Het knaagdier Model van nonarteritic anterior ischemische optische neuropathie (rNAION)

Samenvatting

Het volgende rapport beschrijft hoe je het knaagdiermodel van nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION) kunt repliceren, met behulp van de juiste kleurstof, contactlens en laserparameters. We onthullen ook de juiste stappen voor het evalueren van de rNAION-laesie in vivo.

Samenvatting

Non-arteriettische anterieure ischemische optische neuropathie (NAION) is een focale ischemische laesie van de oogzenuw die 1 op de 700 personen gedurende hun leven treft. NAION resulteert in oogontzending, selectieve verliezen van de retinale ganglioncelneuronen (RGC's) en atrofie van de oogzenuw. Er is een knaagdiermodel van NAION ontwikkeld dat de meeste kenmerken en gevolgen van NAION vertoont en dat zowel op ratten als op muizen van toepassing is. Dit model maakt gebruik van een focale lasertoepassing met een golflengte van 532 nm om een fotoactieve kleurstof, Rose Bengal (RB), te belichten en hierdoor capillaire schade en lekkage te veroorzaken in de beoogde voorste oogzenuw (de laminaire regio). Na inductie van rNAION is er een vroege oogzenuwishemie, oogontzending en intraneurale ontsteking, gevolgd door selectieve RGC- en axonalverliezen. Omdat de oogzenuw een witte stofbaan van het centrale zenuwstelsel is, is het rNAION-model toepasbaar voor mechanistische studies van selectieve ischemische witte stof, evenals voor neuroprotectieve analyses en korte en lange termijn mechanismen van gliale en neuronale reacties op ischemische aandoeningen.

Inleiding

Nonarteritic anterior ischemische optische neuropathie (NAION) is een focale ischemische letsel van het voorste gedeelte van de oogzenuw (ON) ^1. NAION is de meest voorkomende oorzaak van plotselinge oogzenuw gerelateerde gezichtsverlies bij personen ouder dan 50 ^2. Het mechanisme wordt aangenomen dat een compartiment syndroom dat resulteert in intraneurale oedeem en compressie veroorzaakt van de capillairen leveren axons in de oogzenuw ^3.

Aangezien de ON eigenlijk een centraal zenuwstelsel (CZS) kanaal, kan het knaagdier NAION (rNAION) model worden gebruikt om de mechanismen te bestuderen en reacties op geïsoleerde CZS witte stof beroertes. De rNAION model kan daarom nuttig zijn bij het ontleden van vele problemen in verband met een beroerte in verband schade aan witte stof zijn. Het kan worden gebruikt om verschillende strategieën en neuroprotectieve middelen in witte stof beroerte evalueren.

Een van de aantrekkelijke kenmerken van het model is dat heteen pijnloze, niet-invasieve procedure. Het laservermogen kan worden aangepast aan verschillende mate van ischemische schade veroorzaken. Een ander kenmerk is doordat het op laser geïnduceerde superoxide radicalen de capillaire endotheel beschadigen, een progressieve capillaire disfunctie. Hierdoor disfunctie en vooruitstrevende oedeem dat wordt verondersteld opmerkelijk vergelijkbaar met het mechanisme dat NAION veroorzaakt worden. Onderzoek heeft aangetoond dat het niet direct capillaire stolling veroorzaakt, maar werkt door ten minste twee mechanismen: superoxide geïnduceerde dood en strippen van enkele capillaire endotheelcellen ⁴ en NFkB (nuclear factor kappa-lichte-keten-enhancer van geactiveerde B-cellen ) geassocieerd inflammatoire up regelgeving in de resterende endotheel, met een verhoogde vloeistof transport over de celmembranen in het interstitium ^5. De sluiting van de oogzenuw haarvaten en compressie veroorzaakt door interstitiële vochtophoping resultaat in de oogzenuw hoofd ischemie. Een schematische afbeelding weergegeven inFiguur 2. De rNAION model kan worden gebruikt in zowel ratten en muizen species ^6,7, en kan het niveau van de ernst variëren, van een milde laesie volledig, maar pijnloze vernietiging van de oogzenuw en het netvlies, zoals als centrale retinale arterie occlusie (CRAO).

