Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus En andere Vibrio Species

Summary

Detectie en isolatie van klinisch relevante Vibrio-soorten vereisen selectieve en differentiële kweekmedia. Deze studie evalueerde het vermogen van een nieuw chromogeen medium om V. parahaemolyticus en andere verwante soorten te detecteren en identificeren. Het nieuwe medium bleek betere gevoeligheid en specificiteit te hebben dan het conventionele medium.

Abstract

Voedselinfecties in de Verenigde Staten, veroorzaakt door Vibrio soorten hebben laten zien een stijgende trend. In het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is verantwoordelijk voor het merendeel van Vibrio geassocieerde infecties. Aldus nauwkeurige differentiatie bij Vibrio spp. en detectie van V. parahaemolyticus is van cruciaal belang voor de veiligheid van onze voedselvoorziening te waarborgen. Hoewel moleculaire technieken worden steeds vaker worden kweek afhankelijk methoden nog routinematig en ze worden beschouwd standaardwerkwijzen onder bepaalde omstandigheden. Daarom werd een nieuwe chromogene agar medium getest met als doel het bieden van een betere werkwijze voor isolatie en differentiatie van klinisch relevante Vibrio spp. Het protocol vergeleken de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet voor de detectie van V. parahaemolyticus tussen de nieuwe chromogene medium en een conventioneel medium. Diverse V. parahaemolyticus stammen (n = 22) rede presentatie van diverse serotypes en de bron van oorsprong werden gebruikt. Zij werden eerder geïdentificeerd door de Food and Drug Administration (FDA) en de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en door TLH -PCR in ons laboratorium verder geverifieerd. In ten minste vier afzonderlijke onderzoeken werden deze stammen geënt op de chromogene agar en thiosulfaat-citraat-galzouten sucrose (TCBS) agar, is de aanbevolen medium voor het kweken van deze soort, gevolgd door incubatie bij 35-37 ° C gedurende 24 -96 uur. Drie V. parahaemolyticus stammen (13,6%) niet optimaal groeien op TCBS, toch tentoongesteld groene koloniën als er groei. Twee stammen (9,1%) niet de verwachte cyaan kolonies opleveren op het chromogene agar. Niet- V. parahaemolyticus stammen (n = 32) werden ook getest om de specificiteit van het chromogene agar te bepalen. Onder deze stammen, 31 niet groeien of tentoongesteld andere kolonie morfologie. De gemiddelde herstel van de V. parahaemolyticus op de chromogenic agar was ~ 96,4% betrokken op tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% NaCl. Concluderend, de nieuwe chromogene agar is een effectief medium te detecteren V. parahaemolyticus en het te onderscheiden van andere vibrio.

Introduction

Als lid van het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is een Gram-negatieve, niet-sporen-vormende, gebogen, staafvormige bacterie. Vertoont hoge motiliteit in zowel vloeibare en halfvaste omgevingen. De meeste V. parahaemolyticus stammen zijn niet-pathogeen voor mensen, maar de pathogene subtypen veroorzaakt epidemieën en pandemieën, waardoor deze soort wordt beschouwd als een belangrijke voedselpathogeen in veel landen ^1,2. De incidentie van Vibrio infectie in de VS heeft een stijgende trend sinds 2000 ^3. Onder Vibrio spp., V. parahaemolyticus is de meest frequent gemelde soorten veroorzaken ziekten in de VS ^4,5. Andere klinisch relevante soorten zijn V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Een klein percentage van de ziekte wordt veroorzaakt door meerdere soorten tegelijk.

