Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat

14.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54497

⸱

28 september 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en het gebruik van buffers voor de kwantitatieve meting van de snelheid van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde werkende rattenhart. De methoden die worden gebruikt voor monsteranalyse en gegevensinterpretatie worden ook besproken.

Samenvatting

Het zoogdierhart worden grote hoeveelheden van ATP en vereist een constante toevoer van energie substraten voor contractie. Niet verrassend, hebben veranderingen van myocardiale metabolisme gekoppeld aan de ontwikkeling van contractiele dysfunctie en hartfalen. Daarom is het ontrafelen van het verband tussen de stofwisseling en krimp moet licht werpen op een aantal van de mechanismen die cardiale aanpassing of maladaptatie bij de ziekte van staten. De geïsoleerde werkende rattehart preparaat kan worden gebruikt om te volgen, gelijktijdig en in real time, contractiele functie en de stroom van energie verschaffen substraten in oxidatieve metabole routes. De onderhavige protocol beoogt een gedetailleerde beschrijving van de bij de bereiding en het gebruik van buffers voor de kwantitatieve meting van de snelheden van oxidatie van glucose en vetzuren, de belangrijkste energiebron verschaffen substraten van het hart werkwijzen. De voor monsteranalyse en data interpretatiemethodes worden besproken.In het kort, is de techniek waarbij de levering van 14 C- radiolabeled glucose en 3 H- radiolabeled lange keten vetzuur een ex vivo kloppend hart via normotherme kristalloïde perfusie. 14 CO 2 en 3 H 2 O, einde van bijproducten de enzymatische reacties die betrokken zijn bij het gebruik van deze energie leveren substraten, worden vervolgens kwantitatief teruggewonnen uit de coronaire effluent. Met kennis van de specifieke activiteit van het radioactief gemerkte substraten gebruikt, is het dan mogelijk om afzonderlijk kwantificeren de flux van glucose en vetzuur in de oxidatie trajecten. Contractiele functie van het geïsoleerde hart kan worden bepaald in overeenstemming met de desbetreffende controleapparaat en is rechtstreeks gecorreleerd met metabole flux waarden. De techniek is bijzonder nuttig voor het metabolisme / contractie verhouding naar aanleiding van verschillende stress-omstandigheden te bestuderen zoals veranderingen in voor en na belasting en ischemie, een geneesmiddel of een omloopting factor of na de verandering van de expressie van een genproduct.

Inleiding

klinische relevantie

In het zoogdierhart, is er een sterk positief verband tussen de flux van substraten door middel van oxidatieve metabolische wegen, ATP productie en cardiale 1. In de afgelopen twee decennia is het onderzoek van de ingewikkelde relatie tussen de cardiale metabolisme en functie leidde om te erkennen dat veranderingen in cardiale metabolisme zijn een reden tot contractiele dysfunctie en mogelijk pathologische structurele remodeling in de setting van verschillende vormen van hart-en vaatziekten 2-4. daarom wordt verwacht dat ons begrip van de mechanismen die metabolische remodellering van de stressed hart zal leiden tot de identificatie van therapeutische doelen voor het voorkomen of behandelen van hartfalen 5-7. De recente publicatie van een wetenschappelijke verklaring van de American Heart Association over "Het beoordelen van Cardiac Metabolism", benadrukt de groeiende belangstelling van de wetenschappelijke gemeenschap voor tZijn onderzoeksgebied 8. Maar terwijl de technologische vooruitgang in cardiale beeldvorming nu die een snelle en nauwkeurige evaluatie van cardiale morfologie en functie, de in vivo cardiaal metabolisme blijft beperkt en omslachtig: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie en Positron Emissie Tomografie (PET) beeldvorming kan worden gebruikt voor cardiale adenosinetrifosfaat metabolisme en Krebs cyclus activiteit volgen, maar deze technieken worden geplaagd door hoge exploitatiekosten en hun onvermogen om de bijdrage van verschillende substraten voor oxidatieve metabolisme in evenwichtstoestand 9 .Om dit tijdstip het ex vivo bepalen werkend hart voorbereiding vertegenwoordigt de enige en unieke techniek beschikbaar om te studeren, gelijktijdig en in real time, contractiele functie en de flux van substraten in oxidatieve metabole routes 7,9. Het volgende protocol is bedoeld om richtlijnen bij de voorbereiding en het gebruik van de reagentia gebruikt om de ratten te kunnen bepalenes substraten benutting in het geïsoleerde werkende rat hart.

