Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor acute skeletspier regeneratie bij volwassen muizen en latere manipulaties van de spieren, zoals dissectie, bevriezen, snijden, routine kleuring en myofiber dwarsdoorsnede analyse induceren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Skeletspier aanpassing een fysiologisch proces dat plaatsvindt bij volwassen skeletspieren als reactie op letsel of ziekte. Acute verwonding geïnduceerde skeletspier aanpassing een veel gebruikt, krachtig modelsysteem om de gebeurtenissen betrokken bij spierregeneratie alsook de mechanismen en verschillende spelers bestuderen. Inderdaad, een gedetailleerde kennis van deze werkwijze is essentieel voor een beter begrip van de pathologische omstandigheden die leiden tot skeletspier degeneratie, en het helpt bij het identificeren van nieuwe gerichte therapeutische strategieën. De huidige werk beschrijft een gedetailleerd en reproduceerbare protocol voor acute skeletspier regeneratie in muizen te induceren via een enkele intramusculaire injectie van cardiotoxine (CTX). CTX behoort tot de familie van slangengif toxines en veroorzaakt myolyse van myovezels, die uiteindelijk leidt tot de regeneraties. De dynamiek van de skeletspieren regeneratie wordt geëvalueerd door histologische analyse van de spier secties. Het protocol ooktoont de experimentele procedures voor het ontleden, het invriezen en het snijden van de tibialis anterior spier, en de routine hematoxyline en eosine kleuring die op grote schaal wordt gebruikt voor latere morfologische en morfometrische analyse.
Inleiding
Zoogdieren volwassen skeletspieren worden gevormd door groepen van fascicules van meerkernige spiercellen (spiervezels), die gespecialiseerd zijn voor samentrekking zijn. Elke spiervezeloriėntaties een langwerpig syncytia, omringd door de sarcolemma (plasmamembraan) en die myofibrils, die bestaan uit regelmatig en herhaaldelijk georganiseerde contractiele eiwitten (actine en myosine filamenten). Bij volwassen leven en in rusttoestand, skeletspieren hebben een zeer lage omzet van hun myonuclei 1; inderdaad, de myonuclei, die zich aan de rand van de spiervezeloriėntaties onder sarcolemma worden aangehouden in de G0-fase van de celcyclus en niet in staat te prolifereren 1,2.
Skeletspieren hebben de bijzondere mogelijkheid om te regenereren na schade, het bereiken van homeostase na een aantal gebeurtenissen van weefselremodellering die nauw verwant zijn aan elkaar. Na een acuut letsel of trauma, degeneratie wordt veroorzaakt, gevolgd door regeneratie processendat verschillende celpopulaties, met inbegrip van een bevolking van spiercellen te betrekken, de satelliet cellen (SCS). Inderdaad, bij gebrek aan omgevingsstimuli, de satelliet cellen in een rusttoestand en bevinden zich in een niche tussen de sarcolemma en de basale lamina 3,4. Na een verwonding of ziekte, SC's geactiveerd worden, prolifereren, te migreren naar het beschadigde gebied, en uiteindelijk differentiëren, die aanleiding geven tot nieuw gevormde myovezels 5. Geactiveerde SC stellen cross-talk met verschillende celpopulaties, voornamelijk ontstekingscellen, die worden aangeworven in de plaats van trauma 6-8. Deze overspraak laat de cellen een gereglementeerd paradigma waarmee moleculaire signalen rijden structurele veranderingen volgen, uiteindelijk leidend tot 9 homeostase. Bovendien SC, inflammatoire en interstitiële cellen, angiogene processen en reïnnervatie gebeurtenissen betrokken stelt een gecoördineerde wijze repareren goed georganiseerde en specialized structuur.