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Maryland Institutional Animal Care en Ingebruikname Comité (IACUC, Baltimore, MD, USA)

1. Experimental Set-up

1. Wordt maat ontworpen contactlens van een heldere optische kwaliteit cirkelvormige 7 mm diameter plexiglas, dikte 3 mm. Snijd de ronde lenzen met een kolomboormachine. Gebruik een standaard boorbeitel aan de binnenbocht maken, en ten slotte polijsten de buitenste en binnenste weer door middel van een contactlens polijstmachine ultrafijne korrel (1000/3000).
2. Bereid 2,5 mM Rose Bengal (RB) in pH 7,4 fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) vooraf filter steriliseren met een 0,45 micron spuitfilter en opslaan 1 ml aliquots van -20 ° C in een lichtdichte verpakking tot 6 maanden.
   Opmerking: Het gebruik van inteelt mannelijke albino dieren, zoals Sprague Dawley minimaliseert de spanning afhankelijke respons verschillen, zodat vergroot het inductie en vermindert de variabiliteit die kan optreden bij oestrus cycling vrouw.
3. Stel de frequentie verdubbeld Neodymium-yttrium aluminium-granaat (Fd-YAG) oogheelkundige medische laser, die een 532 nm laserlicht genereert. Monteer de laser op een Haag-Streit oogheelkundige spleetlamp met een standaard oogheelkundige laser adapter. Deze in de handel verkrijgbaar apparaat maakt gelijktijdige visualisatie van ogen en laser spot toepassing van het dier. De medische laser heeft ook een streven beam voor een goede scherpstelling en centrering met behulp van dezelfde plek grootte als laser inductie. Laservermogen parameters zijn:
   1. Voor rat rNAION inductie: gebruik maken van 500 pm spot grootte / 50 mW laservermogen / 1000 msec duur / 1000 msec interval.
   2. Voor muizen rNAION inductie: wijzig de vlekgrootte tot 300 pm voor kleinere optische disk en laat andere parameters hetzelfde als de rat instelling.
   3. Routinematig gebruik van een laser power meter aan de laser vermogen te verzekeren.

2. Experimentele procedure

1. Zet de laservermogenen het opzetten van de juiste laser parameter. Verwarm de laser gedurende ten minste vijf minuten voor gebruik.
2. Weeg het dier om de juiste dosis voor ketamine / xylazine en RB kleurstof te bepalen. Verdoven het dier door intraperitoneale injectie van 1 ml / kg mengsel van 80 mg / ml ketamine en 4 mg / ml xylazine.
3. Laat het dier in een verwarmde kooi tot ze volledig verdoofd. Controleer of er geen reactie op aversieve stimuli (staart of teen knijpen). Controleer dieren anesthesiediepte elke 10 min.
4. Pupillen verwijden van het dier met 1% tropicamide en verdoven het oppervlak van het oog met 0,5% proparacaine. Bij gebruik van gepigmenteerde dieren, zoals Long Evans, een 2,5% neosynephrine oogdruppels pupilverwijding verhogen.
5. Gebruik een schaar te knippen de snorharen in de buurt van de snuit aan de kant te worden geïnduceerd om te voorkomen dat het blokkeren van het uitzicht.
6. Een druppel 1% methylcellulose of andere oftalmische koppeling druppel aan de binnenzijde van de op maat gemaakte contactlens, en vervolgens de lens op tHij rat oog.
7. Plaats het dier op een platform aangepast aan de hoogte van de spleetlamp. Stel hoofd van het dier bij een 45 ° hoek, zodat het oog loodrecht op de spleet lamp en laser beam.
8. Visualiseer het oog door de oogheelkundige spleetlamp. Zorg ervoor dat het richten bundel is de juiste maat, evenals gericht en gecentreerd direct aan de gevisualiseerde oogzenuw. Fotograferen de retinale fundus met een digitale camera met een hoge ASA (1200 - 2000) Snelheid aangebracht op één van de oculairen van de spleetlamp met een op maat gemaakte adapter.
   OPMERKING: De mogelijkheid om de choroïdale vaten zien onthult de transparantie van het netvlies. Dit is een belangrijk signaal om te kunnen later retinale ischemie te detecteren, wat de interpretatie kan verwarren als het zich voordoet. rNAION is oogzenuw ischemie, waardoor geïsoleerde RGC verlies, terwijl retinale ischemie leidt tot beschadiging van het netvlies alle cellen van de binnenste retinale lagen beïnvloeden.
9. Eventueel verder beeld het netvlies enoogzenuw met behulp van een spectrale domein-optical coherence Tomografie ^(SD-8 oktober) aan de niet-geïnduceerde oog te evalueren. Scannen en face (Figuur 3B) en 7 doorsnede scant de retina (Figuur 3C). De SD-oktober beeldvorming maakt gebruik van dezelfde contactlens gebruikt voor laser inductie.
10. Injecteer 1 ml / kg RB intraveneus door middel van staartader, en wacht 30 seconden, dan is het laservermogen te activeren. Deze timer kan de RB gelijkmatig verdelen door de circulatie. We maken gebruik van een 50 mW laserpuls op één sec / puls. Greater energieën (≥ 60 mW) kan het netvlies beschadigen of retinale vasculaire ischemie.
    Let op: Zorg ervoor dat iedereen heeft een paar laserveiligheid filtering glazen van de juiste golflengte blokkering te voorkomen dat er ongewenste laserlicht invoeren oog onderzoeker.
    LET OP: De laser administratie moet snel worden gegeven na de IV RB injectie, omdat de kleurstof snel wordt geëlimineerd uit de circulatie. Hoe langer de laser inductie, hoe ernstiger de oogzenuw ischemie. In het algemeen worden dieren die 7-12 sec pulsen in snelle opeenvolging. Het contact van het laserlicht met de circulerende kleurstof geeft de oogzenuw schepen een mooie gouden gloed die kan worden gezien door de spleetlamp (Figuur 4B). Dit bewijst dat de kleurstof werd systemisch geïnjecteerd en verspreid in de bloedbaan. Als de gloed is zwak, of helemaal geen (figuur 4A), is de kleurstof niet intraveneus ingespoten. In dit geval, geen tweede injectie onmiddellijk te geven, omdat de dieren moeten herstellen gedurende ten minste twee dagen voor herinjectie.
11. Onmiddellijk na inductie, verwijder de contactlens. Bedek beide ogen met oogheelkundige triple antibioticum (Neosporin / polymyxine / bacitracine) zalf met dexamethason, en plaats het dier op een 37 ° C opwarming pad in één kooi gehuisvest onder strikte observatie tot volledig herstel.
    1. Maak de contactlens met gedestilleerd water en wrijf droog met een niet-schurend reinigingsdoekje voor toekomstig gebruik.
    2. Twee dagen na de inductie evalueren van de oogzenuw oedeem door beide fundus kleur fotografie en SD-oktober analyse ^8.
       Opmerking: Het vergelijken van de mate van oedeem oogzenuw geeft een schatting van de ernst van de oogzenuw ischemie. Op twee dagen, is de oogzenuw schijf marge wazig, en de retinale aderen enigszins verwijd, in vergelijking met de contralaterale (-un-geïnduceerde) oog. Voer Electroretinografie (ERG) en flash-visuele evoked potential (VEP ¹¹⁾ op twee en vier weken na de inductie voor de elektrofysiologie analyse.