De geïsoleerde Working Knaagdieren Heart Apparatus

Hoewel de techniek is bijna een halve eeuw oud, het geïsoleerde werkende rat hart voorbereiding blijft een methode van de keuze voor cardiovasculair onderzoek. Zoals met de Langendorff hartsvoorbereiding, de werkende hart knaagdier biedt een relatief eenvoudige, betrouwbare en goedkope manier om een ​​breed scala van cardiale parameters onafhankelijk meten van de verstorende effecten van andere organen, neurohormonale en andere circulerende factoren. Maar in tegenstelling tot de Langendorff-geperfuseerde hart de werkende hart blijft nagenoeg fysiologische cardiale, een voorwaarde voor de vorming van oxidatieve metabole flux tot een niveau dat in vivo omstandigheden relevant zijn uitgevoerd. Dit wordt bereikt door het leveren van de perfusie buffer naar de linker ventrikel (LV) via een canule verbonden met het linker atrium, en de LV vult en contracten,buffer wordt uitgestoten door de aorta lijn tegen een bepaalde afterload hydrostatische druk. Het ontwerp van de perfusie apparaat oorspronkelijk beschreven door Neely en collega's 10 werd vervolgens verbeterd door Taegtmeyer, Hems en Krebs 11, maar is sindsdien weinig veranderd. Zoals beschreven in de oorspronkelijke inrichting, contractiele functie kan worden beoordeeld aan de bepaling van hartminuutvolume behulp maximaal maatcilinders en een stopwatch meten aorta en coronaire stromen 10,11. Verschillende leveranciers bieden nu compleet werkend knaagdier hart perfusie systemen. Deze commercieel verkrijgbare apparaat kan met flowprobes, druk transducers, een druk-volume katheter en al het nodige voor cardiale functionele data-acquisitie en analyse-apparatuur worden aangeschaft. De leveranciers bieden uitgebreide documentatie en trainingen aan de nieuwe gebruiker met hun apparatuur vertrouwd te maken. Diverse overzichtsartikelen ook detail protocollen op de werkende hart instrumentatie en het gebruik van katheters hartfunctie bij knaagdieren 12-15 te meten. Om deze reden zullen wij slechts kort melding van de set-up van de perfusie apparaat en het controleapparaat. Dit protocol plaats beoogt de reeds beschikbare informatie te vullen met een beschrijving van de methoden die kunnen worden toegepast om gelijktijdig de snelheden van glucose en lange-keten vetzuur oxidatie, de twee belangrijkste energie verschaffen substraten in het normale hart. We beschrijven hier alle stappen bij het gebruik van radioactief gemerkte energiesubstraten voor het meten van myocard oxidatieve metabolisme, van de bereiding van reagentia en buffers voor het ophalen en verwerken van monsters voor de gegevensanalyse.

Principes van de methode

Cardiomyocyten het vaakst worden hun energie voor contractie van de oxidatieve fosforylering van vetzuren (hoofdzakelijk langketenige vetzuren) en koolhydraten (glucose en lactaat). Het hart heeft zeer beperkte energetische reserves en voert een constante toevoer van deze energie verschaffen substraten uit de circulatie. De afbraak van glucose door de glycolytische weg pyruvaat oplevert dat vervolgens wordt gedecarboxyleerd door het pyruvaat dehydrogenase complex van de binnenste mitochondriale membraan. Lange-keten vetzuren, geëxtraheerd uit circulerende lipoproteïnen albumine of triglyceriden, worden eerst geactiveerd in acyl-CoA moleculen in het cytosol en vervolgens in de mitochondriale matrix getransporteerd door de carnitine shuttle naar de beta-oxidatie route voeren. Acetyl-CoA moleculen geproduceerd door de afbraak van glucose en vetzuren brandstof de Krebs cyclus de reducerende equivalenten (NADH en FADH 2) die worden gebruikt door de elektron transport keten de proton-motive force in het binnenste mitochondriale membraan bouwen genereren en genereren van ATP door de activiteit van de ATP synthase. Water en kooldioxide eind van bijproductende enzymatische reacties die plaatsvinden in de Krebs cyclus. De toevoer van 14 C- en 3H-radioactief gelabelde substraten (zoals 14 C-radioactief gemerkt glucose en 3H-radioactief gemerkt oliezuur) aan de geïsoleerde werkende hart zal derhalve leiden tot de productie van 14 CO 2 en 3 H 2 O die kan kwantitatief worden teruggewonnen uit de coronaire effluent. De collectie van 14 CO 2 wordt uitgevoerd door het bijhouden van de geïsoleerde doorbloed hart in een afgesloten kamer en door onmiddellijk te herstellen van de coronaire effluent zodra ze uit het hart uitgevoerd. Een kleine anionenuitwisselingskolom wordt gebruikt te scheiden en terug 3 H 2 O van de coronaire effluent. De radioactiviteit van de verwerkte monsters wordt gemeten met een vloeistofscintillatieteller, en met kennis van de specifieke activiteit van het radioactief gemerkte substraten gebruikt, is het dan mogelijk om afzonderlijk kwantificeren de flux van glucose en vetzuur in hetoxidatie trajecten 16,17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de NIH Public Health Service, over het Human Care en het gebruik van dieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Mississippi Medical Center. Alle procedures die het gebruik van radio-isotopen werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de door de veiligheid straling kantoor van de Universiteit van Mississippi Medical Center te stellen richtlijnen.

