vestiging van de tumor micro-omgeving (TME). Verscheidene in vitro en in vivo modellen van de TME ontwikkeld; In het algemeen deze modellen niet gemakkelijk toe isolatie van afzonderlijke celpopulaties onder niet-storende omstandigheden voor verdere studie. Om dit probleem te omzeilen, hebben wij een in vitro TME model toegepast met een celgroei substraat bestaande uit een permeabele microporeuze membraan inzetstuk toelaat eenvoudige generatie hoog verrijkte celpopulaties innig gekweekt, maar afzonderlijk, aan weerszijden van het membraan het inzetstuk voor uitgebreide co -cultuur tijden. Door het gebruik van dit model, we zijn in staat om het genereren van sterk verrijkt met kanker geassocieerde fibroblast (CAF) populaties van normale diploïde humane fibroblasten volgendeco-kweek (120 uur) met zeer metastatische humane borstcarcinoom cellen, zonder het gebruik van fluorescerende tagging en / of celsortering. Bovendien, door het moduleren van de poriegrootte van het inzetstuk kunnen we controleren voor de wijze van intercellulaire communicatie (bijvoorbeeld, gap-junction communicatie uitgescheiden factoren) tussen de twee heterotypische celpopulaties, die onderzoek naar de mechanismen verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de toestaat TME en de rol van gap-junction permeabiliteit. Dit model dient als waardevol instrument beter inzicht van de initiële gebeurtenissen die leiden tot kanker-stroma initiatie, de vroege ontwikkeling van het TME en de modulerende werking van de stroma van de reacties van kankercellen therapeutische middelen.

Introduction

De tumor micro-omgeving (TME) is een zeer complex systeem omvat carcinoomcellen die naast elkaar bestaan ​​en evolueren naast gastheer stroma. Deze stromale component bestaat typisch uit fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, verschillende immune componenten, en een extracellulaire matrix ^1. Een belangrijk bestanddeel, vaak de meerderheid van dit stroma, geactiveerd fibroblasten, vaak aangeduid als kanker geassocieerde fibroblasten of-carcinoom geassocieerde fibroblasten (CAF) ^2,3. In tegenstelling tot normale, niet-geactiveerde fibroblasten, cafe's bijdragen aan tumor initiatie, progressie, angiogenese, invasie, metastase en herhal....

Protocol

1. Bereiding van Cultuur Media en cellen

1. Bereid 500 ml Eagle's minimaal essentieel medium aangevuld met 12,5% (vol / vol) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamine en 100 eenheden penicilline en 100 pg streptomycine per ml.
   LET OP: Het groeimedium en toeslag (s) kan eenvoudig worden verwisseld voor de groei eisen van de andere cel stammen of cellijnen.
2. Bereid 70 pi celkweekmedium voor elke insert (6 putjes insert): Eagle's minimaal essentieel medium aangevuld met 50% (vol / vol) door warmte geïnactiveerd FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine en 100 eenheden penicilline en 100 pg streptomycine per ml.
   ....

Results

Hier aangepast we een permeabele microporeuze membraan inzetstuk een in vitro heterotypic cel co-kweeksysteem dat in vivo tumor micro (figuur 1) nabootst ontwikkelen. Dit systeem maakt twee verschillende celpopulaties worden gekweekt op beide zijden van het inzetstuk poreuze membraan gedurende langere tijd (tot 120 uur, in ons gebruik). Vooral het stelsel kan handhaven van de zuiverheid van de celpopulaties, zoals bepaald door uitplating GFP-gelabeld MD.......

Discussion

De hier beschreven protocol een eenvoudig, flexibel in vitro procedure (figuur 1) die gebruik maakt van een permeabele microporeuze membraan insert te hoog verrijkt afzonderlijke celpopulaties van een co-kweek van cellen heterotypische genereren. Belangrijk is het model geschikt voor het onderzoeken van verschillende wijzen van intercellulaire communicatie. De kritische stappen omvatten het kiezen van de juiste poriegrootte insert specifieke experimentele belang (s), enten van de eerste celpopu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 ml Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158