Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA's Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54486

⸱

5 september 2016

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Samenvatting

Kleine RNA-therapieën die zich richten op stappen na integratie in de HIV-1 replicatiecyclus behoren tot de topkandidaten voor gentherapie en hebben het potentieel om te worden gebruikt als medicijntherapieën voor HIV-1 infectie. Post-integratie-remmers omvatten ribozyms, korte haakjes (sh) RNA's, kleine interfererende (si) RNA's, U1 interferentie (U1i) RNA's en RNA aptamers. Veel hiervan zijn geïdentificeerd met behulp van transiente co-transfectie assays met een HIV-1 expressie plasmide en sommige zijn gevorderd naar klinische proeven. Naast maatregelen voor effectiviteit, zijn kleine RNA's geëvalueerd op hun potentieel om de expressie van menselijke RNA's te beïnvloeden, celgroei en/of differentiatie te veranderen en innate immuunresponsen op te roepen. In de hier beschreven protocollen wordt een reeks transiente transfectie assays beschreven die zijn ontworpen om de effectiviteit en toxiciteit van RNA moleculen die zich richten op stappen na integratie in de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren. We hebben deze assays gebruikt om nieuwe ribozyms te identificeren en het formaat van shRNA's en siRNA's die zich richten op HIV-1 RNA te optimaliseren. De methoden bieden een snelle reeks assays die nuttig zijn voor het screenen van nieuwe anti-HIV-1 RNA's en zouden kunnen worden aangepast om andere post-integratie-remmers van HIV-1 replicatie te screenen.

Inleiding

Een beperking van de huidige HIV-1 behandelingen is dat ze chronisch moeten worden toegediend aan progressie van de ziekte te voorkomen. Transplantatie van HIV-1 resistent T-lymfocyt of hematopoietische stamcellen, heeft het potentieel om lange termijn controle van HIV-1 replicatie verschaffen bij afwezigheid van de therapie 1,2 en kan ook een effectieve aanpak van een HIV-1 behandeling te bereiken 3. Een manier om cellen resistent tegen HIV-1 replicatie render dient een of meer genen die coderen voor anti-HIV-1 RNA of peptiden in cellen van een geïnfecteerd individu plaatst tijdens een autologe transplantatie 4. Sommige kandidaat anti-HIV-1-genen zijn ontworpen met een aantal invoeren klinische proeven in combinaties van twee of 5 drie 6, de ontwikkeling van HIV-1 resistentie voorkomen dat een enkel gen.

Anti-HIV-1 RNA tot de top kandidaten voor combinatie gentherapie vanwege hun lage potentie tot immuunreacties en omdatgetranscribeerd vanaf zeer korte gensequenties. Sommige anti-HIV-1 RNA's zijn ontworpen om virale binnenkomst en integratie targeten. De meeste anti-HIV-1 RNA doelwit na integratiestappen in de virale levenscyclus (figuur 1). Na integratie remmers omvatten helper-RNA's, gericht op de HIV-1 regulerende eiwitten Tat of Rev 1, en ​​antisense-RNA gebaseerde, gericht is op verschillende plaatsen in HIV-1 RNA, zoals ribozymen 7, shRNAs 8 en 9 U1i RNAs. Werkwijzen die zijn gebruikt om de effectiviteit van anti-HIV-1 RNA te vergelijken onder controle virale replicatie in cellen getransduceerd met genen coderend voor kandidaat RNA's en het meten van virusproductie in cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmiden die kandidaat RNA en HIV-1 expressieplasmide 10 -13. We hebben voorheen een HIV-1-productie-assay voor het screenen van HIV-1 RNA naar nieuwe ribozyme doelplaatsen 13-15. Deze methoden zijn inmiddels verfijnd om het formaat van een RNA te optimalisereninterferentie molecuul tot expressie gebracht uit plasmide-DNA als een shRNA of geleverd als synthetische siRNA 16. De test meet de productie van rijpe virussen uit humane embryonale nier (HEK) 293T cellen, en kan worden gebruikt om de effecten van remmers die post-integratiestappen in de HIV-1 replicatie cyclus targeten (figuur 1) te vergelijken. Voor remmers die pre-integratiestappen targeten, worden alternatieve assays zoals TZM-bl infectiviteit cell assay 17 nodig antivirale werkzaamheid te evalueren.