1. Bereiding van Stock Buffer Solutions en reagentia

  1. Krebs-Henseleit (KH) buffervoorraad Solutions
    1. Bereid 2 L van een 20x geconcentreerde zout stock oplossing die (in mol / l) 2,37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, en 0,0236 MgSO4 * 7H 2 O. Filter op een 0,45 pm poriegrootte filtratie-eenheid en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 maand.
    2. Bereid 2 L van een 20x geconcentreerde (0,5 mol / l) oplossing van NaHCO3. De oplossing kan wordenbij kamertemperatuur bewaard voor onbepaalde tijd.
    3. Bereid 250 ml van een 1 mol / l stockoplossing van CaCl2. Filter op een 0,45 pm poriegrootte filtratie-eenheid en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 maand.
  2. Omzetting van anionenuitwisselingshars van Chloride Formulier om hydroxydevorm
    1. Was de anionenuitwisselingshars door resuspenderen in 1 L ultrapuur water. Laat het hars bezinken en giet het overtollige water. Herhaal deze stap nog 4 keer.
    2. Giet de hars in een glazen microanalyse vacuüm filterhouder gemonteerd op een filtering kolf.
    3. Zetten de hars om de hydroxidevorm door langzaam passeren 22 volumes van 1 N NaOH. Meng de slurry met tussenpozen met een roestvrij stalen spatel.
    4. Was de hars met ultrazuiver water totdat de pH lager is dan 9,0. Controleer de pH geregeld door dompelen een pH teststrip nabij het oppervlak van de hars slurry. Dek af en bewaar de hars met ultrapuur water in een borosilicate glazen fles en bescherming tegen licht. Sta niet toe dat de hars te drogen voor gebruik.
      NB: Bij een juiste opgeslagen, zal de hars ten minste 3 maanden duren.
  3. Oliezuur-albumine 8x Geconcentreerd Stock Solution
    1. In een 4 L erlenmeyer, meng 200 ml van het 20x geconcentreerde zout stock-oplossing en 200 ml van het 20x geconcentreerde NaHCO3 oplossing met een 3.6 L ultrapuur water.
    2. Met behulp van een gasdispersiebuis met een gefritte cilinder gas de oplossing gedurende 15 min met een mengsel van kooldioxide 5% zuurstof en 95% om de pH te stabiliseren.
    3. Schenk 470 ml buffer in een 1 liter glazen beker. Voeg 8,75 ml van 1 mol / l CaCl2 stockoplossing aan de 3530 ml achterblijft in de 4 L erlenmeyer buffer en vernietiging.
    4. Voeg 40 g vetzuur-vrij BSA tot 1 L bekerglas en roer met een roerstaaf totdat het is opgelost.
    5. In een 15 ml conische buis, bereiden 4 ml van een 50% (v: v) ethanol in ultrazuiver water. Voeg 487 mg sodium oleaat en vortex totdat het poeder volledig is opgelost.
      OPMERKING: Sommige onderzoekers gebruiken palmitinezuur in plaats van oliezuur in de perfusie buffer. Een palmitinezuur albumine voorraadoplossing worden bereid volgens dezelfde procedure. Het wordt echter aanbevolen om de oplossing bij 70 ° C verwarmd tot volledige oplossing toe natriumpalmitaat bereiken.
    6. Voeg de oleaat oplossing druppelsgewijs aan het vetzuur-BSA oplossing onder constant roeren en wacht 10 minuten voor het oliezuur-BSA-complex te vormen.
      NB: De oplossing moet een lichtgele kleur hebben en zonder zichtbare deeltjes. Aanwezigheid van een neerslag of onoplosbare deeltjes incomplete conjugatie van het vetzuur BSA geven. Als dit gebeurt, moet de oplossing worden weggegooid en het proces begon opnieuw.
      OPMERKING: palmitaat neerslaat indien Men laat een pipet en kan druppelsgewijze worden toegevoegd. De geroerde oplossing van BSA kan worden opgewarmd tot 37 ° C te vergemakkelijken binding palmitinezuur. Niet oververhitten omdat dit kan denaturatie en aggregatie van BSA veroorzaken.
      LET OP: De volgende stappen van dit protocol te betrekken het manipuleren van radioactief materiaal. Draag de juiste beschermingsmiddelen en volg de veiligheid en afvalverwijdering regelgeving door de stralingsveiligheid het kantoor van de instelling in te stellen.
    7. Voeg 160 gl (0,8 mCi) [9,10 3H] oliezuur aan het geroerde oplossing van oliezuur-BSA en roer nog eens 10 minuten.
    8. Voeg 2,5 ml van 1 mol / l CaCl2 stockoplossing aan de geroerde oplossing van oliezuur-BSA.
    9. Snijd ongeveer 1,2 m dialysemembraan slang en spoel zowel binnen als buiten met kraanwater. Schrob de dialyse tubing krachtig onder de kraan water gedurende 10 tot 15 minuten van het glycerol coating van het membraan te verwijderen. Alternatief, verwijder de bekleding door het weken de dialyseslang in warm water gedurende 1 uur vóór gebruik. Finish door het spoelen van de dialyse buis met ultrapuur water.
    10. Veilig afhechten ene uiteinde van de dialysebuizen. Vul met het oliezuur-BSA-oplossing en afhechten het andere uiteinde van de dialysebuizen.
    11. Plaats de gevulde dialyse slang in de 4 L erlenmeyer van KH buffer en laat dialyseren overnacht bij 4 ° C onder voorzichtig roeren met een roerstaafje.
    12. De volgende dag, verwijder de 8x geconcentreerd oliezuur-BSA oplossing uit de dialysebuizen. Gebruik het oliezuur-BSA oplossing onmiddellijk voor perfusie of hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. Bevroren aliquots zijn stabiel gedurende tenminste 2 maanden. Vermijd meervoudige vries-dooicycli omdat dit de oplosbaarheid van het oliezuur BSA-complex kan compromitteren.
      OPMERKING: Gebruik alleen ultrapuur water (weerstand van 18,2 MΩ.cm bij 25 ºC, totaal organische koolstof <10 ppb, micro-organismen ≤ 1 CFU / ml, deeltjes met een grootte van meer dan 0,22 pm ≤1 / ml) aan de reagentia en buffers te bereiden gebruikt voor hart perfusie. Omzetting van de anion uitwisselingshars van het chloridem aan de hydroxide vorm kan worden vermeden door directe aankoop van de hydroxide vorm tegen extra kosten (zie Materials tabel). Naast oleaat of palmitaat, kan elk ander type van natuurlijk voorkomende vetzuren worden gebruikt, zolang een getritieerd versie van het vetzuur beschikbaar zijn oxidatie volgen.

