Methodenartikel

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

DOI:

10.3791/54460

⸱

13 september 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Accurate beoordeling van ontstekingsremmende effecten is van het grootste belang voor de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekte. Digitale holografische microscopie biedt beoordeling van ontsteking in muis- en menselijke colonweefselmonsters evenals geautomatiseerde multimodale evaluatie van epitheel wondgenezing in vitro.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De incidentie van inflammatoire darmziekte, dat wil zeggen, de ziekte van Crohn en Colitis ulcerosa, is sterk toegenomen in het afgelopen decennium. De etiologie van IBD onbekend blijft en Huidige therapeutische strategieën gebaseerd op de niet-specifieke onderdrukking van het immuunsysteem. De ontwikkeling van behandelingen die specifiek darmontsteking en epitheliale wondgenezing zou een belangrijke beheer van IBD, maar dit vereist een nauwkeurige detectie van inflammatoire veranderingen. Momenteel worden potentiële kandidaat-geneesmiddelen meestal geëvalueerd met behulp van diermodellen in vivo of met celkweek gebaseerde technieken in vitro. Histologisch onderzoek vereist meestal de cellen of weefsels van belang te worden gemerkt, dat het monster kenmerken kunnen veranderen en bovendien kan de interpretatie van de resultaten verschillen per onderzoeker deskundigheid. Digitale holografische microscopie (DHM), gebaseerd op de detectie van optische weglengte vertraging maaktvlek-free kwantitatieve fase contrast beeldvorming. Hierdoor kan de resultaten direct worden gecorreleerd met absolute biofysische parameters. We zien hoe het meten van veranderingen in weefseldichtheid met DHM, op ​​basis van brekingsindex meting kan inflammatoire veranderingen kwantificeren zonder kleuring in verschillende lagen van dikke weefselmonsters van muizen en mensen met colitis. Daarnaast tonen we continue multimodaal label-free monitoring van epitheliale wondheling in vitro, mogelijk met behulp van DHM door het eenvoudige geautomatiseerde bepaling van de gewonde gebied en de gelijktijdige bepaling van de morfologische parameters zoals droge massa en laagdikte van migrerende cellen. Concluderend DHM een waardevolle, nieuwe en kwantitatieve hulpmiddel voor de beoordeling van darmontsteking met absolute waarden van parameters mogelijk vereenvoudigd kwantificering van epitheliale wondgenezing in vitro en daarom aanzienlijk kunnen bijdragen translationele diagnostische use.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatoire darmziekte (IBD), dat wil zeggen, colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn idiopathische inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal 1. Onderzoek naar de onderliggende pathofysiologie van IBD en de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen of nieuwe diagnostische benaderingen is bijzonder belangrijk. In zowel fundamenteel onderzoek en de klinische behandeling van IBD patiënten, heeft het darmslijmvlies een aandachtspunt 2,3 geworden. De mucosa vertegenwoordigt een anatomische grens, waarbij de interactie tussen commensale bacteriën, epitheelcellen en diverse cellulaire componenten van het immuunsysteem intestinale homeostase 4,5 orkestreren darm. Echter, in IBD patiënten, ongecontroleerde en hardnekkige darmontsteking leidt tot schade, detecteerbaar als zweren of stenose, die uiteindelijk kan leiden tot afbraak van epitheliale barrièrefunctie, die zelf verergert lokale ontsteking 6 mucosale.

