Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

IJzer-Chloride geïnduceerde Murine Trombose Models

22.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54479

⸱

5 september 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

Wij rapporteren een verfijnde procedure van de ijzerchloride (FeCl3) geïnduceerde trombose modellen op de halsslagader en mesenterica evenals ader, efficiënt gekarakteriseerd met behulp van intravitale microscopie tot tijd om trombi vorming occlusief bewaken.

Samenvatting

Arteriële trombose (bloedstolsel) is een veelvoorkomende complicatie van veel systemische ziekten die gepaard gaan met chronische ontsteking, waaronder atherosclerose, diabetes, obesitas, kanker en chronische auto-immuun reumatische aandoeningen. Trombi zijn de oorzaak van de meeste hartaanvallen, beroertes en ledemaatverlies, waardoor trombose een uiterst belangrijk volksgezondheidsprobleem is. Aangezien deze trombi voortkomen uit ongepaste activering van bloedplaatjes en daaropvolgende stolling, heeft het therapeutisch richten op deze systemen een belangrijke klinische betekenis voor het ontwikkelen van veiligere behandelingen. Vanwege de complexiteit van het hemostatische systeem, kunnen in vitro experimenten de interacties tussen bloed en vaatwand niet volledig nabootsen; daarom zijn in vivo studies cruciaal om de pathologische mechanismen van trombusvorming te begrijpen. Hiertoe zijn verschillende trombosemodellen ontwikkeld bij muizen. Onder hen is ijzerchloride (FeCl3) geïnduceerde vasculaire verwonding een veel gebruikt model van occlusieve trombose dat bloedplaatjesactivering en aggregatie rapporteert in de context van een aseptisch gesloten vaatsysteem. Dit model is gebaseerd op redox-geïnduceerde endotheelcelbeschadiging, die eenvoudig en gevoelig is voor zowel anticoagulantia als anti-bloedplaatjes geneesmiddelen. De tijd die nodig is voor de ontwikkeling van een trombus die de bloedstroom blokkeert, geeft een kwantitatief meetbaar niveau van vasculaire verwonding, bloedplaatjesactivering en aggregatie die relevant is voor trombotische ziekten. We hebben dit FeCl3-geïnduceerde vasculaire trombosemodel aanzienlijk verfijnd, waardoor de gegevens zeer reproduceerbaar zijn met minimale variatie. Hier beschrijven we het model en presenteren we representatieve gegevens uit verschillende experimentele opstellingen die de bruikbaarheid van dit model in tromboseonderzoek aantonen.

Inleiding

Arteriële trombose (bloedstolsel) is een veel voorkomende complicatie van vele systemische ziekten verbonden met chronische ontsteking, waaronder atherosclerose, diabetes, obesitas, kanker en chronische auto reumatologische aandoeningen. Trombi die zich in de arteriële circulatie voort uit ongepaste activatie van bloedplaatjes, aggregatie en coagulatie volgende mechanismen, en zijn betrokken in hartaanvallen, beroertes en extremiteiten verlies. De vaatwand is een complex dat meerdere celtypen omvat en wordt beïnvloed door een groot aantal extrinsieke factoren afschuifspanning circulerende bloedcellen, hormonen en cytokinen, alsook expressie van antioxidant eiwitten in de vaatwand. In vitro experimenten kunnen niet repliceren deze complexe omgeving en daarom in vivo studies met diermodellen zijn essentieel voor een beter begrip van de mechanismen betrokken bij trombotische aandoeningen toe.

Muizen is aangetoond sim hebbenilar mechanismen mens in termen van trombose, atherosclerose, ontsteking en diabetes 1,2. Bovendien kunnen transgene en knockout muizen worden gecreëerd om de functie van specifieke genproducten te testen in een complexe fysiologische of pathologische omgeving. Dergelijke studies na te bootsen menselijke pathologie en kunnen belangrijke mechanistische informatie met betrekking tot de ontdekking van nieuwe wegen en therapieën, om te voorzien in en verstrekt belangrijke details in het karakteriseren van drugs effecten op trombose.

