Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Summary

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Abstract

Het identificeren van de moleculaire doelwitten van kleine moleculen is een uitdagende maar noodzakelijke stap om hun werkingsmechanisme te begrijpen. Hoewel er verschillende methoden voor doelwitidentificatie zijn ontwikkeld en gebruikt om met succes de bindingseiwitten van een verscheidenheid aan kleine moleculen op te helderen, hebben deze technieken nadelen die ze ongeschikt maken voor het detecteren van bepaalde soorten interacties tussen kleine moleculen en doelen. Met name niet-covalente interacties die afhankelijk zijn van native cellulaire omstandigheden, zoals die van membraaneiwitten waarvan de structuren kunnen worden verstoord bij cellyse, zijn vaak niet geschikt voor op affiniteit gebaseerde doelwitidentificatiemethoden. Hier demonstreren we een methode waarbij een sonde met een fotolabiele groep wordt gebruikt om covalent te crosslinken met het eiwit dat kleine moleculen bindt binnen de omgeving van de levende cel, waardoor de detectie en isolatie van het doeleiwit mogelijk is zonder dat de interactie na cellyse hoeft te worden onderhouden. Deze techniek is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologisch interessante kleine moleculen met onbekende mechanismen, zowel in de context van fundamentele biologie als in de geneesmiddelontdekking.

Introduction

Bioactieve kleine moleculen fundamenteel werkt door interactie met de functie van één of meer "target" moleculen, meestal proteïnen veranderen, in de cel. In drug discovery, wanneer een werkzame verbinding wordt ontdekt door fenotypische screening, identificatie van de moleculaire target (s) van die verbinding is essentieel, niet alleen voor het begrijpen van het werkingsmechanisme en de mogelijke bijwerkingen van de verbinding, maar ook potentieel ontdekken nieuwe biologie ten grondslag liggen aan de ziekte model en de weg effenen voor de ontwikkeling van nieuwe mechanistische klasse van therapeutische middelen ^1. Hoewel target identificatie is niet vereist voor een geneesmiddel om therapeutisch worden gebruikt, in de afgelopen jaren is er een toenemende erkenning dat nieuwe kandidaat-geneesmiddelen hebben meer kans om te slagen in klinische studies, en dus geven een beter rendement op de investering, als een gevalideerde doelwit is bekend ^2. Er is dus een groeiende interesse in werkwijzen voor het identificeren van kleine geweestmolecule doeleiwitten.

Een klassieke doel identificatieexperiment vertrouwt typisch op affiniteitszuivering, waarbij het ​​kleine molecuul van belang wordt geïmmobiliseerd op een hars en geïncubeerd met lysaten van gehele cellen, waarna ongebonden eiwitten weg gewassen en de resterende eiwitten worden geëlueerd en geïdentificeerd ^3. Hoewel deze techniek is gebruikt om de doelstellingen van vele kleine moleculen identificeren ^4, is ongeschikt als een universele prisma ID methode om verschillende redenen. Ten eerste moet het doeleiwit de natieve conformatie na cellyse om zijn vermogen te binden aan de kleine molecule behouden blijven. Dit kan bijzonder problematisch voor membraaneiwitten, die vaak conformatieveranderingen ondergaan na hun natieve omgeving verwijderd of gewoon aggregaat en neerslaan uit oplossing. Ten tweede moet het kleine molecuul chemisch worden gemodificeerd zodanig dat deze kan worden geïmmobiliseerd op de hars behoudhet vermogen om het doeleiwit binden. Diepe bindingsholtes kan dus niet toegankelijk voor een klein molecuul zodra het is bevestigd aan de hars. Ten derde moet de bindingsaffiniteit voldoende hoog zijn dat de interactie wordt gehandhaafd tijdens de wasstappen, waardoor identificatie van lagere affiniteit interacties uitdaging. Ten vierde, omgevingsfactoren zoals pH, ionconcentratie of de aanwezigheid van andere endogene moleculen ruimtelijk variëren binnen de cel en soms voorwaarden geneesmiddelresistente targetinteracties. Aldus vinden van de juiste voorwaarden te scheppen en handhaven binding buiten de cel kan een aanzienlijke hoeveelheid trial and error vereist.