Resultaten

De contactlens ingeschakeld centrale retina visualiseren (figuur 1). Het brandpunt laserspot belicht de optische schijf aan de achterkant van de retina (Figuur 2). De normale-un geïnduceerde retina wordt afgebeeld door spleetlamp bio-microscoop (figuur 3A) en SD-oktober (Figuur 3B en 3C). Tijdens laser inductie, als er geen kleurstof aanwezig in de circulatie, laserlicht niet tot vat en schijf fluorescentie

Discussie

Hoewel er een aantal modellen van de schade aan de oogzenuw (oogzenuw verpletteren ^12, oogzenuw doorsnijding ^13, en PION ^14), de rNAION model humaan is, aan te passen aan zowel ratten en muizen. Het lijkt beter de menselijke klinische toestand van NAION. Deze voorwaarde omvat progressieve anterior oogzenuw oedeem, een anterieure oogzenuw compartiment syndroom, focale axonale ischemie, geïsoleerde retinale ganglion cel axonen schade en verlies over een langere tijdsverloop. Dit verslag le...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
50 mW 532 nm laser	Iridex		Standaard oogheelkundige laser
0 - 100 mW 532 nm laser	Laserglow technologies		Vervanger voor iridex
Laser spleetlamp adapter	Iridex		SMA gekoppelde adapter voor laseruitgang
Coherent Fieldmate lasermeter met thermopijlsensor	Coherent		anderen ook geschikt
Oogheelkundig onderzoekende spleetlamp biomicroscoop	Verschillende		Haag-Streit is de beste; goedkopere versies verkrijgbaar op ebay
Rose Bengal	Sigma	330000-1G	Foto-inducerend middel
Fundus contactlens of glazen deksel	custom/Cantor en Nissel (UK)		Op maat gemaakte planoconvexe plastic lens voor oogonderzoek en inductie
Tropicamide 1%
Tamiya polijstpasta	Tamiya, INC	87068	contactlens polijsten
2,5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose	HUB Pharmaceuticals		contactlens koppelingsmiddel
2,5% Neosynephrine oogdruppels	Alcon labs		pupilverwijdend middel
Tropicamide 1%	Alcon labs		pupilverwijdend middel
0,5% Proparacaine	Alcon labs		topisch verdovingsmiddel
30 G versmolten naald insulinespuit	Verschillende	Verschillende	voor intraveneuze injectie van rose bengal
Oogheelkundig antibioticumzalf met toegevoegd dexamethason (drivoudige antibioticumzalf)	Verschillende	Verschillende	Aanbrengen na inductie om hoornvlieslittekens te minimaliseren
Heidelberg Corporation Spectral domein-Optische Coherenstomograaf	Heidelberg Corporation		Voor optische coherentiemetingen baseline en post-inductie; niet essentieel voor inductie