Belangrijke veiligheidsproblemen voor de afgifte van anti-HIV-1 RNA in de kliniek onder potentiële off-target effecten op de RNA of eiwitten, en activering van aangeboren immuunsysteem sensoren. Om de toxiciteit van anti-HIV-1 siRNA evalueren, hebben wij een cellevensvatbaarheid assay verschillende cellijnen 16 gebruikt. Ook gemeten activatie van het dubbelstrengs RNA immune sensoren, RNA geactiveerd proteïne kinase R (PKR) en toll-like receptor 3 (TLR3), alsmede expression van de interferon-geïnduceerde gen, ADAR1 P150. Deze testen kunnen worden gebruikt om te bevestigen dat de werkzaamheid van anti-HIV-1 RNA's niet door indirecte effecten op cellevensvatbaarheid of immuun activering sensor. Ze zijn ook bruikbaar bij het uitsluiten van kandidaat RNA met potentiële toxiciteiten verdere ontwikkeling.

In de volgende protocollen, procedures nieuwe therapeutische RNAs identificeren en optimaliseren van de vorm van bestaande beschreven. De werkwijzen zijn bruikbaar voor het screenen op RNA gebaseerde na integratie remmers van HIV-1 replicatie en kunnen worden aangepast aan andere post-integratie remmers, zoals kleine moleculen gericht op Rev gemedieerde uitvoer van viraal RNA 18 of CRISPR scherm / Cas systemen die gericht geïntegreerd HIV-1-DNA 19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cellen en transfecties

  1. Cultuur HEK 293T cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Bereid een 2 x 10 5 cellen / ml suspensie in het celkweekmedium. Voeg 500, 100 en 1000 ul van de celsuspensie aan elk putje van 24-well, 96-well en 12-well platen voor virusproductie cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk (Figuur 2A).
  2. Zwenk de platen en incubeer ze O / N bij 37 ° C met 5% CO 2. Kweek cellen 50-70% confluentie.
  3. Volgens een transfectie plan, bereiden verdunningen van de test RNA's en hun controles in 1,5 ml micro-buizen (voorbeeld, Figuur 2B).
    1. Voor de virusproductie assay Bereid een 10 ng / ul verdunning van een HIV-1 expressieplasmide en voeg 10 ul aan elk buisje. Volgende bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA's en een negatieve controle RNA. Voeg 2,5 of 10 pl van elke test RNA en negatieve controle verdunning tot de overeenkomstige buizen van 25 of 100 nM eindconcentraties.
    2. Voor de cellevensvatbaarheid test bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA en een 10 mg / ml verdunning van de positieve controle RNA laagmoleculaire poly I: C. Voeg 2 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen aan de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk.
    3. Voor de activering van het immuunsysteem assay, voeg 20 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen bereid in stap 1.3.2. de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk.
      Opmerking: Voor het testen RNA expressieplasmiden bereiden 10 ng / pl verdunningen in plaats van de 5 uM verdunningen test RNA, waardoor uiteindelijke hoeveelheden 25 en 100 ng van stap 1.3.1. en 100 ng voor de stappen 1.3.2. en 1.3.3.
  4. Voeg 50, 25 of 75 gl DMEM aan elke transfectie buis virale production cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk. Voor virale productie assays, brengen cellen en bereid transfectie buizen naar een bio-safety level 3 (BSL3) laboratorium voor de volgende stap.
  5. Voeg 2 ul van het transfectiereagens achtereenvolgens de transfectie buizen en incubeer 15-20 minuten om complexen te vormen. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke transfectie reagens te gebruiken.
  6. Voeg de gehele transfectiemengsel van elke microbuis druppelsgewijs aan de overeenkomstige posities in de celcultuur platen. Zwenk en incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
  7. Meet HIV-1-productie (deel 2), levensvatbaarheid van de cellen (deel 3) en activering van het immuunsysteem (deel 4) in de celkweek platen (figuur 2C).