epitheliale wondheling is daarom cruciaal voor epitheliale regeneratie na de ontsteking, maar is ook een basisvereiste voor de genezing van gastro-intestinale ulcera of naadlekkage na gastro-intestinale chirurgie 7. Epitheliale wondgenezing kan worden gesimuleerd in in vitro assays en wondgenezing in muismodellen van darmontsteking 8,9. Zowel in vitro als in vivo benaderingen hebben nadelen, die de nauwkeurigheid van de experimentele evaluatie beperken. In vitro assays, zoals klassieke scratch testen vereisen langdurige kleuring procedures of transfectie met fluorescerende chromoforen. Ze worden vaak beperkt door hun discontinue controle van celproliferatie en migratie die niet kan worden geautomatiseerd 10. In vivo modellen, zoals dextran natrium sulfaat (DSS) geïnduceerde colitis, vaak niet robuust uitlezen, mede door de grote variatie gezien in het laboratorium markers, making dergelijke markers ongeschikt colitis ernst 11,12 evalueren. Histologische analyse van het ontstoken slijmvlies is nog steeds de meest valide benadering colitis ernst bepalen, maar dit, zoals in vitro epitheliale wondgenezing assays vereist kleuring en is afhankelijk onderzoeker kennis 13.

Onlangs digitale holografische microscopie (DHM), een variant van kwantitatieve fase microscopie 14, werd geïdentificeerd als nuttig hulpmiddel voor de beoordeling van epitheliale wondgenezing in vitro en in vivo 15. DHM kan een oordeel weefseldichtheid door het meten van optische weglengte vertraging (OPD) , die de vooruitzichten roman kankerdiagnose 16-18 en kwantificering van ontsteking gerelateerde weefsel veranderingen 19. Daarnaast DHM zorgt voor de opvolging van de morfologie van de cel dynamiek door het bepalen cel dikte, mobiele overdekte oppervlakte en intracellulaire (eiwit) gehalte hoeveelheid 15,20. In in vitro testen, DHM maakt ook de analyse van fysiologische processen, bijvoorbeeld cellulaire waterpermeabiliteit door het evalueren van veranderingen in celvolume en dikte 21,22. Bovendien kunnen DHM metingen worden geautomatiseerd die-onderzoeker verbonden steekproef vertekening voorkomt.

Hier tonen we het gebruik van DHM in een muizenmodel van darmontsteking en ook DHM gelden voor analyse van menselijke weefsels monsters voor kwantitatieve controle van wondgenezing als label-free in vitro assay. Ten eerste, we evalueren inflammatoire veranderingen van verschillende colon muur-lagen in colitic muizen en secties weefsel van mensen met IBD. Na een beschrijving van de DHM kwantitatieve fase imaging procedure, bieden we gedetailleerde instructies voor het gebruik van de microscoop componenten, de voorbereiding van het weefsel secties en beschrijven ook de evaluatie van de verworven kwantitatieve fase beelden.

Vervolgens laten we zien dat DHM uti kan wordenseerd voor continue multimodale monitoring van epitheliale wondheling in vitro, en beschrijven de analyse van cellulaire kenmerken zoals mobiele laagdikte drooggewicht en cellulaire volume geven inzicht in geïnduceerde drug en fysiologische cel veranderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de regionale toetsingscommissie (het Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Duitsland) volgens de Duitse Animal Protection Law. De lokale ethische commissie van de Universiteit van Münster keurde het gebruik van menselijke weefsels voor histologische en microscoop analyse.

1. Dieren en Materialen

  1. Gebruik vrouwelijke of mannelijke muizen van de vereiste DSS-gevoelige stam die wegen 20 tot 25 g, en het huis volgens de plaatselijke verzorging van dieren wetgeving. Zorg voor speciale chow voor knaagdieren en geautoclaveerd drinkwater ad libitum.
  2. Induceren acute DSS colitis door toedienen 3% w / v dextran sulfaat natrium (DSS, molecuulgewicht: 36,000-50,000 Da) in geautoclaveerd kraanwater gedurende 5 dagen.
    LET OP: De potentie van DSS is zeer variabel, afhankelijk van de fabrikant en batch. Test uw-leverancier verstrekt DSS eerste voor de inductie van de ziekte-activiteit, waarvoor daily lichaamsgewicht is een betrouwbare en objectieve indicator.
  3. Voor histologische evaluatie van colon weefselmonsters, euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie (of welke door nationale en institutionele richtlijnen) aan het einde van het experiment.