Er is grote belangstelling voor het bestuderen van verschillende aspecten van skeletspieren regeneratie niet alleen de fysiologie van de spier te begrijpen, maar ook voor therapeutische strategieën die diepere kennis over het gehele proces te verbeteren. Verschillende experimentele benaderingen zijn beschikbaar om de identiteit en functie van de verschillende celpopulaties, de signaalwegen en de moleculaire mechanismen te bestuderen. Muismodellen van acuut letsel vormen een krachtig hulpmiddel om vele aspecten van dit proces te onderzoeken. Andere gewoonlijk gebruikte technieken voor het induceren van acute spierschade kunnen onderzoekers het regeneratieproces volgen in vivo, van het prille begin tot het einde van het proces. Dit protocol beschrijft de stappen van de intramusculaire injectie van slangengif-afgeleide cardiotoxine (CTX), die myolyse induceert en activeert het regeneratieproces tot de analyse van weefselmonsters. Na CTX injectie, mice kunnen op verschillende tijdstippen opgeofferd afhankelijk experimentele eisen en de skeletspieren kan worden uitgesneden en verwerkt voor verdere analyse. Tenslotte beschrijven we de kleuring protocol van het weefsel secties om morfologische observaties en fundamentele kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit protocol maakt het onderzoek naar acute skeletspier regeneratie in vivo op zeer reproduceerbare wijze 10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierlijke onderzoek en door het ministerie van Volksgezondheid, diergezondheid, voeding en voedselveiligheid van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid in overeenstemming met de wet op de dierproeven goedgekeurd. Cervicale dislocatie procedures kan variëren van instelling tot instelling op basis van IACUC of het equivalent daarvan eisen.
1. cardiotoxine Injectie in de tibialis anterior
- Bereid een 10 pM werkoplossing van cardiotoxine (CTX) door verdunning van de voorraadoplossing cardiotoxine in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of in water voordat de procedure.
Opmerking: CTX is oplosbaar in water bij 1 mg / ml. Bereid een 70 uM voorraad oplossing. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. CTX voor dit protocol is een mengsel van cardiotoxins met een molecuulgewicht van ongeveer 7000 Da.
LET OP: Er wordt voorgesteld om te dragendubbele handschoenen, een hygiëne masker en een veiligheidsbril (als alternatief een veiligheidsbril, is het raadzaam om te werken onder een kap) en zeer voorzichtig zijn om elk contact met de oplossing te voorkomen, zelfs indien verdund. - Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine (80 mg / kg en 10 mg / kg lichaamsgewicht) of andere erkende beschikbaar verdoving.
- Met de muis naar boven, spuit de achterste ledematen met 70% ethanol. De exacte locatie van de tibialis anterior (TA) spier met behulp van een scalpel visualiseren knip het haar weg van het voorste deel van het onderbeen onder de knie.
Opmerking: De TA spier voort uit het proximale lichaam van de tibia, naar beneden lateraal van het bot en eindigt bij de enkel. Zijn lange pees zich uitstrekt tot in de voet over de enkel (zie figuur 1A). - Teken ~ 100 pi van de oplossing in de spuit door zachtjes trekken van de zuiger.
- Verwijder luchtbellen, die de spuit rechtop (met de naald naar boven). Trek de zuiger en tik de zijkant van de spuit om luchtbellen aan de binnenkant van de buis omhoog komen. Langzaam druk op de zuiger om grote luchtbellen vrij te laten. Een paar druppels vloeistof komt uit de naald. Op dit punt, zorg ervoor dat de vloeistof weer op te halen in de buis en niet verspreiden het, gezien de toxiciteit van cardiotoxine.
- Zuig de oplossing in de spuit totdat de gewenste dosis is bereikt. Injecteer 20 pi van CTX oplossing bij TA spier.
- Steek de naald in het midden van de TA door de positie van de tibia als leidraad van de pees aan de knie. Omdat de TA is een dunne weefsel, de injectie toe zonder al te diep (steek de naald 2/3 mm diep, op ongeveer 10 ° tot 20 ° hoek), en te voorkomen dat verder gaat dan de spier zelf (Figuur 1A).
