Murine flexorpeesletsel en Repair Surgery

Samenvatting

Flexorpezen in de hand worden vaak gewond, wat leidt tot een verminderde handfunctie. Echter, het littekenweefsel genezende reactie niet goed gekarakteriseerd. Een muizenmodel van flexorpees genezing is hier gedemonstreerd. Dit model kan algemeen begrip van het genezingsproces te verbeteren en therapeutische benaderingen om de genezing te verbeteren beoordelen.

Samenvatting

Pees verbindt het skelet spieren en botten, het vergemakkelijken van de beweging van bijna het hele lichaam. In de hand, flexorpezen (FTS) maken buiging van de vingers en de algemene handfunctie. Verwondingen aan de FTS komen vaak voor, en bevredigende genezing wordt vaak aangetast als gevolg van teveel littekenweefsel en verklevingen tussen de pees en het omringende weefsel. Er is echter weinig bekend over de moleculaire en cellulaire componenten van FT reparatie. Daartoe een muizenmodel van FT reparatie die vele aspecten van genezing bij de mens, waaronder verminderde beweeglijkheid recapituleert en verminderde mechanische eigenschappen, ontwikkeld en eerder beschreven. Hier een diepgaande demonstratie van deze chirurgische procedure verschaft, waarbij doorsnijding en daaropvolgende reparatie van de flexor digitorum longus (FDL) pees in de achterpoot van muizen. Deze techniek kan worden gebruikt om lineage analyse van verschillende celtypen te voeren, de effecten van gen winst of verlies-van-functie getest, en de effi testenciëntie van farmacologische interventies in het genezingsproces. Er zijn echter twee belangrijke beperkingen aan dit model: i) het FDL pees in het middengedeelte van het muizen achterpoot, waarbij de doorsnijding en reparatie optreden, wordt niet omgeven door een synoviale schede. Derhalve Dit model houdt geen rekening met de mogelijke bijdrage van de mantel om de littekenvorming proces. ii) Om de integriteit van de reparatieplaats beschermen, is de FT vrijgegeven op het myotendinous knooppunt, het verminderen van de mechanische krachten van de pees, waarschijnlijk bijdragen aan de grotere littekenvorming. Isolatie van voldoende cellen van het granulatieweefsel van de FT tijdens het genezingsproces voor flowcytometrische analyse moeilijk gebleken; cytologie centrifugatie aan deze cellen concentraat is een alternatieve methode, en zorgt voor het genereren van celpreparaten, waarop immunofluorescentie labeling kan worden uitgevoerd. Met deze methode kwantificering van cellen of eiwitten van belang tijdens FT genezing mogelijk.

Inleiding

Flexor pezen in de hand werken samen met de flexor spieren van de onderarm en digitale omhulsels flexie van de cijfers en grijpfunctie van de hand mogelijk. Flexorpezen lopen langs de palmaire aspect van de hand; deze relatief oppervlakkige locatie resulteert vaak in verwondingen aan de flexorpezen tijdens trauma aan de kant. Pezen genezen door middel van een littekenweefsel respons in plaats van regeneratie van normaal peesweefsel ^1. Hoewel dit littekenweefsel biedt continuïteit van de pees, wordt de functie drastisch afgenomen ten opzichte van een gezonde pees. Pees-littekenweefsel composieten worden gekenmerkt door een verminderde mechanische eigenschappen ^1, waardoor het gerepareerde pezen meer kans op scheuren. Bovendien littekenweefsel mist de organisatie van het natieve collageen pees vezelstructuur, resulterend in een toename van de pees grootte en massa. Gezien de anatomische beperkingen van de pees-hulseenheid zelfs bescheiden toename pees grootte kunnen drastisch rodeUCE de glijdende functie van de pees, en dus digit bereik van de beweging en handfunctie.

Voorafgaand aan de verwondingen 1960 om de pezen, met name in zone II van de hand, niet routinematig gerepareerd vanwege de ernstige complicaties bij de genezing die zich tijdens deze reparatie ^2. Dit gebied van de hand werd aangeduid als 'niemandsland' ^3. Echter, zijn verbeteringen in chirurgische technieken, hechtdraad patronen en fysiotherapie revalidatie protocollen sterk verbeterde resultaten van flexorpees reparaties ^2. Ondanks deze vooruitgang, tot 40% van reparaties leiden tot voldoende adhesie formatie handfunctie ⁴ belemmeren. Daarom is een biologische benadering bij genezing verbeteren. Helaas, zeer weinig bekend over de pees genezingsproces op cellulair en moleculair niveau. Derhalve was het doel een murine model dat kan worden gebruikt om de fundamentele understandin ontwikkelen ter verbeteringg de cellulaire en moleculaire componenten van buigpees genezing en littekenvorming respons, als middel om nieuwe therapeutische targets te identificeren om genezing te verbeteren.