Pathologische arteriële trombi optreden als gevolg van laag verwonding of disfunctie en de blootstelling van de bloedstroom naar de endotheliale subendotheliale matrix 3,4. Verschillende trombose modellen zijn ontwikkeld om deze endotheliale beschadiging induceren zoals mechanische schade fotoreactieve verbinding Bengaals gebaseerde oxidatieve schade en verwonding laser 5. In dit spectrum ferrichloride (FeCl3) geïnduceerde vasculaire schade is een veel gebruikt model van trombose. Dit reagens wanneeraangebracht op het buitenste aspect van vaartuigen induceert oxidatieve beschadiging van vasculaire cellen 6-8, met verlies van endotheliale cel bescherming van circulerende bloedplaatjes en componenten van de coagulatie cascade. Het FeCl3 model is eenvoudig en gevoelig voor zowel anticoagulerende en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen, en is uitgevoerd op carotis en femoralis, halsaders en mesenterische en cremasteric arteriolen en venulen bij muizen, ratten, cavia's en konijnen 6-15.

Een meetbare parameters in dit model is de verstreken tijd van de schade naar vat occlusie, gemeten als de bloedstroom stoppen met een Doppler stroommeter of onder directe observatie met intravitale microscopie 6,7,9 voltooien. Een reeks van tijden tussen 5 en 30 min werd gerapporteerd in verschillende studies bij muizen C57Bl6 7-10,16 suggereert dat FeCl3 concentraties vormen van anesthesie, chirurgische technieken, muis leeftijd, genomische achtergrond, meetmethode bLood stroming, en andere omgevingsvariabelen grote invloed in dit model. Deze grote variabiliteit bemoeilijkt studies vergelijken van verschillende onderzoeksgroepen en kan de detectie van kleine verschillen bemoeilijken.

Met een visie om deze variabiliteit te minimaliseren en om een uniform reproduceerbaar in vivo modelsysteem, hebben we de FeCl3-geïnduceerde halsslagader model dat de gegevens zeer reproduceerbare met minimale variatie 6-10,16-19 maakt verfijnd. In dit artikel beschrijven we en delen van de vaardigheden en het verslag een aantal representatieve experimentele voorbeelden die kunnen profiteren van dit model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures en manipulaties van de dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) van The Cleveland Clinic in overeenstemming met de Verenigde Staten Public Health Service Beleid inzake de Humane zorg en het gebruik van dieren, en de NIH Gids voor de Zorg en Het gebruik van proefdieren.

1. Voorbereiding:

  1. Fluorescerende kleurstof voor Labeling Bloedplaatjes
    1. Bereid rhodamine 6G oplossing, 0,5 mg / ml in zoutoplossing en steriliseren van de oplossing met 0,22 urn filter.
  2. FeCl3 oplossing
    1. Maak een verse voorraad oplossing van 30% FeCl3 (watervrij, gelijk aan 1,85 M) in zuiver water, en filter met 0,45 urn filter. Bereid 5 ml vers FeCl3-oplossing in de gewenste concentratie [bijvoorbeeld 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) en 12,5% (0,771 M)] van verdunnen van de 30% FeCl3 oplossing met water ina 6 cm weefselkweek schotel en houd het deksel gesloten.
      LET OP: Het gebruik van de cultuur schotel maakt het makkelijker op te pikken het filterpapier verzadigd met FeCl3 oplossing dan om het te halen uit een smalle container, zoals een 1,5 ml microcentrifugebuis. FeCl3 is zeer gevaarlijk is en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas enz., Persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden genomen.
  3. filter Papers
    1. Snijd het filterpapier 1 mm x 2 mm groot. Geniet genoeg stukken van de cut filter papier in de FeCl3-oplossing in dezelfde schotel.
  4. Papaverinehydrochloride Solution
    1. Bereid papaverinehydrochloride oplossing (25 mg / ml) in water en steriliseren van de oplossing met 0,22 urn filter.
  5. agarose Gel
    1. Bereid 2% agarosegel in PBS of zoutoplossing in 6-well weefselkweekplaat, ~ 1 cm dikte, en cut het naar halve cirkel met ~ 3 cm diameter.