2. experimentele opstelling voor DSS-colitis en In-vitro Wound Healing Testen

  1. Celcultuur en oprichting van wondgenezing assay.
    1. Kweek Caco-2-cellen in een vochtige 95% en 5% CO2 omgeving bij 37 ° C. Gebruik RPMI medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
    2. Zaad Caco-2-cellen bij een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / cm2 op 35 mm petrischalen met hoge cultuur-inzetstuk (zie figuur 4A).
      LET OP: Het insert genereert twee cel bedekt gebieden die met een bepaalde cel vrije ruimte die de gewonde gebied te analyseren zijn gescheiden.
    3. Verander medium twee dagen na seeding. Uitvoeren door eerst resterende medium met celafval afzuigen met behulp van een automatische pipet, spoelen met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vervangen door vers RPMI medium of medium-serum beroofd.
    4. Kweekcellen voor 24 uur in serum onthouden medium (0,1% FBS) aangevuld met 20 ng EGF / ml serum of 2 ug mitomycine c / ml serum wordt aangetast wondgenezing activiteiten op te sporen. Voeg normaal RPMI medium met controle cellen gedurende 24 uur.
    5. Na 24 uur van de cultuur, te verwijderen en gooi cultuur inserts zoals beschreven in stap 3.4 en het uitvoeren van DHM.
  2. Inductie van acute DSS colitis
    1. Los 3 g DSS in 100 ml geautoclaveerd water om 3% te krijgen (w / v) oplossing DSS. Zorg voor deze oplossing in plaats van drinkwater aan muizen ad libitum gedurende 7 dagen. Bereken 5 ml van DSS-oplossing per muis / dag. Zorg voor geautoclaveerd water zonder DSS voor controle muizen ad libitum.
  3. Bereiding van cryostatic delen van muis en humane colon
    1. Euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie aan het einde van het experiment.
    2. Ontleden de buik van de dieren door laparotomie 23. Verwijder de gehele dikke darm voorzichtig met een pincet en snijd de ileale en rectale end met behulp van chirurgische schaar. Snijd de dikke darm met een schaar lengterichting van de blindedarm naar de rectale uiteinde en open de colon. Verwijderen uitwerpselen uit het monster met een pincet, gevolgd door wassen met PBS 24.
    3. Bereid Zwitserse rollen door het oprollen van de gehele dikke darm met een katoenen lengterichting knop van de blindedarm naar de rectale einde met het slijmvlies naar binnen gebogen. Insluiten colon monsters optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en blijven ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik.
    4. Insluiten menselijke colon weefsel van chirurgische specimen optimale snijtemperatuur oktober verbinding blijven en ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik.
    5. Cut secties van 7 urn dikte van de oktober-verbinding ingebedde monsters met de hulp van een cryotome enkel voorafgaand aan het onderzoek.
      NB: De optimale dikte van de monsters is afhankelijk van de persistentie en de verstrooiing eigenschappen van het type weefsel dat onderzocht. Voor de beschreven experimenten met colonweefsel, plakdikte> 10 urn veroorzaken aanzienlijke toename van ruis door lichtverstrooiing kwantitatief DHM fasecontrastbeelden, terwijl monsters met een dikte <5 urn hebben een hogere kans op beschadiging geïnduceerde artefacten uit het cryo snijproces.
    6. Transfer secties op een glazen carrier object dia.