Grotere diermodellen zijn instrumenteel in het bevorderen van begrip van de flexorpees genezingsproces geweest. Honden en konijnen studies hebben aangetoond dat zowel de intrinsieke als extrinsieke herstellend vermogen van pezen ^5,6, het belang van vroegtijdige gecontroleerde passieve beweging minimaliseren adhesies opzichte van immobilisatie ^7, evenals de effecten van verschillende patronen op de hechtdraad genezingsproces ^{8 , 9.} Bovendien heeft het hondenmodel bruikbaar bij testen translationele weefselmanipulatie benaderingen genezing ¹⁰ verbeteren. Er zijn echter een aantal belangrijke voordelen in het gebruik van een muizenmodel opzichte van een groot diermodel, zoals de relatieve kosten, beschikbaarheid van muis specifieke reagentia en het gemak van generating globaal Knock-outs of weefsel-specifieke schrapping / overexpressie constructen. Bovendien is de functionele overeenkomst tussen menselijk en muizen ten opzichte flexorpezen ¹¹ geven de potentiële bruikbaarheid bij de ontwikkeling van een muismodel.

Ontwikkeling van een muizenmodel van flexorpees doorsnijding en reparatie bootst vele aspecten van klinische genezing, met inbegrip van de vorming van overvloedige littekenweefsel en verminderde mechanische eigenschappen. De hier beschreven model is een echte herhaling van klinische praktijk door doorsnijden van de FDL de myotendinous knooppunt om de reparatieplaats beschermen. Bovendien heeft dit model geen rekening met de bijdrage van synoviale cellen huls wordt genezing, aangezien er geen synoviale schede die het middengedeelte van de pees waar de reparatie plaatsvindt. Ondanks deze beperkingen heeft dit model het voordeel van het genereren bereik van beweging te beperken adhesies, die nog moet worden aangetoond bij muizenmodellen die meer closely benaderen de klinische scenario. Dit model is gebruikt om knock-out muismodellen ^12,13 beoordelen en om verschillende farmacologische benaderingen om de genezing ^14-17 te verbeteren testen. Histologische analyses van dit model, middels immunohistochemie en in situ hybridisatie, kunnen belangrijke inzichten in de lokalisatie van belangrijke genen en eiwitten bieden tijdens de genezing. Echter, histologie geeft slechts een dwarsdoorsnede ruimtelijke analyse en maakt kwantificering niet mogelijk het gehele weefsel. Flowcytometrie is een meer kwantitatieve benadering, maar slechts een zeer beperkt aantal cellen kunnen worden geïsoleerd uit de genezing peesweefsel in het muismodel, en dit aantal verder af tijdens fixatie, permeabilisatie en wasstappen. Neemt dit in rekening flowcytometrie wordt een benadering onhaalbaar als gevolg van het aantal dieren dat nodig zou zijn. Een alternatieve methode moet de meerderheid van dit kleine celpopulatie behouden omverder karakteriseren genezing milieu. De methode die wordt gebruikt om dit te bereiken, hier afgebeeld, houdt de concentratie van de geïsoleerde cellen via cytologie centrifugeren op een glasplaatje, gevolgd door immunocytochemie. In de onderhavige studie EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine een thymidine analoog) incorporatie en naderhand coderen werd gebruikt om de relatieve proliferatieve toestand van cellen te bepalen op de genezing plaats. Deze benadering kan worden toegepast om de effectiviteit van farmacologische behandelingen testen celproliferatie, gen knock-out of overexpressie, of verschillende celpopulaties identificeren en te kwantificeren.

Protocol

De Universitaire Commissie Animal Research aan de Universiteit van Rochester keurden alle dierproeven. Ten-12 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J muizen werden gebruikt.

1. Voorbereiding van de dieren voor flexorpees Surgery (~ 15 min)

1. Autoclaaf chirurgische instrumenten te steriliseren, draag steriele handschoenen in, en handhaven van een steriele operatiekamer veld.
2. Verdoven de muis via intraperitoneale injectie (ip) met een volume van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) gevonden volgens lichaamsgewicht. Bevestig diepte van sedatie via afwezigheid van teen-snuifje reflex.
3. Dien pre-emptieve analgesie (buprenorfine, 0,05-0,1 mg / kg) via subcutane injectie. Solliciteer oogzalf voor de ogen niet uitdrogen.
4. Bereid de chirurgische plaats door het knippen van de vacht op de gehele achterste ledematen. Steriliseren de huid door schrobben achtereenvolgens met povidonjood, gevolgd door 70% ethanol, en opnieuw met povidonjood.