2. Bereiding van de perfusiebuffer

  1. In een 4 L erlenmeyer, meng 200 ml van het 20x geconcentreerde zout stock-oplossing en 200 ml van het 20x geconcentreerde NaHCO3 oplossing met een 3.6 L ultrapuur water. Gas de oplossing gedurende 15 min met een mengsel van kooldioxide 5% zuurstof en 95%, en voeg 10 ml van 1 mol / l CaCl2 stockoplossing aan de concentratie van vrij Ca2 + vastgesteld op 2,5 mmol / l.
    LET OP: De volgende stappen omvatten het manipuleren van radioactief materiaal. Draag de juiste beschermingsmiddelen en volg de veiligheid en afvalverwijdering regelgeving door de ra van de instelling ingesteldmediatie veiligheid kantoor.
  2. Transfer 1.750 L KH buffer tot een 2 L borosilicaat glazen fles. Voeg 250 ml van de geconcentreerde 8x oliezuur-BSA-oplossing, 1,802 g D-glucose, 400 gl insuline 0,4 U / ml en 200 ui (0,2 mCi) [U- 14C] glucose. Omkeren fles te mengen. Dit 2 L volledige perfusie buffer bevattende oliezuur (0,4 mmol / l), D-glucose (5 mmol / l) en insuline (40 micro-eenheden / ml) werd verkregen.
    OPMERKING: Een volume van 2 L is voldoende om een ​​werkende volwassene rat hart in niet-recirculerende omstandigheden perfuseren minstens 60 min.
  3. Gebruik enkele niet-radioactieve KH buffer twee dissectie gerechten vullen en plaats op ijs te koelen.

3. Bereiding van de perfusie Apparatus

OPMERKING: De onderzoeker kan kiezen om een op maat gemaakte perfusie inrichting te gebruiken, zoals die beschreven door Taegtmeyer, zomen en Krebs 11, of één van de commercieel beschikbare systemen. Perfusie systemen gewoonlijk uit deelementen in Figuur 1 hieronder beschreven. Naast de buizen en glaswerk, de rest van het controleapparaat is optioneel en het gebruik ervan zal afhangen van de behoeften van de onderzoeker de experimentele vraag in te worden gesteld. Toch raden we het gebruik van zuurstof micro-elektroden op de O 2 -concentratie in de buffer binnenkomst te bepalen en het verlaten van de coronaire circulatie (figuur 1). Dit zal helpen de onderzoeker controle die het hart wordt geleverd met een geschikte hoeveelheid zuurstof, en dat de zuurstoftoevoer niet varieert tussen experimenten. Bovendien kan de bepaling van de "arterioveneuze" zuurstofverschil worden gebruikt om myocardiale zuurstofconsumptie en hartwerking 16,18 berekenen.

  1. Zet de circulerende waterbad ingesteld op 37 ° C op te warmen de perfusie apparaat.
  2. Zet de computer en de data-acquisitie systeem dat zalworden gebruikt om de hartfunctie te meten.
  3. Sluit de opnameapparaten (drukkatheter, druk-volume katheter, zuurstof microelectrodes, flowmeters, enzovoort) voor het meetsysteem en kalibratie uitvoeren van de instrumenten volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Vul het bufferreservoir met ultrapuur water. Schakel de peristaltische pomp en het spoelen van het water door de buizen en glaswerk om het systeem te spoelen. Schakel de peristaltische pomp en zorg ervoor dat er geen water blijft in de slang en / of glaswerk, omdat dit de concentratie van de perfusie buffer en het hart voorbereiding beïnvloeden.
  5. Sluit een nieuwe 1,0 urn glasvezelfilter het systeem. Sluit de gastank die een mengsel van kooldioxide 5% zuurstof en 95% aan de zuurstofplant kamer.
    LET OP: De volgende stappen omvatten het manipuleren van radioactief materiaal. Draag de juiste beschermingsmiddelen en volg de veiligheid en afvalverwijdering regelgeving door de instelling vastgestelde'S straling veiligheid kantoor.
  6. Vul het bufferreservoir met perfusiebuffer. Schakel de pomp en waarborgen vullen van alle buizen en glaswerk met de perfusie buffer. Voer het perfusiebuffer via perfusie inrichting de luchtcirculatie en oxygenaat ten minste 30 minuten voor gebruik.
  7. Nauw sluit de buis van een 20 ml spuit onder de hartkamer naar de coronaire effluent terug te vorderen. Sluit de punt van de spuit om de top van een driewegkraan. Sluit de zijarm een ​​3 ml spuit. Sluit de onderste arm via de slang aan op een container voor vloeibaar radioactief afval.
    OPMERKING: Bij gebruik van de vetzuur-BSA complex, zuurstofvoorziening van de perfusie buffer niet kan worden uitgevoerd door directe borrelen met een gasdispersiebuis uitgevoerd dat deze overmatig schuimen van de oplossing veroorzaken. Gebruik een membraan oxygenator (figuur 1) of een specifieke stroom zuurstofplant kamer daartoe. Het wordt sterk aangeraden om te controleren of een passend niveau of oxygenatie wordt bereikt door het plaatsen van een micro-elektrode zuurstof in het perfusiecircuit (figuur 1).