- Trek niet de naald direct na de injectie, maar wacht 2-3 s te lekken te voorkomenleeftijd CTX druppels uit de spier.
- Na de procedure, plaatst de kooi op een verwarmingsplaat (bij 37 ° C) totdat de muizen wakker zijn, omdat de verdoving en het ethanol verminderen lichaamstemperatuur.
2. tibialis anterior Isolation
Opmerking: Spieren kunnen op verschillende tijdstippen na injectie cardiotoxine worden geïsoleerd volgens experimentele eisen.
- Offer de muis door cervicale dislocatie.
- Spuit de achterpoten met 70% ethanol. Tijdens de procedure, kan het dier worden bevestigd aan een drager om het te houden.
- Snijd de huid op het niveau van de proximale pees (boven de voet), plaatst een van de bladen van de schaar onder de huid, en snijd de huid omhoog, in de richting van de knie. Met behulp van een tang, trek de huid en bloot de spieren geheel. Verwijder voorzichtig alle van de huid en het haar uit het gebied van belang.
- Elimineer de fascia door langzaam te knijpen of snijden (met thin-tip pincet of fijne micro ontleden schaar) de uiterste omtrek van de spier aan de andere zijde van de tibia (figuur 1B). Zodra gebroken, verwijder voorzichtig de fascia met behulp van dunne-tip pincet; beschadiging van de onderliggende spier.
Opmerking: Zoals voor andere spieren en organen, wordt de TA onder fascia (diepe fascia of het been), een dunne laag bindweefsel dat ligt diep onder de huid en die moet worden verwijderd om de onderliggende spier gemakkelijk isoleren. - Visualiseer de distale TA pees en extensor digitorum pees boven de voet, die naast elkaar zijn geplaatst. De pees van de extensor digitorum Longus (EDL) spier ligt iets onder de TA pees. Pezen van volwassen muizen met het blote oog.
- Verwijder de TA spier na één van de twee volgende technieken:
- Snijd beide pezen met een fijne micro ontleden schaar en trek ze naar de proximale zijde, holding de pezen met een tang. Scheid de twee pezen, ze zachtjes te trekken in tegengestelde richting naar de spieren te scheiden.
- Met behulp van dunne-tip pincet, scheiden het distale TA pees van de extensor digitorum pees door het passeren van de punt onder de pees zelf (Figuur 1C, bovenste afbeelding). Schuif de pincet onder de TA om het scheiden van de onderliggende spieren (figuur 1C, onderste foto).
- Houd de pincet onder de spier te houden iets verhoogd, snijd de TA pees, en trek het voorzichtig omhoog totdat alleen het gebied onder de knie is bevestigd (figuur 1D, foto links). Snijd de TA onder de knie na de rand van de spier met de schaar (figuur 1D, rechter afbeelding).
Let op: Als de spier licht blijft bevestigd aan de zijkanten, maken gebruik van fijne micro ontleden schaar om te helpen verwijder.
Let op: Als de tang niet gemakkelijk onder de TA passen,is het mogelijk dat de fascia niet volledig is verwijderd, en het kan nog steeds zichtbaar bovenop de spier. In dit geval is de fascia volledig te verwijderen voordat u verder gaat.
3. Fresh Frozen Muscle Techniek
- Plaats een kleine hoeveelheid tragacanth gom of een soortgelijk kleefmiddel bevriezing verbinding (bijv optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding) op een schijfje kurk. Label slice de kurk op de achterzijde voor het invriezen, indien nodig (Figuur 2A).
- Teneinde dwarsdoorsneden van de spier te verkrijgen, zinken de TA in de tragantgom aan door de distale pees en waardoor ongeveer 3/4 van de spieren buiten en zorg ervoor dat de spier in een loodrechte positie ten opzichte van de kurk (Fig 2A).
- Vul een aluminium blikje (als alternatief, een metalen beker of een glazen beker), met isopentaan. Hang de blik isopentaan in een Dewar met liquid stikstof te zorgen dat het stikstof in het blik te openen.