2. FeCl3 Induced arteria carotis Injury Trombose Model

  1. Chirurgische ingrepen voor de Trombose Model
    1. Gebruik 8-12 weken oude muizen C57Bl6 (of andere stammen zoals nodig). Verdoven muizen met het mengsel van ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) via intraperitoneale injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen.
      Opmerking: Deze hoeveelheid ketamine / xylazine voldoende is om het dier stabiele anesthesie en geen pijn (respons tot teen knijpen) gedurende ten minste 1 uur te houden.
    2. Verwijder vacht op de hals en borst met een klein dier elektrische clipper. Ontharingscrème is niet noodzakelijk. Solliciteer neutrale aardolie oogzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
    3. Zet de muis in rugligging op het deksel van 15 cm weefselkweek plaat. Gebruik een lange tape (~ 10 cm) tot hin beveiligend ledematen en onderlichaam en twee stukken van kleine band (2 cm x 0,5 cm) aan de voorpoten te beveiligen. Gebruik een 4-0 hechtdraad te wikkelen rond de snijtanden, tape de twee uiteinden van de hechtdraad om het deksel muis rechte hals (figuur 2) te houden.
    4. Plaats de plaat met de muis hoofd in de richting van de bestuurder onder een chirurgische lichtbron.
    5. Steriliseer de chirurgische site met alcohol pad. Gebruik de Micro-Adson tang om de huid vast te houden en gebruik maken van een chirurgische schaar om een ​​kleine incisie te maken (2-3 mm).
    6. Houd de huid van de incisie met de tang en steek chirurgische schaar met kaken in de incisie gesloten. Duw de schaar subcutaan in de richting van de manubrium of kin, en open vervolgens de schaar om de huid uit de subcutane laag te bevrijden.
    7. Snijd de huid met de chirurgische schaar een middellijn incisie van het manubrium op de omvang van tongbeen (figuur 3A en 3B). Botweg ontleden de dunne fascia (stippellijn, in Figuur 3B) tussen de onderkaak klieren met een fijne hemostaat en een Graefe pincet (Figuur 3B en 3C, blauwe pijlen).
      OPMERKING: De manubrium (zwarte pijl in figuur 3C) en de luchtpijp (T in figuur 3C) worden gezien na deze stap.
    8. Houd het zachte weefsel en de huid te zien aan de rechterkant van de manubrium met de Graefe tang, plaatst u de hemostaat onder het dashboard naar de 02:00 positie (gele stippellijn in figuur 3C), open de kaken van de hemostaat om het vrije halsader uit de omliggende weefsel.
    9. Snijd de fascia, zachte weefsel en de huid naar de 02:00 positie (figuur 3C) met de chirurgische schaar om de juiste halsader (Figuur 3D, pijl) bloot te leggen.
    10. Trekken over 200-300 ul rhodamine 6G-oplossing met behulp van een 1 ml spuit met een 22 G naald, en dan veranderenhet aan 30 G naald.
      LET OP: Dit beschermt de 30 G naald tegen beschadiging van zijn fijne punt. de rhodamine 6G oplossing met de 30 G-naald zal het puntje geen schade direct tekenen; Maar het aanraken van de containerwand per ongeluk schade, die injectie kan bemoeilijken veroorzaken.
    11. Spoel de 30 G-naald door langzaam duwen de rhodamine 6G oplossing, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de injectiespuit of de naald blijven. Houd 100 gl rhodamine 6G oplossing voor injectie.
    12. Bend 2-3 mm uiteinde van de naald een 90 ° hoek met de naaldhouder, welke voorkomt de naald te diep om de halsader en maakt de injectie gemakkelijker gecontroleerd (Figuur 3D).
    13. Injecteer de rhodamine 6G oplossing in de rechter halsader labelen bloedplaatjes. Om de spuit te stabiliseren en te houden van de naald op zijn plaats, houd de spuit met de ene hand en de naald met de Graefe pincet met een andere hand tijdens de injection.After injectie, klem de injectieplaats met de Graefe pincet om het bloeden te voorkomen.
    14. Open de kaken van de hemostaat en plaats deze onder de Graefe tang om de vaatwand van de injectieplaats klem, en dan ligeren de injectieplaats met een 6-0 hechtdraad.