V. parahaemolyticus is een natuurlijke inhabitant van zeewater en dus op grote schaal verspreid in mariene wateren over de hele wereld met inbegrip van de estuaria. De soort werd ontdekt in 1950 na een uitbraak van voedselvergiftiging in Japan. In de VS werd de soort voor het eerst geïsoleerd in zeewater, sedimenten en schelpdieren in de Puget Sound regio ^6,7. Filtervoeders in mariene habitats, zoals tweekleppige schelpdieren, kan haven V. parahaemolyticus als onderdeel van hun natuurlijke flora ^8. Als zodanig V. parahaemolyticus infecties bij de mens zijn vaak gekoppeld aan de consumptie van besmette vis, vooral rauw of onvoldoende verhit schelpdieren. Een minder gebruikelijke route van binnenkomst optreedt wanneer open wond wordt blootgesteld aan zeewater, waardoor huidinfectie. De meeste V. parahaemolyticus spanningen veroorzaken geen ziekte bij de mens, maar toch bepaalde subtypen herbergen virulentie factoren, zoals thermostabiel direct hemolysine (TDH) zijn pathogeen. De meest voorkomende symptomen van voedselvergiftiging V. parahaemolyticus infectiediarree en buikpijn, gevolgd door misselijkheid, braken, en koorts. Hoofdpijn en koude rillingen zijn ook gemeld. De mediane incubatietijd is 15 uur, maar kan tot 96 uur na consumptie van voldoende hoeveelheid pathogene stammen ^9. De ziekte duurt twee tot drie dagen. De gastro symptomen veroorzaakt door V. parahaemolyticus grotendeels zelfbeperkend en daarom speciale behandeling niet nodig. Milde gevallen van gastro-enteritis kunnen worden behandeld door orale rehydratie. Ernstigere ziekten kunnen worden behandeld met antibiotica zoals tetracycline en ciprofloxacine ^10. Sterftecijfer ongeveer 2% voor gastro gevallen, maar kan oplopen tot 29% voor die septicemie of sepsis ontwikkelen. Elke persoon die vis consumeert of heeft open wond blootgesteld aan zeewater is het risico van V. parahaemolyticus infectie. De ernstigere vorm van ziekten, levensbedreigende septikemie, komt vaker voor bij een subpopulatie met onderliggende medische conditions ^11, die alcoholisme, leverziekte, diabetes, nierziekte, maligniteit en andere omstandigheden die leiden tot een verzwakte immuunrespons omvatten. Met name deze groep van individuen is ook op een hoger risico voor het oplopen van ernstige ziekten veroorzaakt door V. vulnificus, die kan worden gevonden in vergelijkbaar met V. natuurlijke habitats parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus wordt routinematig geïsoleerd met behulp van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar als een selectieve en differentiële medium. Verrijking in alkalisch peptonwater kan isolatie voorafgaan op TCBS agar. Vermoedelijke kolonies op TCBS worden verder getest in een reeks van biochemische tests en / of moleculaire assays gericht op de aanwezigheid van soortspecifieke genen. PCR-gebaseerde werkwijzen worden vaak gebruikt om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus door het versterken van de thermolabiele hemolysin gen, TLH ^12.

Ongeacht de lOICE van bevestigingsmethoden, is het belangrijk om een effectief medium te isoleren en te differentiëren V. hebben parahaemolyticus van andere mariene vibrio's in de eerste plaats. TCBS is routinematig gebruikt om soorten differentiëren binnen de genus Vibrio naar vermogen om sucrose ¹² gisten. Positieve fermentatie gepaard gaat met een kleurverandering van de pH-indicator broomthymolblauw. V. parahaemolyticus kolonies zijn vrij onderscheidend op TCBS, tentoonstellen blauw naar groen kleur. Dit kan echter niet gemakkelijk onderscheiden medium V. alginolyticus en V. cholerae. sucrose fermenteren Proteus soorten kunnen gele kolonies die lijkt V. produceren cholerae of V. alginolyticus ^13. Bij de eerste isolatie op TCBS, V. parahaemolyticus kan ook worden ten onrechte aangemerkt als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides en Pseudomonas spp ^14. Stammen met vertraagde sucrose fermentatie kan worden verward met andere sucrose nonfermenting Vibrio ^13, die onder meer V. parahaemolyticus. TCBS bleek ongevoelig tegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, onder anderen. Verscheidene andere soorten op groen naar grijs kolonies die mogelijk worden verward met V. parahaemolyticus of V. vulnificus ^15. Dientengevolge is het wenselijk om alternatieve kweekmedia ontwikkelen betere gevoeligheid en specificiteit richting detecteren en isoleren V. parahaemolyticus en andere nauw verwante soorten.