2. virusproductie Assay

  1. Verwijder de 24-well celkweek platen uit de incubator en zachtjes wervelen de platen in de BSL3 celkweekkap. Transfer 150 pl supernatant uit elk putje naar een overeenkomstige putje in een 96-well plaat met vlakke bodem, die zal worden gebruikt om te kwantificeren HIV-1-productie.
    Opmerking: Common virale kwantificering assays omvatten het meten van de expressie van de HIV-1 capside-eiwit (p24) door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) 20 kwantificeren viraal RNA door reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) 21 en meten van de activiteit van de HIV-1 RT enzym. Stappen 2,2-2,5 methoden uit te leggen aan HIV-1 RT-activiteit 13,15,16 kwantificeren.
  2. Overdracht 5 pi supernatant overeenkomstige putjes in een 96-well plaat met 25 ul van een virale verstoring cocktail 15 (tabel 1). Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en breng de plaat radioactiviteit werkstation.
    Opmerking: Stap 2.2. is alleen nodig als een radioactiviteit werkstation is niet beschikbaar in de BSL3 laboratorium. Indien de platen niet hoeft uit de te verwijderenBSL3 laboratorium, ga dan naar stap 2.3. en voeg 50 ul van radioactieve / virale verstoring cocktail (Tabel 1) in plaats van de 25 pi radioactief cocktail.
  3. Bereid een radioactieve cocktail 15 (Tabel 1) en voeg 25 ul aan elk putje van virale supernatant en verstoring cocktail. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  4. Spot 5 ui van het reactiemengsel op overeenkomstige velden in een glasvezel Di Ethyl aminoethyl (DEAE) filtermat papier en laat de vlekken drogen 10 min. Spot het reactiemengsel in elke vierkante zodat er geen twee monsters direct elkaar grens. Dit helpt om cross-over tussen de monsters te voorkomen dat bij het bepalen van tellingen per minuut (cpm) in stap 2.6.
  5. Was de papieren 5x gedurende 5 min met 2x saline natriumcitraat (SSC) buffer (Tabel 1), gevolgd door twee 1 min wassen met 95% ethanol. Laat de kranten te drogen en te verzegelen in zakken.
  6. Clip monster zakken containing de filtermat papier in een cassette en plaats de cassette in een microplaat scintillatieteller. Stel de teller cpm lezen voor 32 P met de peildatum voorzien voor de partij van [32 P] dTTP gebruikt in het experiment. Selecteer welke monsters te lezen met behulp van de kaart plaat en start de teller.
  7. Voor elke virale kwantificeermethode, verdelen de waarden verkregen voor elke test RNA de daarnaast negatieve controle en vermenigvuldig deze waarde door 100 om het percentage remming van HIV-1-productie te verkrijgen voor elke herhaling van de test RNA. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA bij verschillende concentraties wordt in figuur 3.

3. levensvatbaarheid van de cellen Assay

  1. Verwijder de 96-wells platen uit de incubator en voeg 20 ul van 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide) verdund in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing ( DPBS) aan elk putje. Incubeer de platen fof 3 uur bij 37 ° C.
  2. Voeg 150 gl isopropanol aangezuurd met detergent (1% NP-40, 4 mM HCI in isopropanol) aan elk putje en incubeer de platen gedurende 2 uur bij KT.
  3. Bepaal de absorptie bij 570 nm in een microplaat spectrofotometer.
  4. Bereken het relatieve MTT stofwisseling voor elke positieve controle en test RNA door de verkregen voor elk monster door de aangrenzende transfectie controle waarde te delen. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in figuur 4.