Fotoaffiniteitslabeling omzeilt deze problemen doordat de covalente binding van een klein molecuul en het doel binnen de context van een natieve cel. In plaats van het immobiliseren van het kleine molecuul een grote volumineuze hars, wordt het molecuul in plaats chemisch gemodificeerd om twee kleine functionele g installerenroups: een fotoactiveerbare groep die covalente verknoping mogelijk maakt om het doeleiwit bij bestraling met een bepaalde golflengte van licht, en een reporter groep waarmee het doeleiwit te detecteren en vervolgens geïsoleerd. Levende cellen worden behandeld met de affiniteit probe bindt de probe en covalent verknoopt aan het doeleiwit en het probe-eiwitcomplex wordt vervolgens geïsoleerd intact. De specificiteit van de probe binden aan het doelwit wordt aangetoond door het uitvoeren van een competitie experiment in parallel, waarbij een overmaat van de moederverbinding wordt gebruikt om te concurreren weg binding van de probe aan het doelwit eiwit.

Het ontwerp en de synthese van affiniteit probes varieert sterk van de ene klein molecuul naar de andere, en zal niet worden behandeld in dit protocol; hebben echter een aantal uitstekende discussies over het onderwerp gepubliceerd ^5-9. De belangrijkste overweging is dat de sonde blijft de biologische activiteit van de moederverbinding derhalve presumably binding aan hetzelfde doel (en). Structuur-activiteitsrelaties (SAR) studies moeten worden uitgevoerd om te bepalen welke delen van het molecuul kan worden gewijzigd zonder verlies van bioactiviteit. Een verscheidenheid van verschillende chemische groepen zijn gebruikt als fotoactiveerbare crosslinkers, zoals diazirine, benzofenon, azide en aryl, die elk voor- en nadelen ^10. Ook zijn er meerdere reporter labels die zijn gebruikt om probe bindende eiwitten te isoleren. Reportergroepen kunnen functioneel op zichzelf, zoals de algemeen gebruikte biotine of fluorescente labels, of kan precursors dat verdere functionalisering na de fotoverknoping stap, die het voordeel dat kleinere en dus minder gemakkelijk bioactiviteit ¹¹ compromis vereisen.

In dit protocol, hebben we een affiniteit probe die een diazirine fotoverknoping groep, en een terminale alkyn voor de bevestiging van een reporter-groep door een Cu (I) gebruikte -catalyzed azide-Acetyleenalkoholen Sharpless-Huisgen cycloadditie (of klik) reactie ^12-15. De SAR studies probe ontwerp en synthese, en de resultaten van deze onderzoeken zijn elders gepubliceerd ^16-18.

Protocol

LET OP: Dit protocol werd aangepast van MacKinnon en Taunton ¹⁰ voor gebruik in levende cellen.

1. Bereiding van gekweekte cellen

1. Bereid steriele 6-cm celcultuurschalen het gewenste aantal monsters (zie hieronder).
   LET OP: Een gerecht van de cellen wordt gebruikt per behandeling staat, maar als er meer eiwit nodig is 2 of 3 gerechten worden bereid per staat en gecombineerd na UV straling.
   1. Maak minstens 3 gerechten van de cellen; Negatieve controle met alleen DMSO (D), alleen Probe behandeling (P), en probe concurrent + (C).
   2. Eventueel stelt een 4 ^th schotel als geen UV controle, worden behandeld met probe maar niet blootgesteld aan UV-licht.
      Opmerking: Als er meerdere concurrerende moleculen worden getest, zoals verschillende analogen van het kleine molecuul van belang, bereiden extra concurrent Platen eventueel.
2. Voeg HEK293T cellen aan de cultuur gerechten in 4 ml kweekmedium. Gebruik 3,5 miljoen cells per plaat.
   Opmerking: Het aantal cellen moet worden bepaald voor elk celtype zodat cellen bijna 100% confluent bij het begin van het experiment, om het maximale rendement te bereiken eiwit. Voor HUVEC, gebruiken 0,3 miljoen cellen per plaat. Een goede benadering is 1/10 van de cellen in een confluente 15 cm schaal. HEK293T cellen worden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
3. Zet de cellen aan de incubator (37 ° C, _5% CO2) gedurende de nacht.