Verschillende media alternatieven zijn recent ontwikkeld. Naast het opnemen van selectiemiddelen meeste nemen chromogene substraten soorten onderscheiden op basis van hun differentiële enzymatische activiteiten. Bijvoorbeeld zijn indoxyl-β-glucoside en indoxyl-β-galactoside gebruikt als chromogene substraten V. differentiëren parahaemolyticus kolonies (die blauw-groen weergegeven) van die van V. cholerae (paars) vanwege hun differentiële vermogen om β-glucosidase en β-galactosidase ¹⁶ te produceren. Verschillende formuleringen van chromogene agar ontwikkeld door verschillende groepen onderzocht en gerapporteerd vergelijkbaar of beter dan TCBS ^17,18,19 te voeren. Een voordeel van het gebruik van een chromogeen medium is dat het kleuren van het omringende medium minimaal is waardoor de isolatie van bepaalde kolonies vergemakkelijkt. In dit onderzoek onderzochten we de mogelijkheid van een nieuw geformuleerde chromogeen medium voor detecteren en isoleren V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus; met een speciale focus op het vermogen om onderscheid te maken V. parahaemolyticus van andere soorten.

Protocol

1. Media en het kweken van bacteriestammen

LET OP: Gebruik aseptische technieken in alle experimenten. Gebruik steriele materialen. Steriliseren alle containers, instrumenten en reagentia voor gebruik. Autoclaaf alle afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering, omdat ze biologisch gevaarlijk worden beschouwd. Autoclaaf temperatuur en tijd combinatie ≥121 ° C x ≥15 min voor elk van de volgende procedures.

1. Om ~ 1-L tryptische soja-agar (TSA), eerste voeg 1 L gedeïoniseerd water in een 2-L Erlenmeyer kolf met een magnetische roerstaaf. Gebruik een kolf die ten minste twee maal groter is dan het volume. Voeg 30 g tryptische soja bouillon poeder en 20 g agar korrels in de kolf.
   LET OP: Gebruik 2% agar in plaats van 1,5% tot zwermende van een aantal Vibrio spp beperken.
   1. Meng goed door het inschakelen van de roerder. Onder roeren, zet de warmte aan het mengsel koken. Verwijder de kolf uit de kachel zodra het mengsel begint te koken. Losjes dekken the kolf met een aluminiumfolie. Tape de folie om het vast te zetten aan de kolf vóór autoclaaf.
   2. Om tryptische soja bouillon (TSB) te maken, laat de agar van het recept in stap 1.1.
      LET OP: Het gebruik van mei flessen in plaats van Erlenmeyer.
   3. Om tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% natriumchloride of NaCl (TSA), voeg 20 g NaCl in het mengsel vóór het roeren en verwarmen. Om tryptische soja bouillon aangevuld met 2% NaCl (TSBS) te maken, laat de agar, voeg 20 g NaCl in het mengsel voorafgaand aan het roeren en verwarmen.
2. Om de hersenen het hart infusie (BHI) agar te maken, op te schorten 37 g BHI poeder en 15 g agar korrels in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie om het poeder op te lossen. Autoclaaf. Laat de agar om BHI bouillon te maken.
3. Om TCBS agar te maken, op te schorten 89 g van het TCBS poeder in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie en kook gedurende 1 minuut om volledig op te lossen het poeder. Niet in een autoclaaf.
4. Voor alle agar media, koelen van de hete agar naar 45-50 ° C in een waterbad. Schik lege Petri platen in stapels van 5-6 platen. Vanaf de bodem van de stapel, giet het gesmolten agar in elk Petri plaat halfvol bereiken. Sluit de Petri plaat deksel na het gieten. Laat de agar te stollen door te laten de platen zitten bij kamertemperatuur.
   1. Gebruik de agarplaten de volgende dag of na 12 uur. Bewaar ongebruikte platen in de koelkast voor maximaal twee weken. Verwijder voor gebruik platen uit de koelkast en equilibreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
      LET OP: One-liter agar maakt ~ 45 agarplaten. Laat de agarplaten voldoende drogen op de dag van bereiding en evenwicht ze op kamertemperatuur na koude opslag effectief de verspreiding van de kolonies.
5. Verkrijgen chocolade en chromogene agarplaten en equilibreren bij kamertemperatuur vóór elk experiment.
6. Subcultuur alle 54 microbiële stammen weergegeven in tabel 1 elk paar days.
   1. Gebruik een steriele entnaald om culturen te brengen van een bevroren voorraad of een vorige partij om niet-selectieve media zoals BHI, TSB / TSA of chocolade agar. Grow halophilic Vibrio spp. op TSBS / TSA.
   2. Om de zuiverheid van de kweek controleren, strook alle stammen in een patroon die het mogelijk maken voor waarneming van geïsoleerde kolonies. Gebruik bijvoorbeeld driefase strepen patroon een grote hoeveelheid bacteriën verdunnen tot kleinere hoeveelheid, hetgeen uiteindelijk geïsoleerde kolonies.
7. Incubeer de platen omgekeerd bij 35-37 ° C gedurende maximaal 48 uur. Voor Campylobacter spp., Incubeer buizen of platen in een gesloten deksel pot met daarin een gas hoes om een ​​Microaërofiele omgeving te produceren. Observeer kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen.
   OPMERKING: Incubeer alle platen ondersteboven te voorkomen gecondenseerde waterdruppels gevormd aan de onderzijde van het deksel valt op de colOnies.