2. Murine flexorpeesletsel en Repair Surgery (~ 10 min)

1. Vind de flexor digitorum longus (FDL) pees, oppervlakkig gezien op de mediale zijde van het kalf. Met behulp van een scalpel een kleine 0,5-1 cm incisie in de huid met micro-schaar om de pees bloot.
2. Gebruik een tang om de FDL pees te scheiden van het omliggende weefsel en sporenelementen het aan de myotendinous kruising. Snijd de pees aan deze kruising met veer schaar om het vrij te geven, zorg ervoor dat de posterior tibialis voorkomen.
3. Sluit de huid met 5-0 nylon hechtingen.
   Opmerking: De FDL transsectie en reparatie (stap 2,4) worden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop.
4. Maak een 3 mm incisie over de posterolaterale aspect van de achterpoot met behulp van de lente micro-schaar. Zachtjes trekken de omliggende zachte weefsel en spier met een pincet, en zorg ervoor dat weefselschade te minimaliseren, en identificeren van de FDL pees.
   1. Voorzichtig verhogen van de FDL pees en volledig doorsnijden met behulp van micro-schaar. Hecht de einden van de pees FDL samen in een gemodificeerde Kessler patroon met 8-0 hechtingen, vermijden drogen van de pees door periodiek bevochtigen met zoutoplossing.
   2. Vervang zacht weefsel en spieren over de pees, sluit de incisie met 5-0 nylon hechtingen.
5. Plaats muizen op een dia warmer set tot 37 ° C, om de lichaamstemperatuur te handhaven totdat uit narcose hersteld.
6. Monitor muizen post-operatief op tekenen van stoornissen of infectie, waaronder een verhoogde vocalizing en gegolfde vacht. Injecteer buprenorfine (50 ul / muis) als analgeticum elke 12 uur tot muizen tekenen van pijn of angst niet meer weergegeven.
7. Laten genezen muizen gedurende 10 dagen na de operatie over te gaan naar de volgende stappen.
   Opmerking: Cellen kunnen op elk tijdpunt postoperatieve worden geoogst. Hier worden 10 dagen gekozen deze representatieve experimenten gezien de relatief hoge cellulariteit van het weefsel op dit moment.

3. Labellng delende cellen (~ 10 min)

1. Bereid EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine) oplossing (10 mg / ml in steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] + 1% dimethylsulfoxide [DMSO] om de oplosbaarheid te verhogen).
2. Injecteer muizen met 100 gl edu (50 mg / kg) via ip injectie 24 uur voorafgaand aan offeren.

4. Harvest Cellen voor Cytologie centrifugeren (2,5 uur, ~ 30 min Hands-on Time)

1. Bereid 3 mg / ml collagenase I in PBS.
2. Euthanaseren muis via kooldioxide stikken met een debiet van niet meer dan 3 l / min, en voeren cervicale dislocatie als secundaire maatregel.
3. Zoek de gerepareerde pees behulp stap 2.4 en isoleren peesweefsel door snijden ongeveer 2 mm aan weerszijden van de verwonding met micro-schaar.
   1. Gehakt weefsel met scalpel in een petrischaal met 1 ml 3 mg / ml collagenase, vervolgens doorgeven mengsel door een 18 G naald meerdere malen te breken van het weefsel. Verzamel mengsel in een 1,5 ml centrifugebuis.
   2. Digest peesweefsel gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.
   3. Spin weefsel beneden (300 xg gedurende 5 minuten), aspireren collagenase, dan resuspendeer cellen / weefsels met 500 pi 3% bovine serum albumine (BSA) in PBS en neer te pipetteren meerdere malen.
   4. Filter celsuspensie door een 70 um cel zeef om puin en grote stukken van de pees en opzij gezet in een 37 ° C incubator te verwijderen.
   5. Plaats peesweefsel in een andere 1,5 ml centrifugebuis en verfrissen met 1 ml collagenase oplossing pipetteren en om te mengen.
   6. Incubeer weefsel nog een uur bij 37 ° C onder schudden.
   7. Spin down gedigereerd peesweefsel (300 g gedurende 5 min), vervolgens resuspenderen in 500 pi 3% BSA in PBS en neer te pipetteren meerdere malen.
   8. Filter celsuspensie door een 70 um cel zeef, te combineren met ophanging geïsoleerd in 4.3.3, tel dan cellen met een hemocytometer.
   9. Was de cellen eenmaal met 3% BSA in PBS, vervolgens resuspenderen tot 3-610 x ^4/100 ul.
4. Bevestig een cytologie trechter om een ​​positief geladen glijbaan en vergrendelen in de slide carrier. Steek de gehele inrichting in een cytologie centrifuge en voeg 100 ul celsuspensie aan de trechter. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te dispergeren op de dia.