      LET OP: Als een alternatief van stap 2.1.15, uitoefenen van druk op de injectieplaats met een vinger gedurende 2 minuten zal het bloeden te stoppen; Deze werkwijze heeft het gevaar bestaat dat verdere bloeding of het stolsel op de injectieplaats ongeluk wordt verwijderd.
    15. Botweg ontleden het zachte weefsel en fascia rond de linker onderkaak klier met de hemostaat en de Graefe pincet en trek de klier in de richting van de 07:00 positie (figuur 3E) naar links sternocleidomastoideus (blauwe pijl in figuur 3E) bloot te leggen.
    16. Botweg ontleden de fascia (figuur 3E, gestippelde lijn) tussen de linker sternocleidomastoideus en de musculus omohyoideus of sternohyoid spier (figuur 3E, groene pijl) gelegen aan de linkerkant van de luchtpijp met de hemostaat.
    17. Passeren een naald met 6-0 zijden hechtdraad (ongeveer 15 cm lang) onder het midden van de sternocleidomastoideus (blauwe pijl in figuur 3E), zet de twee uiteinden van de hechtdraad en trek de hechtdraad zijdelings naar de 10:00 positie .
      Opmerking: Deze procedure moet zorgvuldig worden uitgevoerd om schade van de linker jugulaire ader, die zich buiten het sternocleidomastoideus voorkomen.
    18. Botweg scheiden de dunne sternohyoid spier- en / of musculus omohyoideus aan de halsslagader (CA) (Figuur 3F pijl) bloot te leggen na het wegrijden de sternocleidomastoideus spier. Snijd de sternohyoid spier- en / of musculus omohyoideus nodig. Gebruik de hemostaat om het zachte weefsel van CA te scheiden zonder dat het aanraken van de CA.
      OPMERKING: CA gaat gepaard met de nervus vagus, de witte structuur waargenomen bij Figuur 3G (groene pijl), en in de meeste gevallen onder de dunne sternohyoid spier- en / of musculus omohyoideus (tussen de gele stippellijnen in figuur 3F).
    19. Gebruik een fijne punt tang op te halen de laterale fascia rond de CA terwijl het vermijden van de nervus vagus en CA. Gebruik een andere fijne punt tang om een ​​gat te slaan op de fascia tussen de CA en de nervus vagus.
    20. Steek de haak door het gat en til de CA, en plaats dan de fijne punt tang onder de CA. Beweeg de haak en tang in tegengestelde richtingen langs de CA om adventitia zacht weefsel te strippen. Gratis minstens ~ 5 mm lengte van CA (figuur 3H, blauwe pijl) uit de omliggende weefsel.
    21. Om achtergrond fluorescentie te blokkeren, drukt u op het einde van een zwarte plastic koffieopruier plat, crosscut de koffie roerder in een 3 mm stuk, en dan in lengterichting te snijden langs de vouw randen om twee stukken van "U" -vorm kunststof (figuur 3H, groen krijgen pijl).
    22. Spoel een stuk van deze "U" vorm van plastic met een zoutoplossing en houd het met een pincet en plaats het in het kader van de CA, terwijl voorzichtig de CA met de haak (figuur 3H, groene pijl) te tillen. Onmiddellijk van toepassing zijn 2-3 druppels van een zoutoplossing om te voorkomen dat het drogen van de CA.
  2. Real time opname Video
    1. Overdracht van de muis en de plaat deksel samen om de microscoop podium en plaats in een geschikte positie onder de 10X water lens. Vult de ruimte tussen de 10X lens en de CA met een zoutoplossing.
    2. Start de digitale video-opname software-applicatie, en een nieuw bestand te starten en noem maar op dienovereenkomstig. Neem normale schip afbeeldingen en noteer het framenummer bij de video-opname is gestopt.
      LET OP: verwijzen naar de video-opname-software op de computer voor het opnemen. We maken gebruik van digitale video-opname-software en de volgende beschrijvingen zijn gebaseerd op deze aanvrage.
      LET OP: Aangezien mechanische trauma kan het endotheel beschadigen en leiden tot trombusvorming 20, is het noodzakelijk te bevestigen dat er geen chirurgische letsel aan de vaatwand vóór de FeCl3 schade. Het is ook noodzakelijk om te bevestigen dat er geen resterend weefsel rond de CA, die een belemmering kan vormen en verzwakken het effect van FeCl3 geïnduceerde schade. Noteer het framenummer van de records maakt het gemakkelijk om de video's op basis verstreken tijd later te analyseren.