Opmerking: Isopentaan moet de juiste temperatuur heeft bereikt (van -150 tot -160 ° C) voor een optimale invriezen van het weefsel. De juiste temperatuur is bereikt wanneer sommige witte vaste deeltjes op de bodem van de kan en de isopentaan wordt iets viskeus.
Opmerking: de steekproef niet bevriezen vóór de vorming van de vaste deeltjes, omdat het kan leiden tot bevriezing artefacten. Anderzijds, als de isopentaan wordt volledig vast, laat het op kamertemperatuur totdat het ontdooid, ervoor zorgen dat sommige witte deeltjes nog aanwezig. - Met behulp van een tang Mixter, snel dompel de kurk met de spier in de isopentaan, waardoor de spier geplaatst omlaag, en zorg ervoor dat de kurk los wanneer deze volledig is ondergedompeld in de vloeistof. Zo terwijl het monster drijft alleen de achterzijde van de kurk moet zichtbaar in de vloeistof.
- Laat de sample in isopentaan gedurende 1 min.
- Met behulp van een tang Mixter (of soortgelijke tang), neemt u de spieren en onder te dompelen in vloeibare stikstof gedurende minstens 2 min.
- Wikkel de monsters afzonderlijk in geëtiketteerde aluminiumfolie en ze onmiddellijk plaatsen in droogijs (-70 ° C), of direct op te slaan ze in een -80 ° C vriezer.
Opmerking: Door de procedure van stap 3,4-3,7, is het uiterst belangrijk dat de juiste temperatuur te houden en te voorkomen dat de monsters van ontdooien (bijvoorbeeld tijdens de overdracht naar de -80 ° C vriezer.). De temperatuurstijging leidt tot ongecontroleerde ontdooien en opnieuw bevriezen van het water microkristallen die aanwezig in het weefsel en uiteindelijk leidt tot de vorming van artefacten of afbraak van spiervezels (gevisualiseerd op de weefselcoupes zo groot wit gat in het midden van de vezel).
4. cryostaat Opdeling van Frozen Spieren
- Stel de cryostaat kamer temperatuur to -20 tot -22 ° C.
- Zet het monster stub, het mes en het model in de cryostaatkamer, zodat ze equilibreren gedurende ten minste 30 min.
- Plaats een kleine hoeveelheid van het bevriezen van verbinding (bv oktober compound) op het monster stomp en dompel de kurk met het monster vóór het invriezen verbinding stolt. In de tussentijd zet het mes in de bladhouder.
- Lijn het model en het mes met behulp van de meegeleverde schroeven om het monster houder met het mes houder (Figuur 2B) oriënteren.
- Stel de snijdikte tot 10 pm. Ga verder met het weefsel te snijden. Voor elke omwenteling van het aandrijfwiel, de monsterhouder voorschotten een gecontroleerde afstand naar het mes.
- Leg de secties over een gepolariseerde dia (8-10 sectie per dia) (figuur 2C).
- Na het snijden, slaan de dia's bij -80 ° C.
Opmerking: Het monster kan in een -80 ° C vriezer bewaard en hergebruikt voor further snijden, mits goed behandeld en opgeslagen.
5. Routine histologische kleuring (hematoxyline & eosine Stains)
Opmerking: Verscheidene histologische kleuringen kan volgens de analyse worden uitgevoerd op spier- secties. Een routine histologische vlek voor morfologische en morfometrische analyse is de hematoxyline & eosine (H & E) bichromic vlek. De hematoxyline vlekken de kernen een diep paars. Nucleaire kleuring is tegengekleurd met eosine (roze / rood), die eosinofiele structuren, zoals de spiervezels in het cytoplasma vlekken.
- Volledig lucht drogen bevroren dia met secties voor 10 - 15 minuten bij kamertemperatuur, het indienen van de dia's in een kleuring lade en zet de schaal in een kleuring trog.
- Kleur wordt 1 minuut met hematoxyline.
