Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in E. coli Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Obstakels van DNA, met inbegrip strak gebonden eiwitten en verscheidene laesies, kan ernstig de progressie van de cel replicatieapparatuur remmen. De blokkering van een replisome kan leiden tot de dissociatie van het chromosoom, hetzij gedeeltelijk of volledig, wat leidt tot de ineenstorting van de replicatie vork. Het herstel van deze val is een noodzaak voor de cel nauwkeurig volledige chromosomale duplicatie en vervolgens verdelen. Daarom, wanneer de instorting optreedt, de cel geëvolueerd diverse mechanismen die plek om de DNA vork te herstellen en laat replicatie neem aan te vullen met high fidelity. Eerder zijn deze replicatie herstel pathways in bacteriën bestudeerd met behulp van UV-schade, die het nadeel van het niet gelokaliseerd op een bekende plaats heeft. Dit manuscript beschrijft een systeem met behulp van een fluorescentie-repressor Operator System (FROS) om een ​​site-specifiek eiwit blok dat de stalling en de ineenstorting van de replicatie fo kan induceren creërenrks in Escherichia coli. Protocollen detail hoe de status van replicatie kan worden gevisualiseerd in enkelvoudige levende cellen middels fluorescentiemicroscopie en DNA replicatie tussenproducten kunnen worden geanalyseerd door 2-dimensionale agarose gelelektroforese. Temperatuurgevoelige mutanten van replisome componenten (bijv DnaBts) kunnen in het systeem worden opgenomen om een synchrone ineenstorting van de replicatievorken induceren. Bovendien kan de rol van de recombinatie eiwitten en helicases die betrokken zijn bij deze processen worden onderzocht met behulp van genetische knockouts in dit systeem.

Introduction

Tijdens DNA-replicatie, de replisome geconfronteerd obstakels op het DNA die de progressie beïnvloeden. DNA-schade met inbegrip van letsels en hiaten evenals afwijkende structuren kunnen voorkomen dat de replisome voortzetting ^1. Recentelijk is gevonden dat eiwitten gebonden aan het DNA zijn de meest voorkomende bron van belemmering vork progressie ² replicatie. De kennis van de gebeurtenissen na de ontmoeting van de replisome met een nucleoproteïne blok eerder beperkt door het onvermogen om zo'n blok in het chromosoom van een levende cel te induceren op een bekende locatie. In vitro onderzoek heeft ons begrip van de kinetisch gedra....

Protocol

1. Het blokkeren van replicatie met FROS

1. Induceren van de Replication Verstopping
   1. Verdun een frisse 's nachts cultuur van een E. coli stam die een tetO array en pKM1 ¹⁸ OD _{600 nm} = 0,01 in een verdunde complex medium (0,1% trypton, 0,05% gistextract, 0,1% NaCl, 0,17 M KH _{2PO 4,} 0,72 MK ₂ HPO ₄₎ met antibiotica behoefte voor selectie.
      Opmerking: Weet tetracycline niet toe te voegen voor de selectie, omdat het niet compatibel is met dit systeem. Maak het volume van de kweek equivalent aan 10 ml per monster nodig. Bijvoorbeeld, de kweekvolume voor proefopze....

Results

De FROS een induceerbare, plaatsspecifieke nucleoproteïne blok dat replicatie-intermediairen mogelijk maakt worden gevisualiseerd in levende cellen ^12,18. Een algemene experimentele opzet voor het bemonsteren cellen wordt geïllustreerd in figuur 1. De timing van de bemonstering en verschillen in genetische achtergrond maken dit een veelzijdig systeem voor het bestuderen van het herstel van een dergelijk blok. Het schema illustreert hoe temperatuurgevoelige mut.......

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm