Methodenartikel

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54511

⸱

14 september 2016

 ,  , 
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Samenvatting

Eukaryotische cellen detecteren en bewegen zich richting een chemoattractant-gradiënt, een cellulair proces dat chemotaxis wordt genoemd. Chemotaxis speelt een cruciale rol in veel fysiologische processen, zoals embryogenese, neuronpatroonvorming, metastase van kankercellen, rekrutering van neutrofielen naar ontstekingsplaatsen en de ontwikkeling van het modelorganisme Dictyostelium discoideum. Eukaryotische cellen detecteren chemo-attractanten met behulp van G-proteïnegekoppelde receptoren. Visuele chemotaxis-assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen de door chemo-attractanten gemedieerde directionele celmigratie controleren. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoog-resolutie monitoring van meerdere chemotaxis-assays, en 2) het tegelijkertijd visualiseren van de chemoattractant-gradiënt en de ruimtelijk-tijdelijke dynamica van signaalgebeurtenissen in neutrofiel-achtige HL60-cellen.

Inleiding

Eukaryote cellen voelen en bewegen in de richting van de hogere concentratie binnen een chemoattractant gradiënt, aangeduid een cellulair proces chemotaxis. Chemotaxis speelt cruciale rol in veel fysiologische processen, zoals embryogenese 1, neuron patroon 2, metastase van kankercellen 3, rekrutering van neutrofielen op plaatsen van ontsteking 4, en de ontwikkeling van het modelorganisme Dictyostelium discoideum 5. In het algemeen eukaryotische cellen zin chemoattractanten via G-eiwit gekoppelde receptoren 5. De ingrijping van chemoattractants met deze receptoren bevordert de dissociatie van heterotrimere G-eiwitten en Ga-Gβγ, die op zijn beurt activeert stroomafwaartse signaaltransductieroutes die uiteindelijk de spatio-temporale organisatie van het actine cytoskelet celmigratie 5-9 drijven regelen.

Cell biologen zijn het ontwikkelen en verbeteren van chemotaxis assays om te onderzoeken hoe G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) signalering bemiddelt gericht cel migratie. De Boyden kamer of transwell migratie test werd ontwikkeld in 1960 door Boyden 10. De test werkt door een gradiënt van chemoattractant verbindingen tussen twee putten die worden gescheiden door een microporeus membraan. De eenvoud en het gebruiksgemak maken het de meest gebruikte chemotaxis test tot nu toe. De assay niet in staat de migratie proces van de cellen worden gevisualiseerd. De Zigmond kamer is de eerste visuele microfluïdische apparaat dat er duidelijke beeldvorming van de cel migratie mogelijk maakt op een dekglaasje over een smalle vernauwing in de richting van een bron chemoattractant 11. Dunn 12 en Insall 13 gewijzigd en de hoge resolutie en langdurige beeldvorming vermogen van de kamer Zigmond chemotaxis assay verbeterd. Vanwege de hoge mate voorspelbaar, diffusie-dominante kenmerken van de vloeistofstroom heeft microfluidics is het leveren van oplossingen voor de next-Generatiop chemotaxis testen zoals EZ-TAXIScan (a mobiliteit cel analyse-apparaat).

Met de stabiliteit van de gradiënt gewaarborgd, het apparaat kan zes chemotaxis assays tegelijkertijd (figuur 1A) worden uitgevoerd. In tegenstelling tot de vaste directioneel gradiënten gegenereerd in de verschillende kamer die hierboven, de naald of micropipet assay ontwikkeld door Guenther Gerisch genereert een verloop met een beweegbare bron 14. In de test wordt chemoattractant vrijgemaakt uit een beweegbaar micropipet een stabiel verloop genereren. Met deze naald test, vonden de onderzoekers dat de verschillende cellen te genereren pseudopods met fundamenteel verschillende kenmerken. Aanbrengen fluorescentiemicroscopie, konden we de gradiënt zichtbaar zijn kwantitatieve meting gedurende 15 vergemakkelijken. In deze studie beschrijven we gedetailleerde werkwijzen voor het bereiden chemotactisch HL60 (menselijke promyelocytische leukemie) cellen, gelijktijdig oogopslag meerdere chemotaxis assays met de mobiliteit cel analyseapparaat, en visualiseren van de GPCR gemedieerde spatiotemporele dynamiek van signaalmoleculen zoals eiwitkinase D1 in enkele levende cellen in respons op zichtbaar spatiotemporeel regelbare chemoattractant stimuli. Onze geavanceerde imaging werkwijzen kunnen worden toegepast op de algemene chemotaxis studies, en zijn bijzonder geschikt voor zoogdierlijke celsystemen.