4. Rat Hart Isolatie en Canulatie

  1. Weeg rat op een schaal.
  2. Bereid een spuit met verdoving dosis van 150 mg / kg thiobutabarbital natriumzout hydraat en een tuberculine spuit van 200 USP eenheden heparine.
  3. Injecteren thiobutabarbital IP en wacht tot het dier het bewustzijn te verliezen. Andere inductiemiddelen kan zo lang worden gebruikt, omdat dit niet zal interfereren met het doel van het experiment (zie Keuze van het verdovingsmiddel in de paragraaf discussie hieronder).
  4. Controleer op passend niveau van verdoving door de bevestiging van het ontbreken van teen knijpen reflex. Zorg ervoor dat de juiste diepte van de anesthesie te handhaven om te verzekeren dat het dier geen pijn voelt tijdens de procedure.
  5. Zodra de rat is volledig bewusteloos en reageert niet op teen knijpen, zet hem op zijn rug op de operatietafel en secure ledematen met tape of pennen.
  6. Klem het abdomen vrij van haar en het uitvoeren van een middellijn incisie van de buik. Heeft de borstholte nog niet open op dit punt. Beweeg de maag en darm opzij om de inferior vena cava onthullen. Injecteer de heparine direct in de inferior vena cava en wacht 5 tot 10 seconden alvorens.
  7. Gebruik schaar knippen het membraan en de wand van de ribbenkast tot de inhoud van de borstholte bloot te leggen.
  8. Fijn samen grijpen het hart tussen de duim, wijs- en middelvinger en accijnzen zowel het hart en de longen. Snijden ter hoogte van de aorta descendens, let de aortaboog en aorta ascendens in het proces niet te beschadigen. Onmiddellijk hart en longen overbrengen naar een van de dissectie schotels gevuld met ijskoude buffer KH.
  9. Nadat het hart stopt met kloppen, over te dragen naar de tweede dissectie gerecht en afknippen elke grote stukken longweefsel bevestigd terwijl het hart ondergedompeld in ijskoud KH buffer. Snijd de afdalinging aorta recht boven de aortaboog.
    LET OP: De volgende stappen omvatten het manipuleren van radioactief materiaal. Draag de juiste beschermingsmiddelen en volg de veiligheid en afvalverwijdering regelgeving door de stralingsveiligheid het kantoor van de instelling in te stellen.
  10. Spoel de aorta lijn van de perfusie inrichting de aorta canule met warme buffer vullen en water of lucht nog in de slang kan elimineren. Laat de perfusie buffer druppelen na de aorta canule om de kans op luchtembolie tijde het hart aan de canule bevestigd minimaliseren.
  11. Met behulp van twee micro ontleden tang zorgvuldig te openen de aorta en schuif het hart omhoog op de aorta canule. Zet de aorta op de canule met een micro clip en initiëren Langendorff perfusie van het hart. Acht het hart opnieuw beginnen kloppen en verdrijven alle resterende bloed in de coronaire vasculatuur in seconden na begin van perfusie.
    Opmerking: Het is zeer belangrijk om 4 stappen uitvoeren.6 tot 4,10 zo snel mogelijk tot irreversibele ischemische schade aan het hart te voorkomen. Met ervaring, moet de hele procedure duurt tussen 1 en 2 min. Wanneer het schuiven van de aorta op de canule, wees niet naar de aortawortel passeren, omdat dit kan leiden tot myocard hypoperfusie en schade aan de aortaklep.
  12. Bind de aorta naar de aorta canule met een 3-0 zijden hechtdraad en verwijder de micro clip. Zoek de pulmonaire ader. Het kan noodzakelijk zijn de niet-hartweefsel bekleding te vinden, maar niet te veel van de niet-cardiale weefsel snijden zij dienen om het linkeratrium binden aan de canule.
  13. Spoel de linker atriale lijn van de perfusie inrichting de atriale canule met warme buffer vullen en water of lucht nog in de slang kan elimineren. Wees vooral voorzichtig om eventuele luchtbellen uit het apparaat te verwijderen om de kans op luchtembolie op het moment dat het hart is aan de canule bevestigd te minimaliseren.
  14. Met behulp van twee micro ontleden krachteeps fijn pak de opening van de longader en schuif het hart omhoog op de atriale canule. Het kan nodig zijn om het hart te verplaatsen door voorzichtig draaien van de atriale en / of aorta canule om deze stap te bereiken. In ieder geval is, ervoor te zorgen dat de procedure bij buitensporige belasting oplegt op het hart en leiden tot buigen van de aorta. Bind de linkerboezem naar het atriale canule met een 3-0 zijden hechtdraad.
  15. Open de atriale lijn en gelijktijdig de aorta lijn van de Langendorff-modus om de werkmodus. Als buffer lekt uit de linkerboezem, sluit de atriale lijn, terugschakelen de aorta lijn naar Langendorff perfusie, en het gebruik van een ander 3-0 zijden hechtdraad naar links atrium veiliger te binden aan de canule.

5. Meting van de hartfunctie en Sample Collection

OPMERKING: De bepaling van metabole fluxen de kennis van de coronaire stroom (CF) vereisen. Zoals hieronder beschreven, kan coronaire stroom waardenverkregen met het eenvoudige gebruik van een stopwatch. Daarnaast zal de meting van de aorta flow (AF) met dezelfde werkwijze de bepaling van cardiac output (CO = CF + AF), die vervolgens kunnen worden gebruikt om cardiale vermogen (CP) te berekenen als een algemene maat voor de hartfunctie door toepassing toestaan de formule CP = CO (m3 / s) * afterload (Pa). Een andere werkwijze beschikbaar voor het beoordelen van de hartfunctie voert real time meting van polsdruk met een drukomzetter (figuren 3 en 4). Hoewel optioneel, de meest nauwkeurige en gedetailleerde metingen van cardiale contractiliteit en hemodynamica, het bepalen van de linker ventriculaire systolische en diastolische functie, wordt gerealiseerd met behulp van een druk-volume (PV) conductantiecatheter. Dit hoofdstuk beschrijft in het kort de catheterisatie van het geïsoleerde hart. Extra informatie over de kalibratie van PV katheters en gegevensanalyse statistische software kan wordengevonden in de referenties 14,15.
LET OP: De volgende stappen omvatten het manipuleren van radioactief materiaal. Draag de juiste beschermingsmiddelen en volg de veiligheid en afvalverwijdering regelgeving door de stralingsveiligheid het kantoor van de instelling in te stellen.

