We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks de regeneratieve capaciteit van skeletspieren, permanent functioneel en / of cosmetisch tekorten (bijvoorbeeld volumetrische spierverlies (VML) als gevolg van ernstige verwondingen, ziekten en verschillende congenitale, genetische en verworven aandoeningen komen vaak voor. Tissue engineering en regeneratieve geneeskunde biedt grote potentieel om een therapeutische oplossing. echter het gebruik van biologisch relevante diermodellen in combinatie met longitudinale beoordeling van relevante functionele maatregelen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde regeneratieve therapieën voor behandeling van VML-achtige letsels. Dienaangaande commerciële spier hefboomsysteem kan worden gebruikt voor het meten lengte, spanning, kracht en snelheid parameters in de skeletspier. We hebben dit systeem, in combinatie met een hoog vermogen, bi-fase stimulator te meten in vivo kracht productie in response op activering van het voorste crurale compartiment van de rat achterbeen. We hebben PreviDUREND gebruikt dit apparaat de functionele gevolgen van VML schade aan de tibialis anterior (TA) spier, evenals de mate van functioneel herstel na behandeling van de gewonden TA spier onze tissue engineered spierherstel (TEMR) technologie beoordelen. Voor dergelijke studies, is de linker voet van een verdoofde rat stevig verankerd op een voetplaat gekoppeld aan een servomotor, en de gemeenschappelijke peroneus wordt gestimuleerd door twee percutane naald elektroden op spieren en dorsaalflexie van de voet op te wekken. De peroneus stimulatie-geïnduceerde spiercontractie wordt gemeten over een bereik van stimulatiefrequenties (1-200 Hz), een eventueel plateau geldende productie die zorgt voor een nauwkeurige bepaling van piek tetanische werking garanderen. Naast evaluatie van de mate van schade VML alsmede de mate van functioneel herstel na behandeling, kan deze werkwijze gemakkelijk worden toegepast op diverse aspecten van spierfysiologie en pathofysiologie bestuderen. Een dergelijke aanpak should te helpen met de meer rationele ontwikkeling van verbeterde therapieën voor spierherstel en regeneratie.
Inleiding
Skeletspieren heeft een opmerkelijke intrinsieke capaciteit voor reparatie in reactie op letsel of ziekte 1,2. Experimenteel, de robuustheid van deze regeneratieve respons is goed gedocumenteerd in proefdieren door het bestuderen van bijvoorbeeld het tijdsverloop van skeletspier schade herstel en regeneratie na toepassing van myotoxins (bijvoorbeeld cardiotoxine) 3-7. Meer in het bijzonder, na uitgebreid-cardiotoxine geïnduceerde spierbeschadiging (38-67% van de spiervezels 8), wordt de regeneratie gemedieerd door satelliet-cellen, de resident stamcellen die volwassen genoeg is om uiteindelijk te worden functionele spiervezels 4,9-13. Het eindresultaat wordt verhoogd post-schade functionele regeneratie van gezonde, kracht produceren spierweefsel 14-16. Hoewel de details zijn goed buiten het bestek van dit rapport, de mechanistische basis voor de regeneratie van de spieren weerspiegelt de zorgvuldig georkestreerde gebeurtenissen van een groot aantal celtypen uit meerdere lijnen met behulp van canonical signaalwegen van cruciaal belang voor zowel het weefsel ontwikkeling en morfogenese 5,17-21. Belangrijker is myotoxin-geïnduceerd herstel mogelijk gemaakt door het feit dat de extracellulaire matrix, neuronale innervatie en bloedvaten perfusie structureel intact na-cardiotoxine geïnduceerde spierbeschadiging 3,8,22 blijven. In schril contrast, deze belangrijke weefselstructuren en componenten zijn, per definitie, geheel afwezig in het kader van VML schade; wanneer Frank weefselverlies als gevolg van verschillende oorzaken, tot blijvende functionele en cosmetische gebreken 23-25.