Protocol

1. Cultuur en differentiatie van humane neutrofielen-achtige HL60 Cells

  1. Bereid RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 kweekmedium RPMI 1640 medium, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvaat bevat en 25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazineethanesulfonic zuur). Verwarm het RPMI 1640 kweekmedium 37 ° C.
  2. Met behulp van een hemocytometer bepalen van de celdichtheid van HL60 cellen om ervoor te zorgen dat de cellen in de log-fase groeifase.
    LET OP: Cellen zijn meestal in log-fase op de derde dag na de passage. De dichtheid van log-fase cellen gewoonlijk 6-8 x 10 5 cellen / ml. De celdichtheid moet een nieuw cultuur beginnen ongeveer 1,5 x 10 5 cellen / ml.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, een 10 ml nieuwe cultuur in een T-75 vlakke kolf, wanneer de celdichtheid van log-fase cellen 6 x 10 5 cellen / ml, vervolgens 2,5 ml log-fase cellen (6 x 10 5 ) wordt verdund tot 1,5 x 10 5 cellen / ml in 10 ml nieuwe cultuur. Tot een eindvolume van 10 ml kweek, 7,5 ml RPMI 1640 kweekmedium toegevoegd maken.
  3. Plaats het berekende volume van warme RPMI 1640 kweekmedium in een vlakke kolf. Een T-75 kolf platte cultuur, het totale volume van de celkweek is 10 ml.
  4. Voeg de berekende hoeveelheid log-fase kweken HL60 cellen in horizontale kolf tot een celdichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / ml bereiken.
  5. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
    LET OP: De verdubbeling van de tijd van HL60 is bijna 24 uur.
  6. Passage van de cellen met RPMI 1640 kweekmedium om de 2-3 dagen. Het is belangrijk dat de celdichtheid van de HL60 cellen niet boven 1,5 x 10 6 cellen / ml en de cellen passage duurt niet langer dan 2 maanden.
  7. Onderscheid de HL60 cellen 5 dagen voor de experimenten.
    OPMERKING: RPMI 1640 differentiatiemedium bevat RPMI 1640 medium, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvaat, 25 mM HEPES en 1,3% dimethylsulfoxide (DMSO). Met andere woorden, is 1,3% DMSO in RPMI 1640 kweekmedium.
    1. HL60 cellen te differentiëren, pre-warm de RPMI 1640 kweekmedium tot 37 ° C. Voeg de warme RPMI 1640 kweekmedium in een vlakke kolf.
    2. Voor een laatste 10 ml HL60 differentiatie cultuur, rechtstreeks toe te voegen 130 ul DMSO aan de RPMI 1640 kweekmedium in het vlakke kolf, terwijl wervelende de kolf, zodat de DMSO snel wordt verdund door de RPMI 1640 kweekmedium.
    3. Add log-fase HL60 cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / ml in een uiteindelijk 10 ml RPMI 1640 differentiatiemedium. Cultuur van de HL60-cellen in RPMI 1640 medium differentiatie bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 5 dagen.

2. Coating de Cover glazen oppervlak van de 4well Kamer

  1. Neem de fles van 2% gelatine voorraad oplossing uit de koelkast schoon met 70% ethanol, en plaats het in de kap. Take 1 ml 2% gelatine voorraad-oplossing en de terugkeer van de resterende voorraad gelatine oplossing voor de koelkast onmiddellijk.
  2. Laat de gelatineoplossing volledig vloeibaar bij 37 ° C en pipetteren grondig. Verdun de 2% gelatine voorraadoplossing met 9 ml voorverwarmd 1x Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) buffer tot een eindconcentratie van 0,2% gelatine.
  3. Voeg 0,5 ml of 2 ml 0,2% gelatine in HBSS om de twee middelste putjes van een 4-well kamer of een kamer 1 putjes met een dekglas op de bodem, resp. Kantelen van de platen in verschillende richtingen, zodat de vloeistof bedekt het gehele oppervlak.
  4. Plaats de platen in een 37 ° C incubator. De platen klaar voor gebruik in 1 uur zijn. Ze kunnen worden gebruikt voor maximaal 5 dagen. Net voor het zaaien cellen, verwijder de gelatine oplossing uit de 4-en of 1-well kamers.