2. Soort Vaststelling door PCR

1. Gedrag tlh -PCR om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus stammen. Gebruik primers TLH -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') en tlh -R (5 'GCT ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3') om een 450-bp fragment van de thermolabiele hemolysine gen ²⁰ amplificeren .
   1. Gebruik een steriele entnaald om een paar geïsoleerde kolonies van elk V. overdragen parahaemolyticus stam van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
   2. Centrifugeer kweken bij 14.000 xg gedurende 1 min. Verwijder supernatant en was de pellet tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Kook de suspensie gedurende 3 min cellysaat verkregen.
      LET OP: V. parahaemolyticus is gemakkelijk te worden gelyseerd. Daarom lysis reagens is niet vereist. Het is ook mogelijk een beetje kolonie rechtstreeks gebruikt als de template.
   3. Voer PCR in een 25-ul reactie volume. Bereid een reactiemengsel dat een uiteindelijke concentratie van 1x PCR-buffer, 1,5 mM _MgCl2, 100 uM van elk dNTP, 1 uM van elke primer, 1 U Taq-polymerase en 1 pl cellysaat. Na voorincubatie bij 94 ° C gedurende 5 min, run 35 amplificatie cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 58 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 60 sec ^21.
   4. Belasting aliquots van 5 pl amplicon in 1,5% agarosegels. Schakel de stroomtoevoer naar elektroforese starten. Visualiseren de aanwezigheid of afwezigheid van amplicons onder UV-belichting na ethidiumbromide kleuring.

3. Groei op Selectief en Differential Media

1. Twee tot vier dagen voor het experiment, streep bacteriële stammen weergegeven in Tabel 1 op niet-selectief medium (TSA, of chocolade BHI agar) voor colony isoleren. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende 48 uur. Controleer de zuiverheid van de kweken door het observeren kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen.
2. Transfer enkele geïsoleerde kolonies van Stap 3,1 tot 5 ml bouillon. Incubeer buizen bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
   OPMERKING: Gebruik de jonge kolonies, die minder dan vier dagen oud zijn, om 's nachts culturen bereiden in alle experimenten.
3. Streak een lus vol van 's nachts culturen op selectieve en differentiële media (TCBS en chromogene agar) voor kolonie isolement. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur.
4. Noteer de globale groei van alle stammen van onderzoeken zowel de kweekdichtheid op de plaat en de afmeting van geïsoleerde kolonies. Noteer de kleur van kolonies onder omgevings- en / of UV-licht. Let op andere kenmerken van geïsoleerde kolonie zoals de verheffing, marge en vorm.