Ongeacht de bijkomende problemen geassocieerd met spier en regeneratie volgende VML letsel vergeleken met myotoxin geïnduceerde spierbeschadiging, beter inzicht in de mechanistische basis voor skeletspieren regeneratie en reparatie, in verschillende contexten, zou goed bediend door gebruik van biologisch relevante diermodellen in combinatie met een longitudinalessessments van relevante functionele maatregelen. Zoals hierin besproken, studies van de ratten achterpoot een uitstekende modelsysteem daartoe. Meer in het bijzonder de spieren van het voorste compartiment crurale (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) en hallicus longus (HL)), die verantwoordelijk zijn voor dorsiflexie van de voet, worden gemakkelijk geïdentificeerd en gemanipuleerd. Bovendien zijn ze bediend door de grote bloedvaten (iliac en takken), en worden geïnnerveerd door zenuwen (ischias en takken, met inbegrip van peroneal) over de gehele lengte van het been 26-28. Als zodanig kan men de ratten achterpoot model voor skeletspierfunctie / pathologie direct beoordelen in vivo, of de meer indirecte invloed van pathologie gerelateerde veranderingen in bloedvaten of zenuwen overeenkomstige skeletspierfunctie evalueren. In beide scenario kan de ernst van de ziekte, en de effectiviteit van de behandeling worden bepaald als functie van spierkracht productie (torsie) en bijbehorende voet movement 29-34.
Idealiter worden krachtmetingen begeleid door histologisch onderzoek en genexpressie analyses om de structurele en moleculaire toestand van de skeletspieren meer rigoureus te evalueren. Basic histologie en immunohistochemie bijvoorbeeld kunnen vragen spieromvang, spiervezel uitlijning extracellulaire matrixsamenstelling, locatie nuclei celaantal en eiwit lokalisatie beantwoorden. Genexpressieanalyse zijn beurt dient voor het identificeren van de moleculaire mechanismen die invloed kunnen / moduleren de looptijd van de spiervezels, ziektetoestanden en metabolische activiteit. Hoewel deze methoden leveren cruciale informatie, die zij vertegenwoordigen in het algemeen terminal endpoints, en belangrijker nog, ze niet aan de functionele capaciteit van de skeletspier rechtstreeks aan te pakken, en dus zijn correlatieve plaats van oorzakelijke. Wanneer echter histologische studies en genexpressie analyses worden geëvalueerd in combinatie met functionele MEASURes, dan mechanismen van kracht productie en functionele regeneratie kan worden het meest nauwkeurig geïdentificeerd.
In dit opzicht kan de kracht met mogelijkheden van een spier gemeten in vitro, in situ of in vivo. Alle drie benaderingen hebben zowel voordelen en beperkingen. In een in vitro experiment, bijvoorbeeld de spier volledig geïsoleerd en verwijderd uit het lichaam van het dier. Door het verwijderen van de invloeden van de bloedvaten en zenuwen die de spieren te leveren, kan het contractiele vermogen van het weefsel in een strak externe omgeving 35 worden bepaald. In situ spiertesten kan de spier te isoleren, zoals bij in vitro preparaten echter de innervatie en bloedtoevoer blijven intact. Het voordeel van de in situ experimentele model is dat het een individu spieren te onderzoeken terwijl de innervatie en bloedtoevoer minimaal wordt verstoord 36. In beidein vitro en in situ experimenten kunnen farmacologische behandelingen directer worden toegepast zonder rekening met de effecten van elke omgevende weefsels of de effecten van de bloedsomloop van de gemeten contractiereacties 37. In vivo effecten tests, zoals hierin beschreven, is de minst invasieve techniek voor het evalueren spierfunctie in zijn natuurlijke omgeving 38, en kan herhaaldelijk worden uitgevoerd in de tijd (dwz longitudinaal). Als zodanig zal het brandpunt van de volgende discussie.
In dit verband percutane elektroden geplaatst nabij de spier van belang of de motorische zenuw die het dient, vormen een elektrisch signaal aan de spier. Een transductor meet vervolgens de resulterende lengte of kracht veranderingen in de geactiveerde spier zoals voorgeschreven door een vooraf bepaalde maat softwareprotocol. Uit deze gegevens kunnen de fysische eigenschappen van de spier worden bepaald. Daaronder vallence-frequentie, maximale tetanus, kracht-snelheid, stijfheid, lengte spanning en vermoeidheid. Muscle lengte of kracht kan ook constant worden gehouden, zodat de spier contracten isometrisch of isotoon. Belangrijk, kan deze experimentele protocollen snel worden uitgevoerd, eenvoudig herhaald en customized- allemaal terwijl het dier verdoofd met een herstelperiode van uren tot dagen. Een enkel dier kan ondergaan in vivo testen van kracht meerdere malen, waardoor longitudinale studies van de ziekte van modellen of evaluatie van de therapeutische platforms / technologieën.