4. Immune Activation Assay

  1. Verwijder de 12-wells platen uit de incubator en zuig het kweekmedium. Voorzichtig te wassen de cellen tweemaal met DPBS en voeg 70 ul koude lysisbuffer 22 (inclusief protease en fosfataseremmers, tabel 1) aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 10 minuten op ijs.
  2. Transfer cellysaten aan micro tubes en snelle vries ze door onderdompeling van debuizen in vloeibare stikstof. Laat de monsters ontdooien en herhaal voor 2 vries dooi cycli in totaal 3.
  3. Centrifugeer de lysaten gedurende 15 minuten bij 4 ° C, 15.700 xg om celresten te pelleteren. Breng de bovenstaande nieuwe microbuisjes en bepaal de eiwitconcentratie volgens de methode 23,24 Coomassie blue (Bradford).
  4. Resolve 75 ug eiwit uit elk monster in een 10% denaturerende polyacrylamidegel en overbrengen naar een nitrocellulosemembraan zoals eerder beschreven 25,26.
  5. Na elektroforese en overdracht naar een membraan, onthullen eiwitbanden door incubatie van het membraan Ponceau S (Tabel 1) gedurende 1 minuut, gevolgd door wassen in dubbel gedistilleerd water. Gebruik de bands en eiwit ladder als een leidraad voor het membraan te snijden op 80 en 55 kDa.
    Opmerking: In stap kan 4,4 samples worden uitgevoerd op 16 x 18 cm 2 gels naar 34 kDa, zodat het gemakkelijk is om het membraan te snijden op de aangegeven posities en niet dwars door debanden van belang. Als alternatief kunnen meerdere gels worden uitgevoerd met dezelfde monsters om te voorkomen dat het snijden van de membraan.
  6. Spoel de Ponceau S kleuring met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween 20 (TBST, tabel 1). TBST toevoegen 5% magere melk aan de membranen volledig omsluit. Incubeer de membranen bij kamertemperatuur onder schudden gedurende 1 uur.
  7. Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% runderserumalbumine (BSA) en antilichamen verdund tot 1 in 1000 tegen ADAR1 (110 en 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) en fosfo-IRF3 (47 kDa), de bovenste, middelste en onderste delen van het membraan, respectievelijk.
  8. Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en incuberen in TBST met 5% vetvrije melk en met peroxidase gemerkt geit-anti-konijn secundaire antilichamen (verdund tot 1 in 5000) gedurende 1 uur.
  9. Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en toepassen oplossing elektrochemiluminescentie (ECL) de banden zichtbaar op folies volgens instructies van de fabrikant.
  10. Na het visualiseren van de eiwitbanden op films, was de middelste en onderste delen van het membraan gedurende 10 minuten met een antilichaam stripoplossing. Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% BSA en antilichamen tegen totale PKR (bij 1 in 500) en IRF3 (1 in 1000), de middelste en onderste delen respectievelijk. Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam voor de PKR membraan (midden).
  11. Was het onderste stuk van het membraan 5x gedurende 5 min met TBST en incubeer het membraan in TBST met 3% BSA gedurende 1 uur met een antilichaam tegen actine (verdund tot 1 in 5000). Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in Figuur 5. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke antilichamen te gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een algemeen schema van de procedure is weergegeven in figuur 2 een voorbeeld transfectie plan voor drie proeven RNA en een RNA controle verschaft in Figuur 2B. Voor virusproductie en cellevensvatbaarheidsassays, de aflezing voor elke test construct is genormaliseerd op een negatieve controle. Replicaten worden getransfecteerd in sets, zodat elke test RNA wordt genormaliseerd naar de aangrenzende negatieve controle. Dit wordt gedaan om onjuiste gegevens ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De HIV-1-productie-assay beschreven werd uitgevoerd onder toepassing HEK293T-cellen (figuur 2) en is vergelijkbaar met assays gebruikt voor het screenen van HIV-1 RNA doeltreffende ribozym 13, 10,29 shRNA, siRNA 30 en U1i RNA 11,31 doelplaatsen. Verschillende methodes te kwantificeren HIV-1 productie, hebben de meeste studies werd virusproductie 48 uur na cotransfectie van een HIV-1 expressieplasmide met kandidaat-RNAs. Na de productie van HIV-1, onrijpe virio...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De hier gepresenteerde werk werd gesteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (verleent DCB-120.266, PPP-133.377 en HBF-348.967 tot AG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Celcultuur platen, 96 wel, 24 wel, 6 wel.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Poly I:C met laag molecuulgewichtInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfectie reagens voor synthetische RNA's
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfectie reagens voor RNA expressie plasmiden
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA sjabloonSigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat papierPerkin Elmer1450-522
Microplaat scintillatietellerPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplaat spectrofotometerBio-rad1706930
Lyse buffertablettenRoche4693159001, 4906837001protease en fosfataseremmers
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagensBio-rad500-0006
Gel renkamerHoeferSE600
Semi-dry transfercelBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraanBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antilichaam strip oplossingMillipore2504
ECL - PierceThermo FisherPI32106
ADAR1 antilichaamvan Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antilichaamAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antilichaamCell Signaling4947
PKR antilichaamvan Dr. A. Hovanessian
IRF3 antilichaamCell Signaling11904
Actin antilichaamMilliporeMAB1501
Peroxidase-gelabeld geiten anti-konijnKPL474-1506
Peroxidase-gelabeld geiten anti-muisKPL474-1806
Ponceau SSigma-Aldrich6226-79-5

Referenties

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55(2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22(2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96(2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80(2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HIV-1 RNA-targetingRNA-effectiviteitsassayRNA-toxiciteitsscreeningtransiente transfectie-assayvirale productie-assaycelviabiliteitsassayimmuunactivatie-assayoptimalisatie van ribozymenshRNA siRNA-ontwerpBSL-3 laboratoriumprotocol
Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA's Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.