3. Chemotaxis Assay gebruiken Cell Mobility Analysis Device

  1. Bereid en verwarm RPMI 1640 honger medium, dat RPMImedium dat 0,1 mM natriumpyruvaat (optioneel) en 25 mM HEPES.
  2. Bereid 100 pi van 100 nM fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine) in RPMI 1640 medium uitgehongerd.
  3. Bereid 3 ml 1% runderserumalbumine (BSA) / RPMI 1640 medium dat 1% BSA in RPMI 1640 medium uitgehongerd en 10 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium bevat.
  4. Coat een 22 mm vierkante dekglaasje en een 5 urn mobiliteit celanalysesysteem chiphulpmiddel met vers bereide 1% BSA / RPMI 1640 medium gedurende 1 uur bij KT.
  5. Monteer de houder met de volgende procedure:
    1. Plaats de houder basis met de hendels in de verticale stand zodat de hefbomen kan kantelen naar de gebruiker. Toepassen 70% ethanoloplossing voor het glasoppervlak 41 mm. Veeg voorzichtig de oppervlakken met een veeg, zorg niet te krabben.
    2. Plaats de 41 mm glas in de houder basis. Zet de BSA-beklede 22 mm vierkante dekglaasje bovenop de 41 mm glas in de houderbasis.
      LET OP: De beklede vierkante coverslip tussen de 41 mm glas en de chip maakt chemotaxis voorgekomen op het substraat van de coating oppervlak.
    3. Plaats de O-ring (small) in de onderkant van de waferhouder, en zet de waferhouder in de houder basis met de elliptische opening aan de achterzijde. Trek de inwendige hoogte van de houderbasis uit naar de horizontale positie naar de waferhouder in positie te vergrendelen.
    4. Blaas stof uit het inwendige van de wafer behuizing met een lucht stofdoek. Voeg 4 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium in de waferhouder.
    5. Monteer de BSA-beklede celbeweging analyseapparaat chip in het midden van de waferhouder de structurele zijn verticaal in contact met het glas.
      OPMERKING: Dat de chip moet de positionering merkteken (het gat in de bovenkant van de chip) aan de achterzijde in te voegen.
    6. Bevestig de rubber op de bodem van de wafel klem door het aanbrengen van de twee uitsteeksels op de rubber afdichting in de gaten.
    7. Monteer de O-ring (groot) opde top van de waferhouder. Monteer de wafer klem met de sensor gat aan de achterzijde. Trek de buitenste hendel van de behuizing basis uit naar de horizontale positie van de wafer klem vast te zetten.
    8. Na montage van de houder, plaats de bodem van de houder op de lichtbak te bevestigen dat er geen luchtbellen in de putjes. Als er luchtbellen worden gedetecteerd, verwijder ze met behulp van de bijgeleverde plastic injectiespuit voorzien van een monster laden tip.
    9. Verwijder het deksel en zet het geheel op de plaat op de top van de mobiliteit cel analyse apparaat unit. Bevestig de sensor blok aan de houder.
  6. Bereid HL60 Cellen voor Chemotaxis Assay:
    1. Bereken de celdichtheid van de gedifferentieerde HL60 cellen met een hemocytometer. Na 5 dagen van differentiatie, de celdichtheid ongeveer 1,0 x 10 6 cellen / ml.
    2. Bereken het eindvolume van HL60 cellen bij een uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Bijvoorbeeld, wanneer de celdichtheid van degedifferentieerde HL60-cellen is 1,0 x 10 6 cellen / ml, dan 10 ml gedifferentieerde HL60 cellen worden geresuspendeerd met 5 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium met 2 x 10 6 cellen / ml bereiken.
    3. Centrifugeer gedifferentieerde HL60 cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met het berekende volume van 0,1% BSA / RPMI 1640 medium in stap 3.6.2) tot een uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml.
  7. Start de mobiliteit cel analyse gegeven apparaat en de pc voor het verkrijgen. Sluit het apparaat aan op de pc. Zet de mobiliteit cel analyse apparaat. Schakel de PC.
  8. Start Up the Cell Mobility Analysis Device Software.
    1. Observeer 5 bedieningspanelen: camera, verwarming, schieten, memo, en camerabeelden.
    2. Op het beeld camera bedieningspaneel gebruiken "horizontale lijn" of "Vertical line" aan de houder / uitzicht positie in real-time aan te passen aan de camera te centreren in het beeld camera panel.
    3. Op de camera bedieningspaneel, selecteer CH1 tot CH6 om de camera te verplaatsen naar de gedefinieerde kanaal. Om de velden van een kanaal view te centreren, klikt u op "Move L" of "Verplaatsen R" aan te passen van de X-coördinaat van de camera en de centrale positie van de camera horizontaal.
    4. Stel de Y-coördinaat van de camera door het draaien van de positie knop op het voorpaneel van de mobiliteit cel analyse gegeven apparaat verticaal te passen op de afbeelding om het scherm te centreren.
    5. Op de verwarming bedieningspaneel, zet de "houder temp" tot 37,0 ° C en de "plaat temp" tot 39 ° C. Klik op "Heat" de verwarming te starten. Klik ook "houder" naar de temperatuur met de thermische sensor met de houder controleren.
    6. Op de schietpartij panel, voert u "15 sec" bij "Interval" en "30 min" op "Time" voor de tijdstippen en de duur van de chemotaxis assay. Check "verwarming uit op het einde van de opname" om veiligheidsredenen. Wijs een destination voor de opgeslagen beelden.
    7. Op het memo panel, het invoeren van de specifieke kenmerken van de experimenten, zoals de cellijn gebruikt, ongeacht of geen behandeling werd toegepast, en de concentratie van chemo-lokstoffen toegepast.
    8. Controleer de middenpositie van alle kanalen die worden gebruikt in de experimenten, en herhaal de instelling van alle kanalen indien nodig.
  9. Injecteren en cellen uitlijnen als volgt:
    1. Verwijder de buffer uit de houder, en neem 8 ul van buffer uit de derde put uit de top voor elk kanaal.
    2. Met een spuit 2 pl cellen te injecteren in de tweede put in hetzelfde kanaal observatie van het scherm in real time het aantal cellen en de stroom tijdens het inspuiten. Nadat de cellen goed zijn uitgelijnd, geeft de 8 pi buffer weer toevoegen. Herhaal dezelfde procedure voor de andere kanalen (Figuur 1B).
  10. Voeg 2 ml terug naar de houder buffer, en voeg 1 pl 100 nM fMLP de derde en van boven. Start beeldacquisitie en de gegevens op te slaan. Analyseer de verkregen met behulp van beeld tracing software 9 (figuur 2) data.