Zoals hierin beschreven, een commercieel spier hefboomsysteem in combinatie met een hoog vermogen, tweefasige stimulator wordt gebruikt presteren in vivo spierfunctie testen om de bijdrage van de tibialis anterior spier van de rat achterpoot om dorsiflexie van de voet evalueren via stimulatie van de peroneus. We hebben een protocol dat speciaal is ontworpen om de regeneratieve geneeskunde / ti evalueren ontwikkeldssue techniektechnologieën voor spierherstel na traumatisch VML letsel van de rat TA spier. Opgemerkt; de EDL en HL moeten uit de anterior crurale compartiment worden ontleed om specifiek te evalueren de TA spier (ze zijn goed voor ongeveer 15-20% van de totale tibialis anterior koppel gemeten na peroneus stimulatie (Corona et al., 2013) ). Omdat deze aanpak biedt uitgebreide longitudinale analyse van de spier fysiologie / functie, kan het belangrijk mechanistisch inzicht te werpen op tal van andere typen van fysiologische onderzoeken, evenals een verscheidenheid van ziekte of therapeutische gebieden 39. Bijvoorbeeld in vivo spierfunctie testen geldt voor studies van inspanningsfysiologie, ischemie / reperfusie onderzoek, myopathie, zenuwbeschadiging / neuropathie en vasculopathie, sarcopenie en spierdystrofieën 40.
Protocol
Alle dieren werden humaan behandeld en alle protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Virginia IACUC.
1. apparatuur Voorbereiding
- Zorg ervoor dat alle apparaten goed zijn aangesloten.
- Zet de computer aan, gevolgd door de high-power bi-fase stimulator en dual-mode hefsysteem.
- Op dit moment, plaats het dier in de met 2% isofluraan geleverd anesthesie kamer, en zet het verwarmingselement, zodat het platform wordt verwarmd tot 37 ° C.
- Plaats de elektroden in 70% ethanol, zodat de polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate tips worden ondergedompeld en worden gedesinfecteerd tijdens het instellen van het apparaat en de software.
- Zoek en open de hendel besturingssoftware op het bureaublad.
LET OP: Dit zal de software die nodig is om functionele testen uit te voeren.
2. Software-installatie
- Zodra het programma wordt geopend (Figuur 1A), wijzigt u de parameters voor Instant Stim onder het menu Setup om de gewenste waarden.
Opmerking: In dit protocol alle parameters blijven op de ingestelde niveaus met uitzondering van "Run Time (s)", die wordt gewijzigd in 180 seconden (Figuur 1B). - Maak een map Autosave onder het menu Setup.
- Zoek een type staat venster genaamd "Autosave Base". Voer de naam van het monster, bijvoorbeeld "Rat1-date-tijdstip". Direct aan de linkerkant van de "Autosave Base" type-staat venster, klikt u op het vakje "Enable Automatisch opslaan."
- Op de top van het bedieningsscherm wordt weergegeven, selecteert u "Sequencer". Een nieuw venster wordt geopend. Op de bodem van het nieuwe venster, selecteer "Open Sequence". Een nieuw venster wordt geopend. Selecteer de premade volgorde en klik op OK. Een protocol lijst met reeks parameters, waaronder de frequentie, de duur van de stimuli, en rusttijden zal ontwikkelen in het venster met de naam: Sequence Editor (figuur 1C). Klik op "Load Sequence" -> & #34; Venster sluiten ".
- Om real-time stroom en stimulatie te zien, selecteer "File" -> "Live Data Monitor". Een nieuw venster wordt geopend.
- In de nieuwe Live-gegevens Window, formaat scherm voor het testen met behulp van de autoscale functie of handmatig invoeren van de maximale en minimale y-waarden die worden weergegeven op het scherm.
3. Animal Set-up
Let op: alle krachtmetingen zijn die van een 11 weken oude Lewis rat. Er is een lineaire correlatie tussen de spiermassa en kracht productie (in Newton). Daarom, zoals de leeftijd van de rat toeneemt, de krachtwaarden door het been moet toenemen.
- Zorg ervoor dat het dier in de juiste vlak van anesthesie voordat u deze uit de narcose kamer. alle haren te verwijderen van de laterale zijde tussen de enkel en het bekken van de experimentele been met een elektrische tondeuse.
