Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Natuurlijke evolutie omvat genetische diversiteit zoals veranderingen in de omgeving en een selectie tussen kleine populaties. Adaptieve laboratoriumevolutie (ALE) verwijst naar de experimentele situatie waarin evolutie wordt waargenomen met behulp van levende organismen onder gecontroleerde omstandigheden en stressfactoren; organismen worden daarbij kunstmatig gedwongen om evolutionaire veranderingen door te voeren. Micro-organismen worden in de omgeving blootgesteld aan verschillende stressfactoren en zijn in staat om bepaalde stress-induceerbare eiwitten te reguleren om hun overlevingskansen te vergroten. Natuurlijk voorkomende spontane mutaties brengen veranderingen teweeg in het genoom van een micro-organisme die zijn overlevingskansen beïnvloeden. Langdurige blootstelling aan chemostaatcultuur veroorzaakt een accumulatie van spontane mutaties en maakt de meest aanpasbare stam dominant. Vergeleken met de kolonie-overdracht- en seriële overdrachtmethoden brengt chemostaatcultuur het hoogste aantal celdelingen en dus het hoogste aantal diverse populaties met zich mee. Hoewel chemostaatcultuur voor ALE complexere kweekapparaten vereist, is het minder arbeidsintensief zodra de operatie begint. Vergelijkende genomische en transcriptoomanalyses van de aangepaste stam geven evolutionaire aanwijzingen over hoe de stressfactoren bijdragen aan mutaties die de stress overwinnen. Het doel van het huidige artikel is om versnelde evolutie van micro-organismen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden tot stand te brengen.
Inleiding
Micro-organismen kunnen overleven en zich aan te passen aan verschillende omgevingen. Onder zware stress, kan de aanpassing gebeuren via de overname van heilzame fenotypes door willekeurige genomische mutaties en de daaropvolgende positieve selectie 1-3. Daarom kan microbiële cellen aangepast door het veranderen van metabole of regulerende netwerken voor een optimale groei, die wordt aangeduid als "adaptieve evolutie". Recente belangrijke microbiële tendensen, zoals het uitbreken van superbugs en het optreden van sterke microbiële stammen, zijn nauw verwant aan adaptieve evolutie onder stressvolle omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden gedefiniee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. apparatuur Voorbereiding
- Verkrijgen van een chemostat pot (150-250 ml) of een erlenmeyer (250 ml) die een inlaatpoort en een uitlaatpoort. Sluit de poorten met siliconenslang waardoor stroomsnelheden van 10-100 ml / uur. Optioneel gebruik van een ontluchter, een luchtuitlaat poort, en temperatuurgecontroleerde water inlaat en uitlaat poorten.
- Verkrijgen van een apparaat om de chemostaat pot die voorziet roeren en temperatuurregeling (of een roterende schudincubator).
- Verkrijgen twee peristaltische pompen om vers medium te leveren en het verzamelen van de cultuur.
- Zorg voor een reservoir jar (10-20 L) met een medium u....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor high-succinaat stress-adaptatie, de wild-type E. coli W3110 stam werd gekweekt in een chemostat bij D = 0,1 h-1 gedurende 270 dagen (figuur 2).
Figuur 2: High-succinaat spanning aanpassing van E. coli W3110 gebruik chemostaat cultuur. Dunne pijlen geven de tijdstippen waarop de concentratie stressor werd verhoogd en vetge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Micro-organismen zijn in staat aan te passen aan bijna alle omgevingen vanwege hun snelle groei en de genetische diversiteit. Adaptive laboratorium evolutie stelt micro-organismen om te evolueren onder omstandigheden ontworpen, die een manier van het selecteren van de individuele organismen harboring spontane mutaties die gunstig onder de gegeven omstandigheden biedt.
De chemostaat techniek robuuster te bereiken kunstmatig aangedreven evolutie dan transfertechniek om de volgende redenen: (a).......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd financieel ondersteund door het Koreaanse ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (Intelligent Synthetic Biology Center-programma 2012M3A6A8054887). P. Kim werd ondersteund door een beurs van de Katholieke Universiteit van Korea (2015).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | - | vervaardigd op speciale bestelling |
| siliconen slang | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | slangmaat kan worden gevarieerd afhankelijk van de verdunningssnelheid en de grootte van de fermentorpot. |
| reservoirpot | Bellco | Media opslag fles | 20 L |
| chemicaliën | Sigma-Aldrich | - | reagenskwaliteit |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagens |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | voor moleculaire biologie, geschikt voor celcultuur, ≥99,5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagens, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98,5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagens, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagens, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagens, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagenskwaliteit, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
Referenties
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