  1. Als het experiment omvat directe meting van de LV-functie met een katheter, doorboren de LV apex met een 26 G naald en de katheter in te voeren via de punctie.
  2. Bij gebruik van een druk-volume katheter zorgvuldig plaats de katheter zodat de as is uitgelijnd met de LV langsas, waarbij het distale elektrode direct onder de aortaklep en grenzend aan de endocardgrens en de proximale elektrode net binnen de ventriculaire wand.
  3. Seal het hart in het water mantel hartkamer en bewaken cardiale functionele parameters van de data-acquisitie software. Start de opname na de baseline cardiale parameters stabiel zijn gebleven gedurende meer dan 5 minuten.
  4. Bepaal de coronaire stroom door measuring de tijd die nodig is om de 20 ml spuit buis bevestigd onder de hartkamer te vullen. Na de meting, opent u het drieweg-kraantje aan de coronaire effluent in de radioactieve container vloeibaar afval legen.
    LET OP: Flow metingen kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van een flowmeter en flowprobes.
  5. Gebruik de 3 ml spuit bevestigd aan de zijarm van de drie-weg kraan om te herstellen ~ 2 ml coronaire effluent zodra ze uit het hart. Transfer 0,5 ml van de coronaire effluent in een 2 ml microcentrifugebuis capless en onmiddellijk tot het bepalen van de snelheden van glucose-oxidatie (paragraaf 6 hieronder).
  6. Breng de rest van de coronaire effluent monster (~ 1,5 ml) in een geschikt gemerkte microcentrifugebuis en opgeslagen op ijs.
  7. Herhaal stap 5,4-5,6 regelmatig (bijvoorbeeld elke 5 of 10 minuten) tot het einde van de perfusie experiment.
  8. Bij gebruik van een druk-volume katheter Injecteer 10 pi bolus van hypertone zoutoplossing (15%)in de atriale lijn en vlak voor de atriale canule voor het sluiten van het experiment. Gebruik bolusinjectie de parallelgeleiding (Vp), die van cruciaal belang voor een nauwkeurige bepaling van cardiale volume 15 te berekenen.
  9. Unseal de hartkamer en verwijder de katheter uit de LV indien on werd toegepast in het experiment. Recover het hart via een van de volgende opties:
    1. Als er geen noodzaak om specifieke gebieden van het hart isoleren downstream analyses en indien de perfusie inrichting toelaat, sluit zowel atriale als aorta lijnen en onmiddellijk gevriesdroogd klemmen het hart op de canules gebruikt Wollenberger tang voorgekoeld in vloeibare stikstof.
    2. Als alternatief, snijd het hart van de canules en zet het in ijskoud KH buffer. Snel het hart drogen op een papieren handdoek en meet het nat gewicht. Het hart kan dan worden ontleed en weefselmonsters verzameld voor specifieke metingen. Bevries de resterende weefsel met behulp van Wollenberger tongs voorgekoeld in vloeibare stikstof.
  10. Bewaar de bevroren hartweefsel bij -80 ºC tot bepaling van het drooggewicht (zie paragraaf 8. Berekeningen).

6. Bepaling van het myocard Glucose Oxidatie Tarieven

LET OP: De methode bestaat uit de kwantitatieve terugwinning van 14 CO 2 uit de coronaire effluent met een trapping oplossing van hydroxide van hyamine. De 14 CO 2 opgelost als H 14 CO3- wordt teruggewonnen na verzuring van de buffer met perchloorzuur. Monsters moeten onmiddellijk worden verwerkt na herstel passieve diffusie van gassen tussen lucht en het monster zal resulteren in een verlies van 14 CO 2 in de tijd. De scintillatieflesjes moeten goed worden afgedicht met een rubberen mof stoppen van het verlies van 14 CO 2 na toevoeging van perchloorzuur voorkomen. Eventueel kan parafilm worden gebruikt om de rubberen huls stoppers aan de te beveiligenflacons (Figuur 2).