OPMERKING: De juiste vlak van anesthesie is bereikt wanneer het dier is niet reageren op een teen knijpen. Het is noodzakelijk om de richtlijnen naar voren gebracht door Animal Care en gebruik Comite van elke instelling te volgen. - Plaats het dier in rugligging, zorgen voor de neus van het dier is stevig in de anesthesie neuskegel, zodat het op het voldoende diepte van de anesthesie blijft.
- Regel de positie van het pedaal inrichting met drie onafhankelijke knoppen (figuur 2). Met de knoppen (A en B) naar het voetpedaal te passen, kan het pedaal apparaat bij de meest linkse en laagste stand respectievelijk. Dit zal de juiste positionering van de voet van het dier mogelijk tegelijkertijd voldoende ruimte voor latere manipulaties. Op deze positie, met de draaiknop aan de linkerkant van de weg naar de inrichting bewegen toe of verder van de experimentator zodat het dier poot ligt in een rechte vlak.
- Reinig het been met drie wijzigingen van jodium en alcohol. Jodium moeten aan de poot blijven 30 sec.
- Pas het dier of platform(Figuur 2A, D), zodat de gestrekte been zorgt voor volledige contact tussen de voetzool en het voetpedaal.
- Met behulp van medische tape, zet de voet van het dier tegen de voetplaat (figuur 2D). Het is cruciaal dat de hiel vlak tegen de onderzijde van het pedaal en de hele voet is plat en niet los van de plaat tijdens de test.
- Zoek het klemmechanisme om het been te stabiliseren. Duw de stabiliserende pin in ver genoeg om de beweging van het been te verminderen en zet het op zijn plaats door het draaien van de inbussleutel.
- Op deze positie, met de draaiknop C om de inrichting te bewegen hetzij naar of van de experimentator zodat de enkel, tibia en femur liggen in een rechte lijn (figuur 2C). Zorg ervoor dat het been is parallel met de voetpedaal. Maak aanpassingen op de cursus en fijne knoppen op de achterkant van het apparaat, om langzaam te bewegen de enkel, zodat de voet en onderbeen zijn bij een 90 ° positie.
- continue aan het been te bewegen zodat het bovenbeen en onderbeen zijn bij een 90 graden loodrechte hoek (figuur 2B). Op dit moment is het dier klaar voor de elektroden.
4. Plaatsing van de elektroden
- Activeren "Instant Stim" door te klikken op de oranje knop "Instant Stim".
- Plaats beide elektroden oppervlakkig aan het proximale uiteinde van de tibialis anterior en beweeg de elektrodetoppen rond tot pieken worden gezien op de levende monitor. Idealiter zou de pieken ongeveer 0,4 N.
OPMERKING: De elektroden moeten naast en loodrecht op het vlak van peroneus, die op hun beurt loopt lateraal van de knie en loodrecht op de tibia geplaatst. - Steek een naald ver genoeg om doorboren dermis, en nauwelijks in de spierlaag. Verplaats de andere elektrode rond totdat spikes zijn te zien op de live-monitor ongeveer 0,6 N. Insert naalden en klem hen in plaats met behulp van een hobby klem of medische tape.
- EENdjust grove en fijne aanpassingen van de maximale kracht de uitgang te vinden.
- Op de hoogvermogen bifase-stimulator, zullen er twee knoppen in het midden. Een daarvan is het label "RANGE" en de andere "ADJUST". Draai de "RANGE" knop om de gewenste maximale stroomsterkte.
OPMERKING: De pieken langzaam toe in grootte, en de maximale stroomsterkte wordt bepaald als het niveau waarop drie opeenvolgende stimuli resulteren in identieke contractiele responsen. Weersta het draaien van de stroomsterkte hoger dan noodzakelijk; de maximale stroomsterkte de hele spier samentrekken stimuleren, maar geen hogere stroom leidt tot de rekrutering van aangrenzende spieren en mogelijk ook antagonisten. - Draai de "ADJUST" knop om het percentage van de "RANGE" die wordt gebruikt om de spier te stimuleren instellen. Op dit punt moet kracht ongeveer 1,0 N. lezen Dit kan een toename of afname vereisen.
- Controleer de elektroden om ervoor te zorgen dat ze veilig zijn. StopInstant Stim.
- Op het venster "Live-gegevens", klik op "Start Sequence."
- Blijf de bochten te controleren door terug naar het bedieningsscherm te gaan en te klikken op de "analyse" knop boven de oranje 'Instant Stim "knop bevindt. De tetanische curve moet beginnen vorm te krijgen rond de 60 Hz stimulatie.