2. Behandeling van cellen en fotoverknopende

1. De volgende dag, pre-fractie de volgende geneesmiddelen in 1,5 ml microcentrifugebuizen:
   1. Voor de eerste behandeling wordt 4 pl DMSO 2 buizen en 4 ui 10 mM concurrent (dwz de ongemodificeerde moederstof) tot 1 tube.
   2. Voor de tweede behandeling, voeg 16 ul van DMSO tot 1 tube en 16 ul van 50 &# 181; M affiniteit sonde 2 tubes.
      LET OP: De optimale concentratie kan verschillend zijn voor verschillende probes (zie bespreking), maar tussen de 200-500 nm is een goed uitgangspunt (hier gebruiken we 200 nm). De concentratie van competitief hoger zijn dan dat van de probe ten minste 20 maal (hier gebruiken we 10 uM). De eindconcentratie van DMSO moet gelijk in platen bevinden en niet meer dan 0,5% (20 pi volume).
2. Breng de celplaten in de celkweek kap en voeg de pre-porties drugs uit stap 2.1.1 als volgt: Zuig 1 ml kweekmedia resuspenderen de pre-gealiquoteerde geneesmiddel in de media, en voeg dan voorzichtig terug naar de plaat druppel wijs. Voeg de DMSO aan de DMSO (D) bord en de sonde (P) plaat, en voeg de concurrent van de competitie (C) plaat. Zet de platen naar de incubator gedurende 30 minuten.
3. Met verlichting in de cultuur kap gedimd, voeg de pre-gealiquoteerde probe uit stap 2.1.2 tot sonde (P) en de concurrentie (C) borden en voeg deDMSO aan de DMSO (D) plaat, zoals hierboven. Zet de platen naar de incubator gedurende 1 uur.
4. Tijdens de incubatie, bereid de volgende artikelen; Een dienblad van ijs dat alle platen past; ijskoude lysisbuffer (PBS [pH 8,5] + 1x proteaseremmer cocktail [compleet EDTA-vrij, verdund van 50x voorraad-oplossing in water], 200 pl / plaat); microcentrifugebuizen gelabeld D, P of C voor elk van de verschillende behandelingsomstandigheden, op ijs.
5. 15 minuten voor het einde van de 1 uur incubatie, instellen van de UV-lamp (365 nm) in de koude kamer en zet hem op te warmen de lamp.
6. Na 1 uur incubatie met de sonde, plaatst gerechten op het ijs. Was de cellen voorzichtig met 5 ml ijskoude PBS (pH 7,4) om overmaat probe te verwijderen. Opnieuw omvatten de cellen met 4 ml ijskoude PBS.
7. Zet de schaal van cellen gecentreerd 3 cm onder de UV lamp bovenop een ijslaag verwarming van de lamp te minimaliseren. Bestralen gedurende 3 min. Verwijder de schotel naar de tray ijs en herhaal voor alle monsters.
8. EENN a bestraling zuig het PBS uit de cellen en voeg 200 ul van ijskoude PBS (pH 8,5) met proteaseremmers aan elke plaat. Maak de cellen van de plaat met een rubberen schraper en overdracht naar de gelabelde microcentrifugebuizen op ijs.
9. Voeg SDS tot een eindconcentratie van 0,4% (10 pl 10% SDS in 250 pl monster).
   LET OP: SDS poeder is gevaarlijk. Vermijd het inademen van SDS poeder door het dragen van een masker over de neus en mond.
10. Lyseren de cellen door sonicatie de suspensie gedurende 10 pulsen (output 1, duty cycle 30%) en incubeer op ijs gedurende 1 min voor een tweede ronde van 10 pulsen.
11. Indien nodig, verwijder 2 pl ophanging en laat onder een lichtmicroscoop te zorgen voor volledige cellysis.
12. Kook de monsters op een hete plaat die op 95 ° C gedurende 5 minuten om cellysis te voltooien en denatureren de eiwitten.
13. Meet de eiwitconcentratie in elk monster onder toepassing van een spectrofotometrische detergent compatibel eiwit assay, zoals the Dc eiwitassay ^19, volgens de instructies van de fabrikant, met een spectrofotometer ingesteld op absorptie gemeten bij 750 nm.
14. Normaliseren van de proteïne concentratie 2,5 mg / ml (of als concentraties lager dan 2,5 mg / ml, normaliseert het monster met de laagste eiwitconcentratie) door toevoeging van PBS pH 8,5 + 0,4% SDS als nodig is (bijvoorbeeld als monsters 5 mg / ml in 250 pl, voeg 250 pl PBS pH 8,5 + 0,4% SDS tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml te verkrijgen).