4. Recovery Assay

1. Selecteer een representatieve deelverzameling V. parahaemolyticus stammen (n = 14) die verschillende serotypen en de oorsprong van isolatie omvatten ^{22. Inoculeer jonge culturen van de platen in 5 ml TSBS. Incubeer de buizen bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.}
2. Voer een Standaardkiemgetal werkwijze volgens de overnachtcultures zoals hieronder beschreven.
   1. Vortex aan de 's nachts culturen meng goed. Voeg een 10-voudig of 10 ^-1 verdunning door overdracht 100 pl van de kweek gedurende de nacht in een buis met 900 ui PBS. Vortex goed te mengen.
   2. Gebruik een nieuwe pipet tip om 100 ul te brengen van de 10 ^-1 verdunning buis naar een andere buis met 900 ul PBS. Vortex goed te mengen. Dit vormt 10 ^-2 verdunning. Herhaal de werkwijze sequentieel 10 ^-7 verdunning te verkrijgen.
   3. Met de 10 ^-4 tot 10 ^-7 verdunningsbuizen, plaat 100 ul elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten.
      LET OP: De verdunningsfactor (DF) op de plaat wordt 10 ^-5 tot 10 ^-8, respectievelijk.
   4. Verdeel de porties gelijkmatig over thij agar oppervlak.
      Opmerking: Het is goed om hetzelfde spreider per stam op hetzelfde medium, zolang het meest verdunde monster eerst verspreid (dwz van 10 tot ^-8 10 ^-5). Doe hetzelfde strooier voor verschillende media niet gebruiken.
   5. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur. Rekenen kolonies op de platen. Negeren platen waarop kolonies die te talrijk om te tellen (tntc) of minder dan 25. Bereken CFU / ml volgens de volgende zijn:
      
      Waar
      N = het aantal cellen in de onverdunde buis, uitgedrukt in CFU / ml of CFU / g
      C = het totale aantal getelde kolonies op platen die 25-300 kolonies dragen
      n ₁ = het nummer van de plaat (en) waar geteld kolonies zijn afkomstig uit de lagere df
      _n2 = het aantal platen (en) waar kolonies geteld vanaf de volgende 10-voudige verdunning
      df = de onderste verdunningsfactor (dat wil zeggen, meer geconcentreerd verdunning)
3. Vergelijk CFU / ml tussen verschillende media. Gebruik CFU / ml op TSA als 100%, het berekenen van de% terugwinning van V. parahaemolyticus geteeld op de chromogene en TCBS agar.

5. Mededinging Assay

1. Kies een subset van stammen die verschillende kolonie morfologie op de chromogene en TCBS agar vertonen.
   LET OP: Op deze manier zal het mogelijk zijn om te tellen kolonies ontstaan uit V. Alleen parahaemolyticus, ondanks de aanwezigheid van andere soorten in het inoculum.
   1. Kies een V. parahaemolyticus stam die de verwachte turquoise en cyaan kolonies op TCBS en de chromogene agar oplevert, respectievelijk.
   2. Kies een niet-V. parahaemolyticus en Vibrio niet die niet groeien op een van deze media, of verschillende koloniekleur.
      LET OP: Bijvoorbeeld, V. metschnikovii groeit zeer zwak on TCBS en niet groeien op het chromogene agar. Shigella sonnei groeit niet op TCBS maar levert magenta kolonies op de chromogene agar.
2. Na de selectie van de stammen bovenstaande, voor te bereiden 's nachts bouillon culturen met behulp van geïsoleerde kolonies gegroeid op niet-selectieve media.
   1. Maak 's nachts culturen van V. parahaemolyticus en V. metschnikovii door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
   2. Maak 's nachts culturen van Shigella sonnei door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van BHI agar tot 5 ml BHI bouillon. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur.
3. Voor elke stam, het uitvoeren van een verdunningsreeks vergelijkbaar met Steps 4.2.1 en 4.2.2. Plaat geschikte verdunningen op BHI TSA of CFU / ml van de overnacht kweek vast te stellen volgens de vergelijking uit stap 4.2.5.
   OPMERKING: Typisch 100 gl van 10 tot 10 ^{-5 -7} verdunningbuizen werkt voor de meeste culturen. Gebruik de CFU / ml waarden om een ​​back-het berekenen van de precieze hoeveelheid cellen die worden gebruikt in de volgende stap. De berekende CFU / ml waarden verkregen na incubatie, hoewel de volgende stappen uitgevoerd op dezelfde datum als Stap 5,3.
4. Met behulp van de 's nachts culturen en verdunning buizen in de stappen 5.2 en 5.3, combinaties van verschillende hoeveelheden van een V. parahaemolyticus stam en een niet-V. parahaemolyticus soorten. Bijvoorbeeld, meng 500 pi van de 10 ^-5 verdunning tube V. parahaemolyticus met 500 ul van de 's nachts culturen van V. metschnikovii.
   NB: Dit mengsel simuleert hoge microflora achtergrond. Om een lage microflora achtergrond simuleren, meng 500 pi elk van de 10 ^-5 verwatering tube van beide soorten.
5. Spread 100 pi van het mengsel elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten.
6. Na incubatie bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur, tellen kolonies V. parahaemolyticus en de niet V. parahaemolyticus species op basis van hun verschil in groei en koloniemorfologie de chromogene en TCBS agar.
   OPMERKING: Indien bijvoorbeeld de niet V. parahaemolyticus soort groeit niet aan de chromogene en TCBS agar, alle kolonies zullen van V. zijn parahaemolyticus. Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit op beide media, wordt alleen de turquoise kolonies op TCBS en cyaan kolonies op chromogene agar van V. zijn parahaemolyticus. De niet V. parahaemolyticus soorten al dan niet vertonen vergelijkbare kolonie morfologie V. parahaemolyticus op TSA.
   1. Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit eveneens V. parahaemolyticus op deze niet-selectief medium, verdeel het kiemgetal door twee nummers voor het verkrijgen van V. parahaemolyticus alleen. Vergelijk de werkelijke kiemgetal met de verwachte telling afgeleid van stap 5.3.