5. Afwerking Stimulatie en Clean Up
- Nadat de reeks is voltooid, verwijdert elektroden en schoon te vegen met 70% alcohol. Plaats de elektroden in de covers.
- Maak de knie klem en uit te schakelen anesthesie. Verwijder het dier uit de narcose gas en plaats het dier in de buikligging, nog steeds op de verwarming pad. Handhaving van de rat op 100% O 2 voor een paar minuten na de isofluraan gas is uitgeschakeld om de rat zuurstofrijk te houden. Het dier kan in eerste instantie te verplaatsen, maar het dier niet terug te keren naar de kooi totdat het dier het bewustzijn herwint. Als spierpijn wordt opgemerktna herstel, moet een dosis van NSAID worden gegeven zoals gespecificeerd door uw dier zorg commissie.
- Schakel alle van de in stap 1.2 vermelde apparatuur, sluit u de software, en nog steeds data-analyse.
- Veeg het platform en voetpedaal.
6. Data Analysis
LET OP: Data-analyse wordt uitgevoerd om een reeks van dit lab ontworpen en volgens lab protocollen passen. Analysewaarden, datapunten van belang, en andere aspecten van de procedure zal veranderen, afhankelijk van de bedoeling van de gebruiker.
- Open de gegevensanalyse software.
- Op het menu Throughput Hoge analyse van meerdere databestanden (samples) mogelijk tegelijk. Selecteer "Force Frequency" Analysis.
- Klik op de "Pick Files" knop en open zo veel opgeslagen data bestanden zoals gewenst.
- Selecteer "Manual" in het vakje Cursor Plaatsing Methode.
LET OP: Dit stelt de gebruiker in staat om alle van de DAT analysereneen binnen een gewenst tijdstempel, in tegenstelling tot het programma de analyse plaats selecteert. - Verander de End Cursor timestamp waarde 2. Klik op de knop "Analyseren" (figuur 1D).
- Om de tafel te slaan en de gegevens met behulp van een spreadsheet te analyseren, klikt u op de "Save Table knop om ACSII. Dit zal het bestand op te slaan, en het kan worden geopend met een spreadsheet op een later tijdstip.
- Open het opgeslagen bestand in spreadsheet.
- Een extra kolom "Absolute Maximum" en bepaalt het verschil tussen de basislijn en de maximale waarden voor elk monster. Dit zal de totale maximale kracht die bij elke frequentie leveren.
- Om het koppel te bepalen, vermenigvuldig elke kracht waarde door de lengte van de hefboomarm.
Opmerking: In dit geval zou dat wordt voorgesteld door de voetlengte van het dier. Dit protocol maakt gebruik van de gemiddelde experimenteel bepaalde waarde van 30 mm. De gebruiker heeft nu bepaald de waarden voor de maximum torque geproduceerd bij elke frequentie. - Grafiek deze waarden als belasting- frequentie curve of het maximale draaimoment geproduceerd door het dier in alle stimulatiefrequenties.
LET OP: Dit kan worden geïdentificeerd en gebruikt als een enkel punt van vergelijking tussen de monsters.
Resultaten
De tetanische curve kan worden gebruikt om een optimaal resultaat van suboptimale resultaten onderscheiden. Deze curve begint meestal te vormen met een frequentie van 60 Hz. De belangrijke factor voor het verkrijgen van goede resultaten is de mogelijkheid om de spier te stimuleren zodat produceert zijn maximale kracht en stelt die kracht tijdens tetanus. De ideale kromme dient een ononderbroken, scherp, verticaal opleving bij de stimulatie, gevolgd door een vlak plateau fase met minimale trillingen en een ononderbroken verticale scherpe daling periode bij beëindiging van de stimulatie (figuur 4) hebben. Afwijkingen van de ideale curve zijn aanwijzingen dat de spier wordt vermoeid (Figuur 5D), of dat de spier is niet goed gestimuleerd om maximale kracht te produceren (Figuur 5B - C). Dat laatste resulteert in het algemeen van een verkeerde plaatsing van elektroden die leiden tot het falen van de maximale werving van spiervezels tijdens stimulatie. Een onderscheidend kenmerk dat de onderzoeker mogelijk maakt om te bepalen of een niet-ideale curve is het resultaat van verkeerde plaatsing van de elektroden of pathologische veranderingen in de spieren of de tetanische curve voltooid (gefuseerde) of incompleet (gefuseerde). Een gefuseerde onvolledig tetanische curve geeft aan dat de elektroden misplaatst, waardoor de spieren niet ervaren van een maximale contractie. Een voorbeeld van een pathologische verandering in de spier kan worden waargenomen een verminderde maximale contractie vergeleken met de controle, of een contractiele respons die sneller vermoeit.