    3. Beweeg de muis met plaat deksel uit de 10X lens. Vouw een hoek van een papieren handdoek om een ​​dunne en fijne punt maken en gebruiken zorgvuldig dep de zoutoplossing rondom de CA (raak CA) en elders in het operatiegebied. Dit is belangrijk om verdunning van de FeCl3-oplossing voorkomen.
    4. Gebruik een fijne punt pincet en pick-up een stuk filterpapier verzadigd met FeCl3-oplossing en plaats deze direct op de CA en houd het op het terrein voor 1 min.
      LET OP: To steun visualisatie van de bloedstroom en oogst nauwkeurige gegevens, Breng het filter nabij het ​​distale einde van het blootgestelde CA (Figuur 3I) en een kort segment van de proximale locatie (groene pijl in figuur 3I) voor het waarnemen van de bloedstroom bij recente fase (zie hieronder).
    5. Het filtreerpapier (dit tijdstip wordt gedefinieerd als de start van "na verwonding") en spoel de CA met zoutoplossing (minimaal 2 ml).
    6. Leg de muis met plaat deksel terug naar de 10X lens; observeren het schip en begint op te nemen videobeelden. Noteer het videoframe nummer aan het einde van de eerste minuut van de opname.
      OPMERKING: Trombusvorming wordt gekenmerkt door accumulatie van de fluorescerende bloedplaatjes, die wordt waargenomen in real time videobeelden op het computerscherm of onder de microscoop. Record videobeelden direct na de invoering van de muis weer onder de microscoop. Houd opname aan het einde van de eerste minuut na het verwijderen van de fIlter papier. Observeer de gehele vaartuig vanaf het distale naar het proximale sites om informatie over de schade te verkrijgen, en dan richten op het interessegebied (meestal is het middelpunt van het verwonde gebied) voor verdere beeldvorming.
    7. Opnemen videobeelden voor 10 seconden om de minuut gedurende de eerste 10 min (bijvoorbeeld 2:55-03:05) en vervolgens 10 sec iedere minuut tot het einde van het experiment. Noteer de framenummers bij elke opname wordt gestopt.
      OPMERKING: De eindpunten van het model zijn: 1) wanneer de bloedstroom heeft opgehouden gedurende> 30 sec; of 2) indien occlusie wordt niet waargenomen bij 30 minuten na beschadiging. In dit geval gebruikt 30 min voor statistische analyse. Set belichtingstijd van de video-opname tot 10 msec in het begin, zodat het eenvoudig zal zijn om de bloedstroom over de trombi observeren. Wanneer de trombi groot worden en de fluorescentie verzadigt sensor van de camera, wordt het moeilijk om de bloedstroom via thrombi identificeren. Om dit probleem op te lossen, verplaats de beeldvorming center het proximale uninjured (figuur 3I, groene pijl) waarbij bloedstroming nog duidelijk kan worden waargenomen. Ook verhogen Expose Tijd tot 15 of 20 msec bij het scherpstellen op het proximale un-verwonde plaats, zodat de bloedstroom duidelijker waarneembaar. Wanneer de bloedstroom ophoudt, talrijke grotere cellen (leukocyten) beginnen te rollen op de vaatwand aan het proximale locatie van de trombus. Flow stopt meestal binnen 2-3 minuten na het verschijnen van de grote cellen. Noteer de Expose Tijd op de opname opgenomen wanneer het wordt veranderd. Het duurt ongeveer 30 minuten uit de narcose tot het einde van het experiment wanneer de normale wildtype C57Bl6 muizen werden gebruikt.
      LET OP LET OP: Gebruik niet het witte geaggregeerde bloedplaatjes stollen als het teken van de bloedstroom staking, die geen nauwkeurige gegevens zal geven en dat wordt beïnvloed door de belichtingstijd. De witte stolsel bedekt het schip lumen betekent niet dat de bloedstroom beëindigd (zie de vertegenwoordiger video 1).
    8. Eind experiment euthanaseren de muizen middels overdosering ketamine / xylazine (200/20 mg / kg), gevolgd door cervicale dislocatie na bevestiging geen ademhaling en hartslag.