6. Effects van Oyster Homogenaten

1. Weeg ≥50 g oester vlees van ≥12 weekdieren inclusief vlees en drank.
   1. Voeg gelijke hoeveelheid van PBS om de oester vlees en drank. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 90 seconden. Dit vormt 2 ^-1 verdund oester homogenaat.
   2. Voeg 100 g 2 ^-1 verdund oester homogenaat tot 400 g PBS. Gebruik een schaal om het gewicht, niet volume te meten. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 1 minuut. Autoclaaf de oester homogenaat.
      LET OP: Dit zal de oester homogenaat gebruikt voor spiking zijn.
2. Herhaal de Recovery test (Stap 4) in de aanwezigheid van oester homogenaat.
   1. Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van V. parahaemolyticus overnacht culturen gekweekt in TSBS aan. Bepaal het werkelijke bedrag van V. parahaemolyticus cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures in Stap 4.2.
3. Repeet de competitie assay (Stap 5) in aanwezigheid van oester homogenaat.
   1. Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van elk van 's nachts culturen van V. parahaemolyticus en niet- V. parahaemolyticus aan. Bepaal het werkelijke bedrag van de bacteriële cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures beschreven in stap 4.2
4. Meng de bacteriële cellen met oester homogenaat goed met behulp van een homogenisator.
   LET OP: Na het mengen van de oester homogenaat met het opzettelijk toegevoegde cellen heet spiked oester homogenaat.
5. Maak verdunningen van het verrijkte oester homogenaat 10 ^-1 tot 10 ^-3 verdunningsbuizen verkrijgen volgens de in stap 4.2.2 beschreven procedures. Spread 100 pi van elke verdunning op de chromogene, TCBS en TSA agar. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur.
6. Vergelijk de werkelijke kiemgetal op chromogene en TCBS agar met de exwachte kiemgetal afgeleid uit stappen 6.2.1 en 6.3.1.
   OPMERKING: Indien bijvoorbeeld een buis van V. parahaemolyticus nachtkweek bevat 10 ⁸ CFU / ml, een inoculum van 100 gl betekent dat 10 ⁷ cellen worden toegevoegd aan de 500-g oester homogenaat, waarbij 5 x 10 ⁴ cellen / g. Na verdunning en plating, de plaat met df = 10 ^-2 moet 500 kolonies opleveren; terwijl dat het hebben van df = 10 ^-3 moet 50 kolonies opleveren. Dit zijn de verwachte kolonietellingen.