De drie verschillende pieken verkregen in de loop van deze procedure vertegenwoordigen verschillende elektrode en beenposities en is te zien in figuur 3. De eerste pieken liggen rond 0,4 N doet zich voor als de juiste plaatsing van de elektroden oppervlakkig wordt bepaald aan de huid (fig 3A). De tweede set van pieken heeft higher amplitude, meestal rond 0.5-0.6N (Figuur 3B) doet zich voor als de elektroden doorboren de dermis. Nadat deze zijn verkregen, worden de benen en voeten aangepast te dwingen productie die wordt bereikt wanneer het maximaliseren piekamplitude toeneemt tot ongeveer 1 N of meer (figuur 3C). Op dit punt, kan Instant Stim worden uitgeschakeld en de volgorde kan beginnen. Deze richtlijnen zorgen voor nauwkeurige en reproduceerbare resultaten en zijn belangrijke checkpoints in het hele protocol.
De eindresultaten kan worden weergegeven op verschillende manieren, afhankelijk van de informatie die de gebruiker gewonnen uit de kracht test en de experimentele opzet. In dit protocol wordt de maximumkracht gemeten over alle frequenties van stimulatie, maar andere kunnen belangrijke gegevenspunten voor een bepaalde onderzoeker of applicatie. Een voorbeeld is de frequentie van de stimulatie waarmee de tetanische curve begint vorm te krijgen. Thij gegevens kunnen worden vergeleken met andere resultaten van een eerdere of latere experiment op hetzelfde dier of vergelijkingen tussen verschillende behandelingsgroepen. Force productie kan worden genormaliseerd door de body mass te isometrische kracht berekenen en zorgen voor een onpartijdige beoordeling van de invloed van leeftijd op de maximale contractie waargenomen. Hoewel dieren van verschillende lichaamsgewicht en leeftijd verschillende maximale krachten zal hebben, kan de vorm van de curve tetanische overeenstemming tussen alle groepen wanneer de procedure correct wordt uitgevoerd.
Figuur 1: Overzicht van het hefsysteem en data-analyse software voor analyse (A) Algemene beschrijving van de regelsoftware bij het openen van het programma.. (B) Parameters voor "Instant Stim." (C) Voorbeeld sequentie voor force-frequentie stimulatie. (D ) Vertegenwoordiger van gegevens van een high throughput kracht frequentie-analyse in de analyse software. Opgemerkt dient te worden dat het voorbeeld volgorde en data-analyse procedure is specifiek voor dit protocol en niet het volledige scala aan sequenties en uitgangen die worden geleverd door deze software te vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: kritische aspecten voor positionering van de rat en plaatsing van de voet van de inrichting (A) De rat wordt in een liggende positie met de linker voet stevig bevestigd aan de voetplaat.. De rechte hoeken door de voet, been en dij zijn omcirkeld. (B) de juiste hoek die door de enkel is gemarkeerd. (C) Het been moet uitgelijnd in een rechte vliegtuig van voet naar het lichaam. (D) De plaatsing van de elektroden is parallel en loodrecht op het vlak van de peroneus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve Peaks Het aantonen van het belang van correcte elektroden plaatsen op maximale kracht Production (A) Baseline piek tetanische respons waargenomen met elektroden te oppervlakkig geplaatst.. (B) De pieken met de elektroden op de juiste plaats ingevoegd. (C) Overgang van grotere pieken signalering juiste plaatsing van elektroden om een optimale pre-sequentie piekamplitude als het been en de voet posities worden optimaal aangepast./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Optimale Tetanische Curve bij 100 Hz Deze curve stijgt en daalt sterk en heeft een vlakke plateau fase. Dit voorbeeld geeft aan de juiste plaatsing van de elektroden en de maximale kracht stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Representatieve voorbeelden van Sub-optimale Tetanische Curves verkregen bij 100 Hz (A) Naar aanleiding van ontspanning, deze curve dips onder de basislijn. Dit wijst op stimulatieantagonisten. (B - D) Deze grafieken zijn het gevolg van verkeerde plaatsing van de elektroden en ongelijke rekrutering van spiervezels. Het plateau fasen aan te tonen grote schommelingen (B), een opwaartse helling (C), of een neerwaartse helling (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Dit protocol toont een relatief eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren van in vivo spierfunctie proeven op het voorste compartiment van het crurale rat achterbeen. Andere vormen van spierfunctie testen, met inbegrip van ex vivo