4. Transfectie met Elektroporatie

  1. Onderscheid HL60 cellen 5 dagen voor het experiment, zoals beschreven in hoofdstuk 1. Coat 4-en of 1-en kamers zoals beschreven in hoofdstuk 2.
  2. Bereiden en warme RPMI 1640 elektroporatie herstel medium, dat RPMI 1640 medium, 20% (v / v) FBS, 0,1 mM natriumpyruvaat, en 25 mM HEPES bevat, tot 37 ° C.
  3. Bepalen voordat de transfectie experiment, voeg ofwel 300 ul of 3 ml RPMI 1640 kweekmedium aan de putjes van de pre-beklede putjes 4 of 1-well kamers, respectievelijk.
  4. Incubeer de kamers in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2. Gebruik deze kamers onmiddellijk of bewaar in de incubator voor toekomstig gebruik (twee weken).
  5. Tel de celdichtheid van de gedifferentieerde HL60 cellen met een hemocytometer.
    OPMERKING: De celdichtheid bereikt vaak ongeveer 1,0 x 10 6 cellen / ml. Cel dichtheid groter dan 3,0 x 10 6 cellen / ml geeft meestal ongewenste transfectie-efficiëntie. Aangezien HL60 cellen suspensie cellen, is geen resuspensie vereist.
  6. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer 2 x 10 6 HL60 cellen in 100 pl transfectiereagens.
  7. Voeg 4 ug GFP-plasmide PKD1 9 in de 100 pi mengsel van cellen en transfectie reagentia en meng voorzichtig en grondig. Voeg het mengsel in de kuvet.
  8. Selecteer vooraf ingestelde van de fabrikant van het programma voor het menselijk leukocyten cellijn en voer de elektroporatie.
    OPMERKING: Meer informatie is beschikbaar op de website van de fabrikant.
  9. Na elektroporatie, onmiddellijk en voorzichtig voeg voorverwarmde 500 pl RPMI 6140 elektroporatie recovery medium aan de cellen, enzachtjes de cellen te brengen van de cuvette naar een 1,6 ml buis met de plastic pipetten.
  10. Incubeer de cellen gedurende 30 min in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2. Zaad 100 ul of 500 ul van cellen in een putje van een 4-put of een 1-well kamer, respectievelijk.
  11. Voeg RPMI 1640 kweekmedium tot een eindvolume van 1 ml of 4 ml diezelfde putje van een 4-wells of 1 putjes kamer respectievelijk. Incubeer de cellen in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 3 uur. Pre-warm RPMI 1640 honger medium tot 37 ° C.
  12. Met behulp van een 1 ml pipet, verwijder voorzichtig 0,8 ml of 3 ml RPMI 1640 kweekmedium uit de bron van een 4-well kamer of een 1-well kamer, respectievelijk. Wees voorzichtig en vermijd weg te zuigen hechtende HL60 cellen.
    LET OP: HL60 cellen groeien en worden gedifferentieerd in suspensie media. Na gedifferentieerde of bewerkt, HL60 cellen hechten aan de ondergrond bekleed met polylysine, collageen, gelatine of fibronectin.
  13. Voeg 0,8 ml of 3 ml RPMI 1640 medium honger in de put van een 4-put of 1-well kamer, respectievelijk. Wacht 1 uur.
    LET OP: Op dit punt de cellen zijn klaar voor de beeldvorming experimenten 9.