3. Bevestiging van Fluorescent Tag per Klik Chemie voor Visualisatie van gelabelde eiwitten

1. Verwijder 40 pi van het cellysaat overgebracht in een nieuwe microcentrifugebuis. Houd de resterende lysaten voor reactie met azide-biotine (stap 4).
2. Voeg de volgende reagentia in deze volgorde: 0,2 ul fluor-azide (1 mM voorraad oplossing in DMSO), 0,58 pl TCEP (100 mM voorraad in water met 4 equivalenten NaOH toegevoegd, vers bereid), en 3,38 ul TBTA (1.7 mM voorraad in een 4: 1 verhouding van t-butanol DMSO). Vortex te mengen.
3. Voeg 1,14 ul _CuSO4 5H ₂ O (50 mM in water) om de reactie te starten. Kort vortexen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
4. Voeg 50 ul 2x SDS-monsterbuffer om de reactie te blussen. Op dit moment lopen de monsters direct op een SDS-PAGE gel ²⁰ voor de beste resultaten, of op te slaan bij -20 ° C gedurende de nacht indien nodig.
5. Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór het laden op de gel.
   OPMERKING: Aangezien het moleculair gewicht van het doeleiwit typisch niet in dit stadium bekend is, is het raadzaam om 2 gels met verschillende acrylamide concentraties zijn (ie 8% en 15%), of een brede moleculair gewichtsbereik gradiënt gel (dat wil zeggen, 4-15%), om volledige dekking gewicht moleculair waarborgen.
6. Als de kleurstof voor het einde van de gel bereikt, blijven draaien de gel gedurende nog 5 min om alle overmaat unreacte waarborgend fluor-azide volledig verlaten de gel.
7. Verwijder de gel een container met DDH ₂ O en incubeer gedurende 10 minuten onder zacht schudden om alle overtollige fluor-azide wegspoelen.
8. Plaats de gel op een glasplaat en scan het onder gebruikmaking van een Typhoon fluorescerende gel scanner volgens de instructies van de fabrikant.