Results

In deze studie werden 54 microbiële stammen samengesteld die 22 -stammen in de V. parahaemolyticus species, 19 andere Vibrio en 13 niet Vibrio soorten (Tabel 1). De meeste V. parahaemolyticus stammen werden ofwel ontvangen van de FDA, CDC of andere openbare gezondheidszorg afdelingen. Zij vertegenwoordigen verschillende serotypes en isolatie bronnen. Deze stammen werden eerder geïdentificeerd door de regelgevende instanties. We bevesti...

Discussion

Dit onderzoek richt zich op de ontwikkeling en evaluatie van de cultuur media. Conventioneel TCBS is het selectief en differentieel medium voor de isolatie en het detecteren V. parahaemolyticus, V. cholerae en V. vulnificus ^12. Echter zijn beperkingen gerapporteerd voor dit medium, zoals het onvermogen om onderscheid V. cholerae uit andere Vibrio. Sucrose en pH-indicator zijn de differentiatie agenten van TCBS. Aldus zuurproductie sucrose fermentor veroorzaakt kleurverander...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagens/Apparatuur
Agar	Fisher Scientific	DF0140-15-4	mag andere merken gebruiken
Autoclaaf	Elk
BHI poeder	Fisher Scientific	DF0418-17-7	mag andere merken gebruiken
Blender	Elk		om oester vlees te mengen
CampyGen gasgenerator	Hardy Diagnostics	CN035A	om een microaerofiele atmosfeer te bieden; mag andere merken gebruiken
Chocolate agar platen	Hardy Diagnostics	E14	mag andere merken gebruiken
Gebruikelijke PCR reagentia (dNTP's, MgCl2, Taq Polymerase)	Elk		of gebruik PCR kralen (Fisher Sci 46-001-014)
Kweekbuisjes	Fisher Scientific	S50712	mag andere merken gebruiken
Eppendorf buisjes	Fisher Scientific	S348903	mag andere merken gebruiken
Gel doc	Elk
HardyChrom Vibrio agar platen	Hardy Diagnostics	G319	Deze studie evalueert dit medium
Incubator	Elk
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-606	10 microliter-grootte werd gebruikt in deze studie
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212	mag andere merken gebruiken
Oesters	Elk
PBS	Fisher Scientific	R23701	mag andere merken gebruiken
Petrischaal	Fisher Scientific	FB0875713	mag andere merken gebruiken
Pipet en tips	Elk		Gesteriliseerde tips
Primers voor tlh	IDT DNA
Schaal	Elk
Spreader	Fisher Scientific	08-100-11	Kralen kunnen in plaats daarvan worden gebruikt
Stomacher blender	Stomacher	400	Steekproeven werden gehomogeniseerd bij 200 rpm gedurende 30 sec. Andere homogenisator kan worden gebruikt.
Steriele filterzakken voor blenders	Fisher Scientific	01-812-5
TCBS poeder	Hardy Diagnostics	265020	Deze studie evalueert dit medium
Thermocycler	Elk
TSB poeder	Fisher Scientific	DF0370-07-5	mag andere merken gebruiken
UV-bezichtigingskast	Elk		Zend langgolf UV-licht uit
Waterbad	Elk
Naam	Bronnen	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacteriesoorten en stammen
Aeromonas hydrophila	ATCC
Candida albicans	ATCC
Campylobacter jejuni	ATCC
Escherichia coli	ATCC
Proteus mirabilis	ATCC
Pseudomonas aeruginosa	ATCC
Staphylococcus aureus	ATCC
Salmonella Choleraesuis	ATCC
Shigella boydii	ATCC
Shigella flexneri	ATCC
Shigella sonnei	ATCC
Vibrio alginolyticus	ATCC
V. cholerae (serotypes omvatten O139, O1, niet O1, El Tor biovars)	FDA, ATCC
V. damsela	FDA
V. fisheri	Omgeving
V. fluvialis	CDC
V. furnissii	CDC
V. hollisae	FDA
V. metschnikovii	ATCC
V. mimicus	FDA
V. parahaemolyticus (serotypes omvatten O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)	ATCC, FDA, CDC, Omgeving
V. proteolyticus	FDA
V. vulnificus	FDA