5. Toezicht GPCR-gemedieerde Membraan Translocatie van PKD1 door Multi-channel fluorescentiemicroscopie

  1. Bereid vers mengsel van 100 nM fMLP en 1 ug / ml Alexa 594 in RPMI 1640 medium uitgehongerd als stimuli.
    Opmerking: Het mengsel van fMLP en Alexa 594 nodig vers worden aangebracht om maximale efficiëntie te garanderen.
  2. Mount een 4-kamer en ingezaaid met cellen over een 40X olie lens.
  3. Stel de fluorescentiemicroscoop in de Multichannel Configuration als volgt:
    1. Stel de groene emissie kanaal (500-530 nm) voor GFP-tag PKD1, rood emissie kanaal (580-620 nm) voor de chemoattractant fMLP (Alexa 594), en uitgezonden licht kanaal voor het identificeren van het naleven HL60 cellen.
    2. Start "live" verwerving enoptimaliseren van de overname voorwaarden van de drie kanalen:
    3. Fine-tunen tussen intensiteit en laservermogen voor alle drie kanalen om photobleach te minimaliseren voor een langere periode van de beeldvorming.
    4. Eventueel gemiddeld elke 2-4 frames om de ruis verhouding verlagen voor betere beeldkwaliteit. Gebruik een 1 seconde interval.
  4. Zoek voor het hechten van cellen die sterk PKD1-GFP te uiten in de mening van de GFP en DIC (differentieel interferentie contrast) kanaal. Hechtende cellen zijn morfologisch vlak en niet snel bewegen.
  5. Na het identificeren hechten HL60 cellen die sterk express GFP-PKD1, optimaliseren van de overname toestand door verlaging van de laservermogen tegelijk de detector versterking voor elk kanaal de photobleach langdurige imaging (figuur 3A) te verlagen.
  6. Neem 100 ul van fMLP / Alexa 594-oplossing met een 200 ul pipet en zet apart. Selecteer de "time-lapse overname" en stel de intervallen2 sec en het aantal frames te verwerven tot 100.
    OPMERKING: de frequentie en aantal frames te verwerven afhangen van het doel van de experimenten. 1-2 sec intervallen en 100 frames worden vaak gebruikt voor beeldvorming experimenten, zoals in figuur 3. Voor langzaam migrerende cellen, langere tussenpozen nodig voor langdurige beeldvorming. Daarentegen voor snelle migrerende cellen, kortere tussenpozen nodig voor het waarnemen van de continue gegevens van celmigratie.
  7. Verwijder voorzichtig het deksel van een 4-wells aangebracht dat de positie van de kamer niet wordt gewijzigd. Start acquisitie onmiddellijk verwerven 3-5 beelden van de gestimuleerde cellen bij het positioneren van de 200 ui pipet rechtstreeks via cellen met de vlek van laserlicht als richtlijn.
  8. Pipetteer de fMLP / Alexa 594 mengsel over de cellen in beeld wordt gebracht met een snelle en gelijkmatige stroom en de afwerking van de complete set van time-lapse acquisitie. Naam en opslaan van de gegevens die zullen worden onderworpen aan verdere data-analyse.

6. Imaging Chemotaxing Cellen in zichtbaar en controleerbaar Chemo-lokstof Stimuli

  1. Met behulp van een 10 pl micropipet en injectie tips, opvulling van een micropipet met 30 pi vers bereid mengsel van fMLP en alexa594.
  2. Bevestig de micropipet een micropipet houder gemonteerd op een microscoop podium en sluit de slang aan de druk toevoereenheid, een inrichting die een constante druk op fMLP / alexa594 oplossing vrijgeven van de micropipet een constante gradiënt genereren biedt.
  3. Schakel de druk levering en stel de compensatie druk (Pc) tot 70 hPa.
  4. Monteer een 1-well chambered dekglaasje ingezaaid met HL60 cellen die PKD1-GFP over een 40X olie lens op een confocale microscoop of een equivalent fluorescentiemicroscoop.
  5. Stel acquisitie in channel modus in de volgende configuratie: groene kanaal (500-530 nm) voor GFP-tag PKD1; rode kanaal (580-620 nm) voor de chemoattractant fMLP (alexa594); en transmitted licht kanaal voor het identificeren van het naleven HL60 cellen.
  6. Start "live" verwerving en het optimaliseren van de overname voorwaarden voor de drie kanalen: stel de intensiteiten van elk kanaal voor de kwantitatieve analyse van beeldgegevens; fine-tunen tussen intensiteit en laservermogen voor alle drie kanalen om beelden met de beste kwaliteit te verkrijgen en de foto-bleekmiddel te minimaliseren. Indien nodig, gemiddeld om de 2-4 frames voor een betere beeldkwaliteit. We gebruiken meestal een 1 seconde interval.
  7. Start "live" acquisitie en zoek voor het hechten van cellen die sterk PKD1-GFP te uiten in de mening van de GFP en doorgelaten licht kanalen. Gebruik helderveld optiek, midden de micropipet in het middenveld gezien (figuur 4A) teneinde de fMLP verloop visualiseren en de kleefstof HL60 cellen die PKD1-GFP.
  8. Selecteer time-lapse acquisitie en stel de intervallen tot en met 2 sec intervallen en het aantal frames te verwerven tot 100.
    LET OP: Na het verzamelen van elke tIME-lapse-serie, naam en sla de gegevens die zullen worden onderworpen aan verdere data-analyse.