en in situ protocollen, kan ook belangrijke informatie over spierfysiologie. De betekenis van de in vivo effecten test ligt in het invasieve karakter en het feit dat het nauwkeurigst recapituleert endogene mechanismen van spierstimulatie. Voor zowel ex vivo en in situ testen, de pees en / of spier worden blootgesteld, en daarom moet vochtig gehouden of ondergedompeld 41,42. In vivo testen verwijdert verstorende variabelen trauma en ontsteking die wordt veroorzaakt door het chirurgisch procedures die in situ spierfunctie testen; Dit is vooral van belang als het doel van het experiment is om inflammatoire en cellulaire processen te onderzoeken 43. Bovendien, in vivo testen vereist weinig chirurgische vaardigheid als de spier niet van de omgeving is geïsoleerd en vereist geen nauwkeurige knopen spier / pees slippen te verminderen (zoals het geval is in situ of ex vivo testen) 41. Bovendien, met voldoende ervaring, de snelheid van de juiste plaatsing van de elektroden en het vermogen om snel aanpassingen van maximale kracht productie van de spier bereiken zorgt dat protocol voltooid is snel en reproducible- zowel in dieren als tussen verschillende gebruikers van dezelfde apparatuur 39 . Het is gunstig om te beginnen met een beoordeling van de gehele voorste crurale component zoals geïllustreerd vóór uitsnijden van de minder toegankelijke synergistische spieren (EDL en HL) directere onderzoek naar de TA spier. Met deze aanpak kan men vrij snel te bereiken beheersing van de techniek. Hoewel de hierin beschreven procedure laat zien en wijst op het nut van een kracht frequency protocol om tetanus induceren en het bepalen van de maximale kracht geproduceerd door een spier, moeten de gebruikers het type (s) van de functionele testen die het best hun specifieke experiment (s) en onderzoek doelen zouden op de hoogte te bepalen.
Er zijn verschillende kritische stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om optimale en reproduceerbare experimentele resultaten, dat wil zeggen, constante maximale kracht productie door de spier van verschillende stimulatieparameters. Verscheidene belangrijke kenmerken zijn aangegeven in figuur 2. Echter juiste plaatsing en stabiliteit van de stimulerende elektrode een absolute voorwaarde voor reproduceerbare maximale stimulering van de peroneus. In dit verband moet de elektroden oppervlakkig worden geplaatst. Namelijk als de plaatsing van de elektroden te diep riskeert een directe elektrische stimulatie van antagonistische spieren, waardoor de omvang van de waargenomen contractierespons van het voorste compartiment crurale afneemt. Verder is detwee elektroden moeten zo dicht geplaatst bij elkaar als mogelijk is de elektrische weerstand van de omringende huid en bindweefsel verminderen. In het algemeen elektrode positie nabij de knie en mediaal van het been toerekenen de rand van de tibialis anterior waar het de gastrocnemius levert vaak voldoende kracht productie. Dit zorgt er ook voor dat de elektroden elkaar liggen en loodrecht geplaatst op het vlak van de peroneale zenuw, die op hun beurt loodrecht op de tibia en zijdelings langs het been van de knie. Echter, de natuurlijke variabiliteit in de anatomie tussen dieren vereist constante waakzaamheid om ervoor te zorgen dat de plaatsing van de elektroden is geoptimaliseerd op case-by-case basis. Als zodanig is er een zekere mate van proefondervindelijk verband met plaatsing van de elektroden die beduidend wordt verminderd door de ervaring van de gebruiker. Het aantal keren dat de elektroden doorboren de huid moet worden geminimaliseerd om de zwelling en ontsteking te verminderen, wat me afneemtasured kracht productie. Dit is afhankelijk van waar de naalden eerst worden geplaatst, maar het wordt aanbevolen om de naalden tweemaal verplaatsen of minder bijzonder in het gebied rond de knieschijf. Tenslotte, wanneer de elektroden in de poot van het dier worden geplaatst, kleine aanpassingen kunnen worden aangebracht in de positie van het been en de door middel van de elektroden stroom. Dit moet gebeuren tegelijkertijd bewaken van de werking van uit één ruk. Naast plaatsing van de elektroden, kunnen aanpassingen worden aangebracht in de geleverde spanning over de elektroden. In de hier beschreven configuratie, is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het verhogen van de spanning als een manier om krachtuitvoerelement verhogen omdat de verhoogde spanning van de zenuwen die de spieren innerveren antagonist stimuleert.