  1. Voeg 1 ml van 10x geconcentreerde hydroxide van hyamine tot glazen scintillatieflesjes (één flesje per monster + twee extra flesjes voor de bepaling van de achtergrond activiteit).
    LET OP: Hydroxide van hyamine is zeer giftig en veroorzaakt ernstige brandwonden. Raadpleeg de product MSDS voor de juiste behandeling en opslag.
  2. Met een pincet fijn overdragen 2 ml doploze microcentrifugebuis met de 0,5 ml coronaire effluent monster een flesje voorgevulde de hydroxide van hyamine. Gebruik 0,5 ml perfusiebuffer voor de bepaling van de achtergrondactiviteit.
  3. Cap de flacon met een rubberen huls stop. Parafilm kan worden gebruikt voor afdichting van de fiool te verzekeren. Met behulp van een 1 ml spuit en een 23 G lange naald, injecteer 200 ul van perchloorzuur (60% w: w%) door de rubberen huls stop en direct in de 2 ml capless buis.
    OPMERKING: De coronaire effluent dient wit worden als gevolg van de precipitatie van BSA.
  4. Laat de flesjes shet 's nachts.
    LET OP: Perchloorzuur is zeer corrosief, kan fungeren als een oxidator en / of leiden tot explosiegevaar. Raadpleeg de product MSDS voor de juiste behandeling en opslag.
  5. De volgende dag, verwijder de rubberen huls stoppers. ophalen zorgvuldig elk 2 ml doploos buis met een pincet en was de bodem van de buis boven de open flacon met 1 ml scintillatiecocktail aan alle hydroxide van hyamine halen. Gooi de capless buis van een geschikt gemerkte container radioactief afval.
  6. Voeg een extra 9 ml scintillatiecocktail per flacon. Voeg 0,5 ml perfusiebuffer rechtstreeks aan twee flesjes gevuld met 10 ml vloeibare scintillatiecocktail voor de bepaling van de specifieke activiteit. Schud de flesjes krachtig met de hand en wacht minstens 6 uur om luchtbellen te laten verdwijnen voor de meting in een vloeistofscintillatieteller goed ingesteld voor dual label experimenten.
    LET OP: Gebruik duidelijke glazen flesjes aan de ne visualiserenedle wanneer het doorprikken van de rubber mof stoppers. Do perchloorzuur niet vallen in de hydroxide van hyamine omdat dit de reactie zal ruïneren. Het toevoegen van de perchloorzuur releases de 14 CO 2 uit de coronaire effluent lob. Hoewel de flesjes stevig worden afgedicht en alle 14 CO 2 worden ingesloten in de hyamine hydroxide, wordt aanbevolen om deze test uit onder zuurkast.

7. Bepaling van het myocard Oleate Oxidatie Tarieven

OPMERKING: De werkwijze is gebaseerd op de kwantitatieve afscheiding en winning van 3 H 2 O van de coronaire effluent met een sterke anionenuitwisselingshars. In tegenstelling tot het herstel van 14 CO 2, is er geen probleem monsterstabiliteit en de coronaire effluent kan worden bewaard op ijs of in de vriezer bewaard voordat de test.

  1. Bereid anionenuitwisselingshars kolommen (één kolom per monster + two extra kolommen voor het bepalen van de achtergrond activiteit) door het vullen van de punt van de spuit 3 ml buisjes met glaswol. Voeg het hars / water drijfmest met een transfer pipet totdat de hars van het merk 2 ml op de spuit buis bereikt.
  2. Was de hars door het passeren van 2 ml ultrapuur water door de kolom. Herhaal deze stap nog twee keer.
  3. Plaats geopend scintillatieflesjes onder de kolommen en de belasting van 0,5 ml coronaire effluent per kolom. Laad 0,5 ml perfusiebuffer ter bepaling van de achtergrondactiviteit.
  4. Was de kolommen achtereenvolgens met 0,5, 1 en 2 ml ultrapuur water. Zodra de elutie wordt gedaan, gooi de kolommen van een geschikt gemerkte container radioactief afval.
  5. Voeg 13 ml vloeibare scintillatiecocktail per scintillatieflesje. Voeg 0,5 ml perfusiebuffer rechtstreeks aan twee flesjes gevuld met 13 ml vloeibare scintillatiecocktail voor het bepalen van de specifieke activiteit. Schud de flesjes krachtig en wacht minstens 6 uur voor het meten in een vloeistof scintillation teller op de juiste wijze ingesteld voor dual label experimenten.