Resultaten

Gelijktijdige beeldvorming van chemotaxis van meerdere HL60 cellen met behulp van mobiliteit cell analyse-apparaat

Gebaseerd op het principe van microfluïdische 16, heeft de fabrikant geleverd gesimuleerde profielen hellingen: a gradient gegenereerd binnen 1 min, stabiel zijn op 5 min en 2 uur gehandhaafd. De hoge mate voorspelbaar profielen van de stabiele gradiënten gegenereerd door microfluidics kunnen meerdere chemotaxis assays om gelijktijdig uitgevoerd worden. In deze studie, observeerden we drie gelijktijdige chemotaxis assays (figuur 2A en Film 1). We vonden dat HL60 cellen begon onmiddellijk na de chemotaxing chemoattractant werd geïnjecteerd in de put van het chemoattractant en bewaard chemotaxing in een rechte baan voor de volgende 60 min, in overeenstemming met de simulatieresultaten voor gradiënt stabiliteit. Het opsporen van de reis weg en morfologievan de cellen maakt kwantitatieve metingen en latere vergelijking van de chemotaxis gedrag met een chemotaxis index die totale weglengte, snelheid, gerichtheid en rondheid van de cellen (Figuur 2B) omvat. Totale weglengte is de som van de lengtes van de lijnsegmenten verbinden van de hartlijnen van de pad. Wordt verkregen wanneer de totale weglengte delen door de tijd. Directionaliteit opwaarts gemeten en wordt gedefinieerd als: (Y coördinaat van het einde van het pad minus Y-coördinaat van het begin) gedeeld door de totale weglengte. Dit geeft 1,0 voor een object te bewegen direct omhoog. De rondheid van de cel een maat (in procenten) van hoe efficiënt een bepaalde hoeveelheid omtrek omsluit gebied. Een cirkel heeft het grootste voor een bepaalde omtrek en een rondheid parameter van 100%. Een rechte lijn omsluit geen gebied en heeft een ronding parameter van 0%. We tonen de kwantitatief gemeten chemotaxis praktijken zoals door de geselecteerde parameters chemotaxis(Figuur 2C).

Monitoring PKD subcellulaire lokalisatie in HL60 cellen onder een spatiotemporeel zichtbaar en controleerbaar fMLP stimulus

Het is een grote technische vooruitgang van toepassing voor fluorescent gelabelde en controleerbaar chemoattractant stimulatie om een ​​experimenteel systeem. Historisch gezien hebben we ofwel homogene (ook wel uniform) stimulatie of gradiënt stimulatie naar cel respons en gedrag te observeren toegepast. Echter, "blind" stimulatie geeft niet alleen geen tijdruimtelijke informatie over hoe de stimulus de cellen bereikt, maar werpt ook twijfel op een 'abnormale' waarnemingen van cel respons op stimulatie, simpelweg omdat wij niet de stimulus te zien. We hebben eerder aangetoond dat fluorescerende kleurstof (alexa594) kan worden toegepast chemoattractant een lineair verband tussen chemoattraetantconcentratie en m stellenonitored fluorescerende kleurstof intensiteit 15. Met een overname configuratie van groen fluorescerend eiwit (GFP), een rode emissie van fluorescerende kleurstof (alexa594) en doorvallend licht, kunnen wij de hechtende cellen, de toepassing van de stimulus en de celrespons op de stimulus te volgen (figuur 3A). Proteïne kinase D is een familie van serine / threonine kinasen die een essentiële rol in gerichte celmigratie 9,17 spelen. In reactie op eenvormige wijze worden toegepast fMLP (rood) stimulatie, HL60 cellen bemiddelen een robuust membraan translocatie van GFP-gelabelde proteïne kinase D1 (groen) (Figuur 3B en Movie 2). In een fMLP gradiënt (rood) (Figuur 4A), HL60 cellen actief werven PKD1 aan de voorrand (figuur 4B en Movie 3). Een goede vergelijking van de subcellulaire lokalisatie van GFP in het uitsteeksel van de voorrand aangeeft dat PKD1 lokaliseert aan de achterzijde van de voorrand (Figuur 4C).