3. Technische apparatuur, software en procedures voor acquisitie en evaluatie van Digital Hologrammen

  1. Digitale holografische microscoop voor kwantitatieve cellen en weefsel imaging
    1. Gebruik een off-as Mach-Zehnder digitale holografische microscopie voor live cell imaging 25, zie figuur 1. Controleer of de microscoop is uitgerust met een10X microscoop lens, een microscoop podium met een houder voor glazen objectdrager objectglaasjes en petrischalen met een diameter van 35 mm, een droogstoof fysiologische temperatuur op 37 ° C en software voor kwantitatieve fase beeldvorming 25 behouden.
      Opmerking: Zoals bijvoorbeeld beschreven in Kemper et al 26 en Langehanenberg et al 27...
      OPMERKING: Of gebruik een soortgelijk systeem dat kan uitvoeren helderveld microscopie en kwantitatieve fase beeldvorming van levende cellen en weefsels dia ontleed is.
    2. Schoon microscooplens en koeler met lensreinigingspapier en een reinigingsmiddel (bijvoorbeeld ethanol) zoals aanbevolen door de fabrikant van de microscoop stof of andere verontreinigingen te verwijderen.
    3. Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop, selecteer "bright field" imaging-modus en switch "op" wit licht verlichting. Zorgen voor Köhler-verlichtinatie van het monster zoals aanbevolen door de fabrikant microscoop met inachtneming van het monster in de live-imaging venster van het beeld acquisitie software (als alternatief een standaard afbeelding acquisitie software kan worden gebruikt in deze stap).
      OPMERKING: De beeldintensiteit moet homogeen verdeeld in het gezichtsveld en de monsterpositie mag niet bewegen bij optische heroriëntatie met de focus aandrijving van de microscoop.
    4. Selecteer "DHM" imaging-modus, zet "off" wit licht verlichting en schakelaar "aan" het laserlicht. Controleer of de belichting met laserlicht homogeen is (dat wil zeggen, dat de lichtintensiteit homogeen verdeeld in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software van de DHM microscoop) en constateren dat de off-as carrier interferentierand patroon lijkt met voldoende contrast in de vastgelegde beelden (digitale hologrammen).
  2. Bereiding van cryostaat secties voor beeldvormingmet DHM
    1. Neem het monster (cryostaatsectie op een glazen objectdrager en een dikte van 7 urn, zoals beschreven in 2.3) uit de vriezer. Ontdooi het monster gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.
    2. Voeg 50-100 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de inbedding op de weefselsectie met een pipet totdat deze volledig bedekt met buffer. Bedek het monster met een schone glazen afdekplaat slip (glasdikte 170 pm).
      OPMERKING: Over-drogen kan sterk veranderen de brekingsindex en verstrooiing eigenschappen van het monster te induceren.
    3. Controleer of de bodem van de glazen drager en het dekglaasje worden gereinigd van stof en andere verontreinigingen die lichtverstrooiing kan veroorzaken. Het monster is klaar voor onderzoek met heldere veld microscopie en DHM.
  3. Kwantitatieve fase beeldvorming van weefsel secties met DHM
    1. Schakel de digitale holografische microscoop, kies de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start de image acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer heldere bestand imaging-modus.
    2. Plaats het weefsel dia zoals beschreven in 2) in de microscoop diahouder, met het deksel slip tegenover de microscoop doelstelling.
    3. Switch "op" de heldere veld verlichting van de DHM microscoop. Plaats het monster met de microscoop podium en ervoor te zorgen dat het weefsel gebied van belang is zichtbaar in het live bewaking venster. Het verbeteren van de scherpte van het beeld met behulp van de microscoop focus rijden.
      OPMERKING: Naast het interessegebied, dient een gebied van dia zonder weefsel ook in het gezichtsveld worden.
    4. Leg een heldere veld afbeelding van de scherp monster met behulp van het beeld acquisitie software.
    5. Selecteer "DHM" imaging-modus, zet "off" het witte licht verlichting en "aan" het laserlicht verlichting. Selecteer de "exposure time" voor hologram opname onder de 3 msec, constateren dat holographic off-axis interferentie franjes verschijnen met voldoende contrast in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software en het veroveren van een digitaal hologram.
    6. Herhaal stap 3.3.3 - 3.3.5 totdat er een voldoende aantal heldere veld beelden en digitale hologrammen van verschillende sample gebieden zijn opgenomen. Hologram overname is nu voltooid.