3. FeCl3 Induced mesenterica / veneuze trombose Model

  1. Verdoven 8-12 weken oude muizen C57Bl6 zoals vermeld in paragraaf 2.1.1. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de anesthesie.
  2. Injecteer Papaverine oplossing (totaal 0,4 mg / muis) intraperitoneaal gut peristaltiek remmen.
  3. Verwijder vacht op de hals en buik met een dier elektrische clipper. Ontharingscrème is niet noodzakelijk.
  4. Zet de muis in rugligging op het deksel van 15 cm weefselkweek plaat. Gebruik vier stukken van kleine band (2 cm x 0,5 cm) om alle poten te beveiligen. Gebruik een 4 -0 hechting te wikkelen rond de snijtanden, tape de twee uiteinden van de hechtdraad om het deksel aan de hals rechte (figuur 2) te houden.
  5. Volg de procedures 2.1.4 -2.1.15 de halsader bloot voor injectie van rhodamine 6G labelen bloedplaatjes.
  6. Voer een middellijn incisie door de huid van zwaardvormig tot onderbuik met de chirurgische schaar (figuur 4A). Pak de middelste buikvlies (ook wel linea alba, figuur 4A, pijl) met Graefe pincet, dat is duidelijk en heeft geen bloedvaten, til ongeveer 2-3 mm hoog, bevestigen geen darm onder de snijlijn, en snijd het buikvlies geopend longitudinaal met de fijne schaar (figuur 4B).
  7. Re-veilig de muizen naar rechts laterale positie. De gehalveerde cirkel agarosegel dichtbij de buik, en voorzichtig exterioriseren de darmen en verdeel het bovenop de gel met de Graefe pincet (Figuur 4C). Gebruik de tweede takken voor de trombose experiment (Figuur 4C, pijl).
    OPMERKING: Gebruik de hemostaat of Micro-Adson pincet te helpen om de darmen exterioriseren. Vermijd het kwetsen van dedarm en het vat.
  8. Plaats 5-6 druppels zoutoplossing om het vochtgehalte van de darmen en vat te houden. Breng de muis met de plaat deksel samen om de microscoop podium en zet in de juiste positie onder de 10X droge lens.
    LET OP: Gebruik een droge lens omdat de jejunoileal membraan zoutoplossing niet kan houden. Zorg ervoor dat u een zoutoplossing te laten vallen op de blootgestelde weefsels om ze vochtig te houden.
  9. Dep de zoutoplossing rond de mesenterica en ader voor de behandeling.
  10. Gebruik een fijne punt tang op te halen een stuk filterpapier verzadigd met 12,5% FeCl3 oplossing en plaats deze direct op het mesenterica en ader gedurende 1 min (Figuur 4D). Het filtreerpapier (dit tijdstip wordt gedefinieerd als de start van "na verwonding") en spoel gewonden mesenterische slagader en ader met zoutoplossing (minimaal 2 ml).
  11. Leg de muis met plaat deksel weer onder de 10X droge lens; let op de schepen en beginnen te record videobeelden zoals vermeld in 2.2).
    OPMERKING: De eindpunten van dit experiment zijn: 1) wanneer de bloedstroom heeft opgehouden gedurende> 30 sec; of 2) indien occlusie niet in 30 minuten gemeten na verwonding, en in dat geval gebruikt 30 min voor statistische analyse.
  12. Eind experiment euthanaseren de muizen middels overdosering ketamine / xylazine (200/20 mg / kg), gevolgd door cervicale dislocatie na geen ademhaling en hartslag worden bevestigd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Halsslagader Trombose Model
In muizen met C57BL6 achtergrond, raden we u aan 7,5% FeCl3 voor de behandeling van het schip voor 1 min als uitgangspunt. Onder behandeling van 7,5% FeCl3, worden de grenzen van de gewonde gebied en de normale vaatwand gemakkelijk te herkennen onder de microscoop (zie online video 1), wat suggereert dat de endotheliale laag aanzienlijk beschadigd was. De bloedproppen gevormd direct na FeCl3