figure-results-1
Figuur 1. Cell mobiliteitsanalyse apparaat kunnen maximaal 6 gelijktijdige chemotaxis assays. (A) Schema toont de opbouw van een mobiliteit celanalyse chiphulpmiddel voor gelijktijdige controle van 6 onafhankelijke chemotaxis assays. Rode shows chemoattractant toegevoegd aan de putjes. (B) Invoering van HL60 cellen in de putjes van de cellen, terwijl de chemoattractant verspreidt tot een gestage fMLP gradiënt vast te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Gelijktijdig weergeven van meerdere chemotaxis assays met HL60 cellen. (A ) Montage toont beelden van celbeweging analyseapparaat chemotaxis assay om de remmende effecten van PKD-specifieke remmers op chemotaxis in tijden van 0 en 12 minuten na gradiënttoepassing onderzoeken. Chemotactische HL60-cellen werden voorbehandeld met PKD 1 uM remmer CID755673 gedurende 30 min. HL60 cellen met of zonder behandeling van PKD remmer mochten chemotax in beide RPMI1640 medium uitgehongerd of 100 nM fMLP gradiënten voor 12 min. (B) Regeling toont de lengte reis pad en de morfologie van getraceerd HL60 cellen. (C) Kwantificering van chemotaxis als totale weglengte, snelheid, gerichtheid en rondheid. De gemiddelde ± SD wordt getoond; n = 10, 12, of 11 voor geen verloop, fMLP gradiënt zonder CID755673 behandeling, en de behandeling fMLP met CID755673 behandeling, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. GPCR-gemedieerde robuuste membraan translocatie van PKD1 reactie op eenvormige wijze worden toegepast fMLP stimuli. (A) Multichannel monitoring van PKD1-GFP (groen), chemoattractant (1 uM fMLP gemengd met 0,1 ug / ml fluorescerende kleurstof Alexa 594, red) en DIC (differentieel interferentie contrast) aan de hechtende HL60 cellen te identificeren in een putje van een 4well kamer bekleed met 0,2% gelatine in RPMI 1640 medium. Schaal bar = 10 micrometer. (B) Montage blijkt dat eenvormige wijze worden toegepast fMLP (rood) induceert robuust membraan translocatie van PKD1-GFP (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figure 4. Leading rand lokalisatie van PKD1 in chemotaxing HL60 cellen. (A) Kanaalmodus overname configuratie vergemakkelijkt de visualisatie van de fMLP gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van PKD1. A - C, HL60-cellen tijdelijk tot expressie gebracht GFP-gelabeld PKD1; de fMLP gradiënt gegenereerd uit een micropipet (DIC), 100 nM fMLP (rood) te visualiseren werd gemengd met 0,1 ug / ml fluorescerende kleurstof Alexa 594 (B) Verrijkte lokalisatie van PKD1 aan de voorrand van de chemotaxing cel. Schaal bar = 10 micrometer. (C) Samengevoegd beelden tonen dat PKD1 lokaliseert aan de achterzijde van de voorrand van HL60-cellen. Green toont PKD1 cellulaire lokalisatie, en het beeld van de DIC toont het uitstekende deel van de leading edge. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In deze studie tonen we twee voorbeelden van chemotaxis assays: eerste gelijktijdige controle van meerdere chemotaxis assays door de cel mobiliteitsanalyse inrichting; en anderzijds visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van signaleringsgebeurtenissen in dezelfde cellen in real time.

mobiliteit cel analyse-apparaat voor meerdere gelijktijdige chemotaxis assays

In de huidige studie, introduceerden we een gedetailleerd protocol om meerdere gelijktijdige chemotaxis assays met behulp van een mobiliteit cel analyse-apparaat uit te voeren. Dit apparaat kan de gebruiker cellulaire chemotaxis gedrag te observeren met een 10x objectief in conventionele bright-field observatie. Door de diffusie-dominante eigenschappen van de fluïdumstroom, de mobiliteit cel analyseapparaat genereert hoge mate voorspelbaar, stabiel verlopen en kunnen maximaal zes chemotaxis assays gelijktijdig worden uitgevoerd. De kritische stappen van het protocol zijnbetrouwbare gradiënten te krijgen en om de cellen af ​​te stemmen op het terras lijn. De gebruiker moet strikt aan de instructies van de fabrikant voor de houder montage en injectie van chemoattractants en cellen. Gedetailleerde instructies zijn ook online beschikbaar. Vergelijking met alternatieve methoden chemotaxis 11-13,15 Deze inrichting verbetert de betrouwbaarheid en efficiëntie van chemotaxis assays. Vier groottes van celbeweging analyseapparaat chip afmetingen van 4, 5, 6 en 8 urn zijn beschikbaar voor verschillende types en groottes van cellen tegemoet. We vonden dat een 4 of 5 urn mobiliteit celanalysesysteem chiphulpmiddel geschikt voor HL60 en D. discoideum cellen, die ongeveer 10-15 urn in diameter. Echter één beperking is dat deze inrichting niet geschikt voor alle soorten cellen. We hadden weinig succes met behulp van de mobiliteit cel analyse apparaat chemotaxis assay met Raw267.4 cellen. De reden hiervoor kan zijn dat Raw267.4 cellen migreren te langzaam. De tijd die nodig is voor een efficiënte chemotaxis van Raw267.4 cellen zou veel langer dan de tijd een helling wordt onderhouden door het apparaat. In plaats daarvan, een transwell migratie test werkte goed voor Raw267.4 cellen 9. Een andere beperking is dat fluorescerende waarneming is niet mogelijk met de huidige inrichting. Een toekomstige richting is om fluorescerende beeldvorming monitor met hogere vergroting. Dit is mogelijk met de toegenomen mobiliteit cel analyseapparaat, dat is uitgerust met fluorescentiedetectie en een 100x objectief. Bovendien is het aantal gelijktijdige assays verhoogd tot 12. Al deze verbeteringen vergemakkelijken de verhoogde doorvoer van chemotaxis assays en waarnemingen van subcellulaire dynamiek in migrerende cellen.