  4. Bereiding van wondheling assays voor DHM beeldvorming
    1. Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voor aanvang van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM.
    2. Bereid werkbank met de gewenste uitrusting (petrischaal voor wondgenezing assay wordt beschreven in 2.3): pipetten, pincet, glazen deksel petrischaal, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde celkweekmedium met fysiologische temperatuur (37 ° C) gedurende voorbehandeling steriele omgeving.
      LET OP: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bestaat uit 10% foetaal kalf serum (FCS), 20 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) en 850 mg / l NaHCO3.
    3. Verwijder het plastic deksel van de petrischaal en verwijder het celkweekmedium met een pipet. Verwijder het inzetstuk uit de petrischaal bodem met een pincet.
    4. Was het monster 1-2 maal met 1 ml HEPES gebufferd celkweekmedium om dode cellen en de resterende cellulaire componenten (bijvoorbeeld serum) in de wond gebied te verwijderen. Voeg 2 ml HEPES gebufferd celkweekmedium en dop de petrischaal met de glazen deksel.
    5. Controleer of de glazen deksel en de bodem petrischaal werden ontdaan van stof en andere verontreinigingen. Monster is klaar voor time lapse observatie met DHM.
  5. Continue multimodale controle van de wondgenezing in vitro met DHM
    1. Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voorafgaandde start van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM.
    2. Switch "op" de digitale holografische microscoop, selecteer de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer "helder gebied" imaging-modus. Controleer of de verwarmingskamer voor de petrischaal werkt een fysiologische temperatuur (37 ° C).
    3. Plaats de petrischaal met wondgenezing assay, bereid zoals in 4) in de verwarmingskamer van de DHM microscoop.
    4. Selecteer helderveld imaging-modus en de positie van het monster met de microscoop podium, terwijl het waarnemen in de live bewaking raam van het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Merk op dat het gewenste gebied van het monster scherp scherp is onder wit licht verlichting.
    5. Leg heldere veld beelden van verschillende delen van het monster (wond en de omliggende gebieden met samenvloeiende cellen) onder witlicht verlichting met het beeld acquisitie software en documenten uiterlijk, celdichtheid en homogeniteit.
    6. Selecteer "bright field" imaging-modus van de DHM microscoop. Kies een geschikte wond gebied onder wit licht verlichting in de live bewaking venster met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Zorg ervoor dat de wond gebied is vrij van dode cellen en geen serum overblijfselen, en ervoor te zorgen dat beide zijden zijn voorzien van een enkele homogene cellaag, bij voorkeur met rechte randen.
    7. Het veroveren van een wit licht beeld van de oorspronkelijke wond gebied in heldere field imaging-modus met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop.
    8. Turn "off" wit licht verlichting, selecteer "DHM" mode en switch "op" laser verlichting. Selecteer een belichtingstijd van 3 hieronder msec hologramopname (constateren dat holografische as af interferentiebanden verschijnen voldoende contrast in het levende beeldvorming raam van de beeldacquisitie software tHij DHM microscoop) en het veroveren van een digitaal hologram.
    9. Leg een monster hologram in DHM-modus met het beeld acquisitie software en reconstrueren van een beeld kwantitatieve fase met de reconstructie software van de DHM microscoop om de beeldkwaliteit te controleren.
    10. Kies een geschikte tijdvertraging (bv 3-5 min) voor time-lapse hologram overname met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop.
    11. Selecteer de time-lapse overname modus van de afbeelding acquisitie software waarin het monster alleen met laserlicht wordt verlicht tijdens het hologram acquisitie.
    12. Start de time-lapse DHM observatie van de wondgenezing assay.
    13. Stop de time-lapse acquisitie na de beoogde tijd in, selecteer helderveld imaging-modus en documenteren van de uiteindelijke verschijning van het monster onder wit licht imaging.
  6. Reconstrueren digitale hologrammen van ontleed weefsel en bepaal de gemiddelde brekingsindex als parameter te kwantificerenweefsel dichtheid