5. Immunocytochemie te detecteren Edu (2 uur, ~ 45 min Hands-on Time)

Opmerking: Alle incubatie stappen moeten in het donker worden uitgevoerd om fotobleken van fluoroforen te beperken.

1. cellen cirkel met een hydrofobe barrière pen oplossing nodig voor volgende stappen minimaliseren, dan onmiddellijk vast met 150 pi 3% paraformaldehyde in PBS 15 min bij kamertemperatuur (RT).
   1. Was tweemaal gedurende 5 minuten met 150 ul 3% BSA in PBS.
   2. Doorlaatbaar cellen met 0,5% Triton X-100 in PBS 20 min bij kamertemperatuur.
   3. Herhaal wasstap zoals in 5.1.1.
2. Bereid EDU reactie cocktail volgens de kit instructies niet meer dan 30 minuten voor gebruik.
   1. Voeg 150 ul cocktail elke dia, incubeer 30 min bij kamertemperatuur.
   2. Herhaal wasstap zoals in 5.1.1.
3. Incuberen met 150 ui nucleaire tegenkleuring Hoechst33342 verdund 1: 2000 in PBS 30 min bij kamertemperatuur.
   1. Was tweemaal gedurende 5 minuten met 150 pl 1x PBS.
4. Voeg 1-2 druppels anti-fade montage medium om cellen, dan langzaam lager dekglaasje om luchtbellen te voorkomen.
   1. Sta fixeermiddel een nacht uitharden in het donker bij kamertemperatuur.
   2. Gebruik duidelijke nagellak aan de dekglaasje aan de dia af te dichten.
5. Opname schuift 40x vergroting met behulp van een fluorescentiemicroscoop met excitatie / emissie filters kunnen detecteren DAPI (Hoeschst33342) en Texas Red (Alexa Fluor 594).

Resultaten

Flexor digitorum longus (FDL) spieren in de kuit, werkt om de cijfers van de muis achterpoot buigen via de flexorpees (blauwe omtrek in figuur 1A en histologisch figuur 2A), die proximaal loopt van de myotendinous knooppunt en eindigt in de distale vingerkootjes. In dit model van flexorpees genezing, is de FDL pees doorgesneden en gerepareerd in het midden van de voet, proximaal van de vertakking in de cijfers van de achterpoot (rode pijlen, Figu...

Discussie

De chirurgische procedure voor een muizenmodel van volledige doorsnijding en reparatie van de flexor digitorum longus pees wordt in deze studie. Daarnaast een nieuwe toepassing van concentratie kleine celpopulaties met cytologie centrifuge blijkt, waardoor kwantitatieve immunocytochemische analyse van de cellulaire omgeving tijdens flexorpees genezing. Dit model van flexorpeesherstel toont een reproduceerbare genezende reactie, die kan worden gebruikt om wijzigingen in het genezingsproces behulp knockout modellen of far...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chirurgische voorbereiding
C57BL/6J muizen	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorfine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0,9% natriumchloride irrigatie	Hospira	NDC# 0409-6138-03	Voor bereiding van ketamine/xylazine en buprenorfine oplossingen
1 ml spuit	BD	309659
30 G naald	BD	305106
Povidon-jood-oplossing	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube veterinaire oftalmische zalf	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chirurgische gereedschappen
Draagbare weegschaal 200 g	Ohaus	SP202
Verenschaar	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 pincet	Fine Science Tools	11251-30
Naaldhouders	Fine Science Tools	91201-13
Micro verenschaar	Fine Science Tools	15003-08
Micro naaldhouders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon hechtdraad	Ethicon	668G
8-0 microchirurgie nylon hechtdraad	Ethicon	2808G
Lab-Line histologie schuiflade-verwarmer	Barnstead International	26025
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cytospin-methode
Collageenase Type I, gelyofiliseerd	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumine	Cell Signaling Technologies	9998S
1x PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytologie trechters	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscoopglazen	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Immunoctytochemie
Glijden kleurenlade met zwart deksel	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Bevat EdU en  Hoeschst 33342
Immedge hydrofobe barrièrepen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond montagemiddel	Thermo Fisher	P36970
Glazen deksels 24 x 50 mm #1.5
Klare nagellak