Hoge transfectie-efficiëntie van HL60 cellen fluorescerend eiwit gelabeld eiwit expressie

HL60 cellen zijn een actief delende leukemie cellijn en te groeien in suspensie. Zoals eerder gemeld 18-20, HL60 cellen resistent tegen gene overdracht. Zowel lipide en elektroporatie genoverdracht zijn getest en hogere transfectie-efficiëntie werd verkregen met elektroporatie, zoals beschreven in hoofdstuk 4. Het verkrijgen van hoge levensvatbaarheid na elektroporatie is essentieel voor het verkrijgen van hoge transfectie efficiëntie vanwege de ernstige schade als gevolg van elektroporatie. Vervolgens worden grondige en voorzichtige behandeling cel nodig, vooral na elektroporatie. Alle media voorverwarmd en voorzichtig toegevoegd aan de cellen in elk stappen na elektroporatie zijn. Het is ook kritisch om de belichtingstijd van de cellen aan elektroporatie reagens minimaliseren. Celdood voorkomen na elektroporatie, RPMI 1640 elektroporatie herstelmedium onmiddellijk worden toegevoegd aan de cellen. We vonden dat 20% FBS in het herstel medium geeft een veel hogere cel recovery rate dan 10% FBS. Na elektroporatie, incubatie in RPMI 1640 medium elektroporatie terugwinning voor 30 min kritisch grotere levensvatbaarheid en transfectieefficiency. De transfectie efficiëntie verder te verhogen, gebruikten we ook 4 ug plasmide-DNA per transfectie, wat bijna tweemaal hoeveelheid plasmide aanbevolen door de fabrikant.

Er zijn twee belangrijke beperkingen op elektroporatie transfectie de vergankelijkheid van de eiwitexpressie en celaantal grens (2 x 10 6 cellen per transfectie). In ongedifferentieerde cellen, expressie detecteerbaar alleen tijdens de eerste paar celdelingen, aangezien het vectorplasmide wordt verdund met de helft na elke celdeling. Voor de gesplitste HL60 cellen overleven niet meer dan 48 uur. Dientengevolge vereist een experiment vers transfecties 6 uur voorafgaand aan het experiment. Het aantal cellen voor één elektroporatie voldoet alleen de minimale eis voor een biochemische assays. Met het oog op herhaald gebruik of grote hoeveelheden, is het sterk aanbevolen dat een ongedifferentieerde HL60 cellijn worden vastgesteld die stabiel tot expressie brengt het eiwit van belang whilech is gelabeld met een fluorescerend eiwit met een virale vector, of een virale vector is verkrijgbaar of kunnen worden geconstrueerd.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang voor dit werk.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door het intramuralfonds van NIAID, NIH.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI 1640 Medium GlutaMAXLife technologies61870-036
Sodium pyruvateThermo Fisher Scietific11360-070
Fetal bovine serumGemini Bio-Products100-106
1 M HEPES steriele oplossing, pH 7.3Quality Biological Inc.A611-J848-06
Penicilline streptomycine oplossingFisher Scientific15140122
NucleofectorTM 2bLonzaAAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V inclusief NucleofectorTM oplossing, enkelvoudige pijpetten, AmaxaTM gecertificeerde 100 ml aluminium elektrodencuvettesLonzaVCA-1003
Lab-Tek kamer #1.0 Borosilicaat dekglasNalge Nunc International Inc155383
2% Gelatine oplossingSigma-AldrichG1393
FibronectineSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)Life technologies14025-076
Bovine serum albumineSigma-AldrichA3803
Lab-Tek II dekglaskamers met één putNalge Nunc International Inc155361
Lab-Tek II dekglaskamers met vier puttenNalge Nunc International Inc155383
Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-10438
fMLPSigma-AldrichF3506-5MG
Dekglastiktheid (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScanEffector Cell Institute, Inc.MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm)Effector Cell Institute, Inc.EZT-F01-5
1701RN 10 μl spuitHamilton80030
Femtotips II injectietipsEppendorf5242956003
Femtotips IIEppendorf930000043
TransferMan NK2, inclusief motormodule, X-kop met hoekversteller en positioneringshulpmiddelen. Eppendorf5188900056
DIAS softwareSolltech Inc.
LSM 780 META of gelijkwaardige confocale microscoop met een 40X 1.3 NA of 60X 1.4 NA olie DIC Plan-Neofluar objectieflensCarl Zeiss

Referenties

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309(2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1(2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

Herprints en machtigingen

Tags

Chemotaxis-assaysG-eiwitgekoppelde receptorenmicrofluïdicacelmigratiefluorescerende kleurstofkinasetranslocatiereal-time imaginganalyse van celmobiliteitgradiëntvisualisatie
Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.