Er zijn drie belangrijke technische problemen die moeten worden gevolgd om ervoor te zorgen dat de elektrode plaatsing optimaal blijft. Ten eerste moet de voet van het verdoofde dier stevig wordenverankerd aan het voetpedaal inrichting, die de spierkracht productie (figuur 2) meet. Indien de voet niet stevig is verankerd, kan de ware kracht geproduceerd door de spier niet volledig worden vertaald naar de krachtopnemer. Instabiele voet fixatie voert ook het risico dat de optimale plaatsing van de elektroden beweging buiten normale spiercontractie (de voet af te stappen van de voetplaat) kan verplaatsing van de elektroden veroorzaken hun oppervlakkige hetzij volledig los te. Ofwel scenario zal de gemeten kracht te verlagen. Ten tweede moet het lichaam van het dier volledig liggende en uitgelijnd in een rechte vlak (figuur 2) zijn. Een correcte positionering van de dieren lichaam voorkomt kleine bewegingen van de poot door ademhaling en minimaliseert ook draaien van het been en bekken, waardoor betere positie en voortdurend contact van de stimulerende elektroden. Derde juiste positionering en verankering van de knie is critical zodat het been stabiel blijft, en dus stabiliseert de optimale plaatsing van de stimulatie-elektroden consistente activering van de peroneus mogelijk.
Er zijn een paar extra punten die moeten worden benadrukt. Eerst wordt de commerciële spier hefboomsysteem ontwikkeld proeven worden uitgevoerd op de linkerpijp, maar de installatie kan worden aangepast proeven worden uitgevoerd op de rechter been. Ten tweede kan spier hefboomsysteem gekozen op basis van de grootte van het dier, zodat gebruikers te waarborgen dat de gebruikte platform adequaat te meten en vervolgens de kracht die door het diermodel van keuze. Testbare spieren voor de apparatuur platform zijn beperkt tot die welke plantar extensie of dorsaalflexie van de voet induceren. Ten derde moet het weer worden benadrukt dat de plaatsing van de elektroden kan een uitdaging zijn en vereist geduld en oefenen om de techniek onder de knie. Elektroden ook snel saai worden bij regelmatig gebruik, dus is het nuttig om een aantal extra s hebbenets ditmaal wordt het moeilijk om de huid oppervlakkig prikken. Ten derde, de in dit rapport beschreven protocol maakt gebruik van specifieke stimulatie sequenties en procedures voor data-analyse. De spier hefboom besturingssoftware en gegevensanalyse software en data biedt een groot aantal andere experimentele vragen en dus beantwoorden, het nut reikt dan wordt hierin uiteengezet. Zo worden gebruikers aangemoedigd om te verkennen buiten de grenzen van de software protocol (s) in dit document. Ondanks deze kleine beperkingen in vivo spierfunctie testen is een krachtige aanpak om de gezondheid en contractiele vermogen van skeletspieren bepalen omdat het minimaal invasief en kan worden uitgevoerd op meerdere malen over een langere tijd, op hetzelfde dier. Kortom, dit type bruikbaar pakket maakt het systeem bijzonder bedreven bij het testen van de effecten van nieuwe therapieën voor skeletspieren letsel of ziekte in ratten achterpoot.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Hannah Baker bedanken voor haar uitgebreide werk bij het optimaliseren van deze procedure.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
| Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
| Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
| Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
| VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
| T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | stel de Continuous Therapy Time in op 38/100 voor temperatuur |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | halveren om dunnere stroken te maken |
| A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
| Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
| Alcohol Swabs | |||
| 200 proof Ethanol | Decon labs | verdund tot 70% met gedeïoniseerd water | |
| cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
| Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
| servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
| Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | neem contact op met de fabrikant om te bestellen |
| Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
| High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
| Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
| Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |
Referenties
- Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
- Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
- Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
- Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
- d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
- Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
- Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
- Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
- Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
- Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
- Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
- Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
- Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
- Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
- Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
- Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
- Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
- Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
- Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371(2014).
- Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
- Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
- Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
- Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
- Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198(2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167(2011).
- Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246(2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
- Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37(2011).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
- Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
- Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).
Herprints en machtigingen