- Leg de vlekken trog in het kader van een vrij zwak kraan waterstraal gedurende 10 minuten te spoelen de hematoxyline.
- Dompel de dia's gedurende 5 minuten in 95% ethanol, als een alcoholische oplossing van eosine zal worden gebruikt (overslaan tstap zijn bij een waterige oplossing eosine).
- Tegenkleuring gedurende 1 min met eosine-oplossing.
- Spoelen met water aan overmatige eosine oplossing te elimineren.
Let op: Optimale timing van de kleuring met ofwel hematoxyline en eosine moeten worden gedefinieerd voor elke nieuwe batch. - Dehydrateer de monsters in een ethanolreeks: 50% en 70% (enkele seconden). Snel onderdompelen in 95% ethanol, gevolgd door 2 veranderingen in 100% ethanol, 5 minuten elk.
- Clear in 2 veranderingen van xyleen, elke 5 minuten of langer. Deze stap moet in het kader van een chemische kap worden uitgevoerd.
- Monteer de glaasjes met een xyleen basis van montage medium, het toepassen van een paar druppels fixeermiddel op de slede en die met een dekglaasje. Het fixeermiddel kan ook worden toegepast op het dekglaasje en het dekglaasje gezet op de slede.
- Vermijd de vorming van luchtbellen tussen de glijbaan en het dekglaasje. Om luchtbellen te verwijderen, houdt u de dia verticale (na montage) en knijp het overtollige mounting medium en luchtbellen door voorzichtig drukken op de dekglaasje met stompe pincet (of een soortgelijk stomp voorwerp).
- Houd de dia's onder de motorkap voor een paar uur of 's nachts te laten de xyleen verdampen volledig alvorens over te gaan tot de analyse.
- Voer de morfologische en morfometrische analyse van H & E gekleurde secties regenererende spieren door niet-overlappende seriële beelden van ten minste één volledig spiersectie per muis. Maak foto's met een heldere-veld microscoop met 20x vergroting.
Opmerking: Een minimum van 5 muizen wordt aanbevolen om de statistische significantie van de metingen te verkrijgen.
Opmerking: Afbeelding analyse software is beschikbaar voor dit doel, zoals de gratis te downloaden software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
H & E kleuring maakt de evaluatie van de morfologie van het regeneratieproces op specifieke tijdstippen tijdens skeletspier regeneratie. Figuur 3 toont het tijdsverloop analyse uitgevoerd op TA geblesseerde spieren van wildtype muizen. Spieren zijn geïsoleerd op 3, 7, 15 en 30 dagen na injectie CTX, zoals schematisch weergegeven in figuur 3A. Representatieve foto's van H & E-gekleurde dwarsdoorsneden tonen de dynamiek van de skeletspieren her...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een protocol om acuut letsel in de skeletspier (dat wil zeggen, de intramusculaire injectie van CTX) induceren. Het wordt veel gebruikt als een krachtig instrument om de dynamiek van de skeletspier regeneratie in vivo te bestuderen. CTX injectie induceert de degeneratie van spiervezels, die wordt veroorzaakt door de depolarisatie van de sarcolemma en contractie van de vezels 12, en leidt tot de cascade van gebeurtenissen die leidt tot spierregeneratie. Skeletspieren ontle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken het Animal House en de Integrated Microscopy Facilities van IGB-CNR. Dit werk heeft geprofiteerd van onderzoeksfinanciering uit het Zevende Kaderprogramma van de Europese Gemeenschap in het project ENDOSTEM (Activering van vaatgeassocieerde stamcellen en spiervezels voor de reparatie en het onderhoud van spierweefsel, subsidieovereenkomstnummer 241440), het Italiaanse Ministerie van Onderwijs-Universiteit-Onderzoek (MIUR-PRIN2 010-2011) aan G.M. en S.B. en PON Cluster IRMI aan G.M., en de CARIPLO-stichting aan G.M. en S.B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Referenties
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