4. Bevestiging van biotine Tag per Klik Chemie voor Affiniteit Zuivering van gelabelde eiwitten

1. Van de overige lysaten van stap 3,1, is de maximale na-eiwit normalisatie zodanig dat alle monsters hetzelfde volume (bijvoorbeeld als na normalisatie naar 2,5 mg / ml verkregen monster volumes 500, 550, en 600 pl, gebruiken 500 pl elk).
2. Vooraf duidelijk de lysaten door aan 50 gl hoge capaciteit streptavidine agarose kralen, voorgewassen 2x met PBS (pH 7,4). Incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
3. Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Verwijder thij supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en gooi de kralen.
4. Verwijder 1-2% van de DMSO monster naar een nieuwe buis label "input". Voeg een gelijk volume 2 x SDS-monsterbuffer en bewaar bij -20 ° C.
5. Per 500 pi van lysaat, voeg de volgende reagentia: 1,38 ul biotine-azide (10 mM voorraad in DMSO), 5,5 pi TCEP, en 32,5 pl TBTA. Vortex te mengen.
6. Voeg 11 ul _CuSO4 5H ₂ O per 500 ul lysaat en vortex kort. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
7. Voeg 4 monstervolumes aceton gekoeld tot -20 ° C. Vortex de monsters en incubeer overnacht bij -80 ° C volledig precipiteren eiwitten en verwijder ongereageerd biotine-azide.
8. Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om het geprecipiteerde eiwitten pelleteren.
9. Zuig het supernatant volledig en resolubilize de eiwitten door sonicatie in 150 ul PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Voeg 600 ul PBS (pH 7,4) om de concentratie van SDS te verdunnen tot 0,2%.
11. Voeg de monsters 30 gl voorgewassen hoge capaciteit streptavidine agarose kralen en incubeer 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
12. Pellet de kralen door centrifugering bij 1000 g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant die niet gebonden eiwitten en teruggooi.
13. Voeg 1 ml wasbuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) aan de korrels en incubeer 5 min bij kamertemperatuur met rotatie.
14. Herhaal stap 4.12 en 4.13 3 keer.
15. Zuig het wasbuffer geheel van de bolletjes en voeg 30 ul 2x SDS-monsterbuffer.
16. Incubeer gedurende 5 min op 95 ° C hitteblok de eiwitten los van de bolletjes.
17. Centrifugeer de kralen voor 1 min bij 13.000 xg bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Op dit punt, kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik SDS-PAGE gerund. Vries bij monsters, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C vóór gebruik.
18. Voorzichtigpipet het monster buffer bevattende eiwitten af van de kralen en laden op SDS-PAGE ²⁰ (zie hieronder belangrijke overwegingen). De korrels kunnen worden opgeslagen voor latere opkoken indien nodig.
    OPMERKING: eiwit detectie door zilverkleuring, worden betere resultaten verkregen met een 1 mm dikke gel. Indien een band buiten de zilver gekleurde gel voor massa-analyse spectrometrie (MS) te snijden, bereiden alle reagentia vers uit steriele oplossingen en laat een lege put tussen monsters op de gel. Voor elke band gesneden uit de sonde baan moet een parallelle segment worden uit de DMSO baan zodat achtergrond eiwitten kunnen worden afgetrokken. Voor de validatie van eiwit-ID van western blot, is het essentieel om de input monster uit stap 4.4 ook laden wanneer het uitvoeren van de SDS-PAGE gel.
19. Volg een standaardprotocol voor zowel ²¹ zilverkleuring of Western blot ²² aan het doeleiwit (s) te detecteren.

Results

De hier getoonde resultaten werden verkregen met een foto-affiniteit probe van het antimycoticum itraconazol, waarvan het gebruik is eerder gepubliceerd ^16. Deze resultaten demonstreren het gebruik van de foto-affiniteit labeling techniek levende cellen een belangrijke itraconazol-bindend eiwit als het 35 kDa-membraaneiwit spanningsafhankelijke anion kanaal 1 (VDAC1) met succes te identificeren.

Het bovenstaande pro...

Discussion

Verschillende benaderingen voor het identificeren van de doelen van kleine moleculen kunnen grofweg in twee categorieën: bovenaf, waarbij het cellulaire fenotype van het geneesmiddel wordt gebruikt om een ​​beperking van de potentiële doelen gebaseerd op hun bekende functies of bottom-up, waarbij het doelwit direct geïdentificeerd door chemische of genetische middelen ^3. Top-down of fenotypische studies kan bepaalde cellulaire processen beïnvloed door het geneesmiddel te identificeren (bijvoorbeeld, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)	Life Technologies	20490	Maak vers op gebruiksdag. Bereid 100 mM stock in water met 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Bereid 1,7 mM stock in een 4:1 verhouding van t-butanol tot DMSO, bewaar bij -20 °C.
Kopersulfaat (CuSO4•5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Bereid 50 mM stock in water, bewaar bij kamertemperatuur.
Biotine-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Bereid 10 mM stock in DMSO, bewaar bij -20 °C.
Alexa Fluor 647-azide	Life Technologies	A10277	Bereid 1 mM stock in DMSO, bewaar bij -20 °C.
365 nm UV lamp	Spectroline	FC100	UV-blokkerende brillen moeten worden gedragen tijdens gebruik.
Protease inhibitor tabletten, EDTA-vrij	Roche Life Science	11873580001	Bereid 50x oplossing in water en bewaar bij -20 °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Stel in op output 1, duty 30%.
Fluorescente gelscanner	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Gebruik rode laser om Alexa-fluor 647 te detecteren.
Detergentia-compatibele Dc eiwit assay kit	Bio-Rad	5000112
High Capacity Streptavidine Agarose kralen	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, laag glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetaal Runderserum, gekwalificeerd	ThermoFisher Scientific	26140079
Penicilline/Streptomycine oplossing	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676