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De FeCl3-geïnduceerde model is een van de meest gebruikte trombose modellen, die niet alleen waardevolle informatie over genetische modificatie op bloedplaatjesfunctie en trombose 7,8,16,19,31-33 kunnen verschaffen, maar kan ook een waardevol hulpmiddel voor de evaluatie van de therapeutische samenstellingen en strategieën voor de behandeling en preventie van ziekten atherothrombotische 11,17,34-37. Hier hebben we modificaties en verfijningen van het model getoond en toonde aanvullend be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) van de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) en R01 HL098217 (PI: Nieman). De inhoud van deze publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chirurgische Schaar - Tungsten CarbideFine Science Tools 14502-14snijden en vasthouden van huid
Micro-Adson Forceps - Gekarteld/Recht/12 cmFine Science Tools 11018-12snijden en vasthouden van huid
Metzenbaum Fino Schaar - Tungsten Carbide/Gebogen/Blunt-Blunt/14.5 cmFine Science Tools 14519-14  om zacht weefsel te disseceren en te scheiden
Ultra Fijne Hemostat - Glad/Gebogen/12.5 cmFine Science Tools 13021-12om zacht weefsel te disseceren en te scheiden
Graefe Forceps - Gekarteld/Recht/10 cmFine Science Tools 11050-10om zacht weefsel te disseceren en te scheiden
Dumont #5 Fijne Forceps - Biologie Tips/Recht/Inox/11 cmFine Science Tools 11254-20 Isoleer vat van omliggend weefsel
Dumont #5XL Forceps - Standaard Tips/Recht/Inox/15 cmFine Science Tools 11253-10Isoleer vat van omliggend weefsel
Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip DiameterFine Science Tools 10062-12Isoleer vat van omliggend weefsel
Castroviejo Micro NaaldhoudersFine Science Tools 12061-02Naaldhouders
Hechtdraad 4-0Fine Science Tools 18020-40Voor het bevestigen van de snijtanden aan de plaat
Hechtdraad 6-0Fine Science Tools 18020-60Voor alle chirurgie en ligatie
Kalt HechdnaaldenFine Science Tools 12050-03
rhodamine 6G Sigma83697-1GOm bloedplaatjes te labelen
FeCl3 (Watervrij)Sigma12321Om vaatbeschadiging te induceren
Papaverine hydrochlorideSigmaP3510Om darmperistaltiek te remmen.
Medline Sterilisatie Stoomautoclaaf Tapes voor Chirurgische InstrumentenMedline111625Om de muis aan de plaat te bevestigen
Fisherbrand™ Spuitfilters - Steriel 0.22 µmFisher09-720-004Voor sterilisatie van oplossingen geïnjecteerd in muizen
Fisherbrand™ Spuitfilters - Steriel 0.45 µmFisher09-719DOm de FeCl3 oplossing te filteren
Steriele Alcohol Prep PadFisher06-669-62Om de chirurgische locatie te steriliseren
Agarose BioExpressE-3120-500Om gelfase te maken
Leica DMLFS fluorescerende microscoopLeicaIntravitale microscoop
GIBRALTAR Platform en X-Y Stage Systeem met bevestigde verwarmingsplaat.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix versie 3.17.2 softwareNorPixhttps://www.norpix.com/

Referenties

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Trombose door ferricchloridemodel van de halsslagaderintravitale microscopieplaatjesactivatietrombusvormingvasculaire beschadiginganticoagulantiaantiplaatjesmiddelenRhodamine 6G labelingPAR4 antilichaam
IJzer-Chloride geïnduceerde Murine Trombose Models
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.