8. Berekeningen

  1. Als dit niet al gedaan, bepalen de natte gewicht van de gehele doorbloed hart.
    LET OP: Zorg ervoor dat de bevroren weefsel te ontdooien als moleculaire en biochemische analyses moeten vervolgens worden uitgevoerd op de resterende weefsel.
  2. Bepaal het natte gewicht van een weefselmonster van de gehele perfuseren hart (gebruik ongeveer 15 tot 30% van het gehele hart). Plaats het weefselmonster in een oven ingesteld op 50 ° C overnacht en meet het drooggewicht. Gebruik het natte gewicht / droog gewichtsverhouding van het weefselmonster van het droge gewicht van het hele hart in gram bepalen (g drooggewicht.).
  3. Voor elk tijdspunt x drukken de waarde van coronaire stroming CFR in ml / min.
  4. Bepaling van de snelheid van glucose oxidatie
    1. Het gemiddelde van de twee desintegratie / min (DPM) gemeten waarden voor de achtergrond activiteit van 14 C tot BEPALIne de correctiefactor 14C dpm ba.
    2. Bepaal de 14 C gemiddelde waarde van de specifieke activiteit 14C dpm sa.
    3. Bepaal de specifieke radioactiviteit van glucose in dpm / pmol (F Glu) volgens de formule
      figure-protocol-1
      LET OP: Waar n Glu (umol) = C Glu (micromol / l) * sample volume (L) = 2,5 bij het gebruik van glucose op 5 mmol / l en een 0,5 ml monster.
    4. Bepaal voor elk tijdstip x de productiesnelheid van 14 dpm CO 2 in / min (A) volgens de formule
      figure-protocol-2
      LET OP: Waar Vol x (ml) = 0,5
    5. Verdeel A door de vastgestelde waarde van droog gewicht van het hart om de genormaliseerde snelheid van de productie van 14 CO 2 (A Norm verkrijgen ) in dpm / min per gram droog gew.
    6. Toepassing van de formule GO = A Norm / F Glu om de snelheid van glucose oxidatie (GO) in umol glucose / minuut per gram drooggewicht verkrijgen.
  5. Bepaling van het tarief van Oleate Oxidatie
    1. Het gemiddelde van de twee desintegratie / min (DPM) gemeten waarden voor de achtergrond activiteit van 3 H om de correctiefactor 3H dpm ba te bepalen.
    2. Bepaal de 3 H gemiddelde waarde van de specifieke activiteit 3H dpm sa.
    3. Bepaal de specifieke radioactiviteit van oleaat in dpm / pmol (F Ol e) door toepassing van de formule
      figure-protocol-3
      LET OP: Waar n Ole (umol) = C Ole (micromol / l) * sample volume (L) = 0,2 bij gebruik van oleaat bij 0,4 mmol / l en een 0,5 ml monster.
    4. Bepaal voor elke time punt x de snelheid van de productie van 3 H 2 O in dpm / min (B) door toepassing van de formule
      figure-protocol-4
      LET OP: Waar Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide B door de vastgestelde waarde van droog gewicht van het hart om de genormaliseerde-snelheid van de productie van 3 H 2 O (B Norm) in dpm / min per gram droge gew verkrijgen.
    6. Breng de formule OO = B Norm / F Ole om de snelheid van oleaat oxidatie (OO) te verkrijgen in umol van oleaat / min per gram droog gew.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Twee representatieve experimenten worden in de onderstaande figuren. In beide gevallen, het hart van een 16 weken oude mannelijke Sprague Dawley ratten werd geïsoleerd en geperfuseerd in de werkmodus met KH buffer bereid volgens de voorgaande protocol. In elk experiment werd het hart aan een spanningstoestand aan cardiale beïnvloeden. Cardiale contractiele functie werd bepaald door continue registratie van de hartslag druk door het inbrengen van een druksensor in de aorta lijn en door be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het voorgaande protocol beschrijft de methoden om tegelijkertijd de flux van substraat te kwantificeren door middel van glucose oxidatie en vetzuur oxidatie in het geïsoleerde werkende rat hart. De metingen kunnen vervolgens worden gesuperponeerd op de geregistreerde cardiale functionele parameters de verhouding tussen substraten metabolisme en cardiale werken onder basislijn en stress factoren (verandering in belasting, ischemie-reperfusie, enz ...). Het is ook mogelijk om te evalueren hoe het metabolisme / co...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door toekenningen van de National Institutes of Health R00 HL112952 (aan R. H.), R01 HL108618 (aan J.P.G.), P01 HL051971 en P20 GM104357. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificBP358
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificBP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 gBio-Rad1401441Dit artikel kan worden vervangen door directe aankoop van de hydroxide vorm  (zie referentie hieronder), maar dit kost bijna 8 keer meer
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 gBio-Rad1432445Door dit artikel aan te schaffen, kunt u het proces van conversie van het anionenwisselingsresin van de chloridevorm naar de hydroxidevorm omzeilen (zie sectie 1.2 van het protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter HolderFisher Scientific09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher ScientificS318Corrosie. Raadpleeg de MSDS van het product voor de juiste handelwijze en opslag.
Gas Dispersion Tube with Fritted CylinderFisher Scientific11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, PowderEMD Millipore820027Wij bevelen het gebruik van een koolzuur-ontvette BSA aan, omdat andere zuiveringsprocessen zoals koude ethanol fractievorming residuen kunnen achterlaten die giftig zijn voor het hart.
Sodium OleateSigma-AldrichO7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCRadioactief materiaal. Volg de richtlijnen van het stralingsveiligheidskantoor van uw instelling voor het bestellen en hanteren.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameterFisher Scientific08-667E
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021
Glucose, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCRadioactief materiaal. Volg de richtlijnen van het stralingsveiligheidskantoor van uw instelling voor het bestellen en hanteren.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin HydrateSigma-AldrichT133Gecontroleerde stof op USDEA Schedule III
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005Zeer giftig en veroorzaakt ernstige brandwonden. Raadpleeg de MSDS van het product voor de juiste handelwijze en opslag
20 ml Glass Scintillation VialsFisher Scientific03-341-25EGebruik glazen vials voor kwantitatieve herstel van 14CO2
20 ml HDPE Scintillation VialsFisher Scientific03-337-23BGebruik HDPE-vials voor kwantitatieve herstel van 3H2O
Red Rubber Sleeve StoppersFisher Scientific14-126DDPast op 20 mL scintillatievials; Herbruikbaar
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mmBD305194Gebruik om perchloorzuur te injecteren via de rubberen hulpstofstopper van de CO2-val
Perchloric Acid, 60%Fisher ScientificA228Zeer corrosief en kan als oxidator werken en/of een explosiegevaar veroorzaken. Raadpleeg de MSDS van het product voor de juiste handelwijze en opslag
Ultima Gold, Scintillation CocktailPerkinElmer6013327
Glass WoolFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detergent PowderFisher Scientific04-355Voor het reinigen van glaswerk, kunststof onderdelen en slangen
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered DetergentFisher Scientific16-000-115Voor het reinigen van "moeilijk bereikbare" oppervlakken (slangen, glaswerk) vervuild met vetzuur-BSA-residu

Referenties

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
  2. Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796(2013).
  3. Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
  4. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
  5. Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
  6. Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
  7. Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
  8. Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
  9. Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
  10. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
  11. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
  12. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  13. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
  14. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  15. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
  16. Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
  17. Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
  18. Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
  19. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
  20. Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
  21. Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
  22. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  23. Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
  24. Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
  25. Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
  26. Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
  27. Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
  28. Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
  29. Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
  30. Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
  31. Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
  32. Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
  33. Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
  34. Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
  35. Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
  36. Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
  37. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GlucoseoxidatieGe soleerd Werkend HartRadiolabelsubstratenAnalyse van Coronair EffluentScintillatietellingCardiale Contractiele FunctieMeting van Metabole FluxBereiding van PerfusiebufferRadioisotopen tracertechniek
Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.