    1. Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van digitale hologrammen van ontleed weefsel met de software van de DHM microscoop, bijvoorbeeld zoals beschreven in Kemper et al. 26 en Langehanenberg et al. 27.
    2. Bepaal de gemiddelde fase contrast Δφ in verschillende weefsel lagen (epitheel, submucosa, stroma) in geschikt gekozen regio's van belang (ROI) 19.
    3. Bepaal de brekingsindex van het inbeddingmedium door een refractometer of als alternatief met behulp van een juiste waarde in de literatuur. (brekingsindex waarden voor typische inbedding media: n water = 1,334 28, n fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) = 1,337 29, n celkweekmedium = 1,337-1,339 29,30).
    4. Bereken de brekingsindex van verschillende weefsel lagen van de gemiddelde fase contrast waarden 19
      figure-protocol-1 (1)
      NB: In Eq. 1 λ de golflengte van het laserlicht (hier: λ = 532 nm), d de dikte van de ontleed weefsel (hier: 7 urn) en n medium is de brekingsindex van het inbeddingsmedium (hier: n medium = n PBS = 1,337, bepaald door een Abbe-refractometer).
  7. Reconstrueren en digitale hologrammen evalueren van de time-lapse wondgenezing serie observatie
    1. Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van de time lapse hologram serie verkregen tijdens wondgenezing observatie met de microscoop DHM software 26,27.
    2. Normaliseren elke reeks kwantitatieve fase beelden naar de afbeelding met een maximale fase contrast.
    3. Bepaal het oppervlak Sc dat wordt gedekt door de cellen in de kwantitatieve DHM fasebeelden door beeldsegmentatie Dit kunnen pergevormd met behulp van de gratis software cel profiler (www.cellprofiler.org 31).
    4. Bereken de gemiddelde fasecontrast van de cellen Δφ cel in het gebied Sc.
    5. Haal de cellulaire drooggewicht DM uit de gemiddelde fase contrast Δφ cel in het gebied S c 15
      figure-protocol-2 (2)
      Opmerking: In Vergelijking 2 DM geeft de cellulaire drooggewicht, Sc presenteert het gebied dat wordt ingenomen door de cellen en α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Bepaal de integrale cellulaire brekingsindex n cel en de brekingsindex van het celkweekmedium n medium. Bepaal n cel afzonderlijk experimenteel van gesuspendeerde cellen, zoals beschreven in 30 en meet n medium met een refractometer. Alternatief gebruiken literatuur waarden voor n cel 30 en n gemiddeld 29,30.
    7. Bereken de gemiddelde cel dikte d cel λ, Δφ cel, n cel en n gemiddeld 26,32
      figure-protocol-3 (3)
      NB: In Eq. 3 de parameter d cel de gemiddelde celdikte, λ duidt de licht golflengte van het laserlicht, Δφ cel staat voor de gemiddelde fasecontrast en n cel en n medium zijn de integrale cellulaire brekingsindex en de brekingsindex van het omringende medium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typische Setup voor DHM Imaging voor Digitale Holografische Microscopie (DHM)

Om helderveld imaging en kwantitatief fasecontrast DHM uitvoeren, pasten we een omgekeerde microscoop zoals in figuur 1 B. Het systeem werd gemodificeerd door het aanbrengen van een DHM module, zoals eerder 25 beschreven. Digitale hologrammen werden gegenereerd door belich...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We laten zien dat DHM zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de histologische schade in muizen colitis modellen en colon weefselmonsters menselijk ex vivo. Verder hebben we aangetoond DHM kan continu monitoren epitheliale wondgenezing en tegelijkertijd multimodale informatie over cellulaire veranderingen. In DHM, is de reconstructie van digitaal vastgelegde hologrammen numeriek 32 uitgevoerd. Daarom is in vergelijking met helderveld microscopie, Zernike fase contrast en differentieel interferentie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Faekah Gohar voor het correct lezen van het manuscript. We danken Sonja Dufentester en Elke Weber voor deskundige technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317(2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976(2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017(2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210(2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009(2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912(2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Meting van de brekingsindexanalyse van weefseldichtheidkleurstofvrije beeldvormingmonitoring van celculturencolitis muismodelCaco 2 cellen

Gerelateerde artikelen