Hersenschudding vormt het meest voorkomende type traumatische hersenschade. Daarom kan een repetitief hersenschuddend dierenmodel, dat de belangrijkste kenmerken van een verwonding bij patiënten repliceert, een manier bieden om hersenschudding op een rigoureuze, gecontroleerde en efficiënte manier te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Repetitive Concussive Head Injury Model in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks dat de hersenschudding/ lichte traumatische hersenletsel (mTBI) de meest voorkomende vorm van traumatisch hersenletsel is, is er nog steeds een gebrek aan kennis over de blessure en de effecten ervan. Om een beter begrip van hersenschudding te ontwikkelen, worden vaak dieren gebruikt omdat ze een gecontroleerd, rigoureus en efficiënt model bieden. Studies hebben traditionele diermodellen aangepast om mTBI uit te voeren om milde letselernst te stimuleren door de letselparameters te wijzigen. Deze modellen zijn gebruikt omdat ze morfologisch vergelijkbare hersenletsels kunnen produceren met de klinische toestand en een spectrum van letselernst kunnen bieden. Echter, ze zijn beperkt in hun vermogen om de identieke kenmerken van verwondingen bij patiënten te presenteren. Met behulp van een traditioneel impactsysteem kan een repetitief concussiekletsel (rCHI) model mild tot matig mensachtig hersenletsel induceren. De letselernst kan worden bepaald door de periode van bewustzijnsverlies (LOC) te meten met een teken van een tijdelijke stopzetting van de ademhaling. Het rCHI-model is gunstig om te gebruiken vanwege de nauwkeurigheid en eenvoud bij het bepalen van mTBI-effecten en mogelijke behandelingen.
Inleiding
Hersenschudding, ook wel mild traumatisch hersenletsel (mTBI), is de meest veelvuldig voorkomen van traumatisch hersenletsel (TBI) en treft miljoenen mensen in de Verenigde Staten. Hersenschudding kan lastig te diagnosticeren en er is geen specifieke behandeling voor hersenschudding. Er is een groeiende erkenning en enig bewijs dat milde mechanische trauma als gevolg van sportblessures, militaire bestrijding en andere fysiek boeiende bezigheden cumulatief en chronische neurologische gevolgen 1,2 kan hebben. Echter, er is nog steeds een gebrek aan kennis over hersenschudding en hun effecten. De huidige methode beperkt de studies van de pathologie en de behandeling bij de mens omdat alleen neurologische evaluatie en beeldvorming zijn beschikbaar voor de klinische diagnose. Dierlijke modellen bieden een middel om hersenschudding te studeren op een efficiënte, rigoureus, en gecontroleerde wijze met de hoop op verdere diagnostiek en behandeling van mTBI.
Studies hebben aangepast traditionele TBImodellen zoals gecontroleerde corticale invloed (CCI), vloeistof-percussie effect (FPI), gewicht daling letsel en blast letsel aan mTBI te voeren en het stimuleren van lage letsel ernst door het veranderen van de parameters letsel. Deze modellen zijn gunstig te gebruiken vanwege hun vermogen om hersentrauma morfologisch vergelijkbaar met de klinische toestand repliceren; Maar ze hebben ook hun eigen beperkingen. De ernst van de schade veroorzaakt door een versnelling van de schade (gewicht drop) is vaak zeer variabel. De twee resultaten van het milde CCI - subarachnoïdale bloeding en focale contusie - zijn niet vergelijkbaar met de typische menselijke hersenschudding. CCI en FPI vereisen een craniotomie, die niet klinisch relevant, terwijl blast letsel is een meer omstreden model met betrekking tot de verschillende belichting positie en piek drukmetingen evenals variabele secundaire verwondingen tijdens de belichting 3-6. Een bijgewerkte concussive diermodel dat pre-klinisch onderzoek kan vertalen naar de klinische Setting is noodzakelijk onderzoek.
De kernvraag in het modelleren van licht traumatisch hersenletsel is om de experimentele letselernst, die het meest repliceert de schade in een klinische setting te definiëren. Onlangs, verschillende onderzoeksgroepen ontwikkelde de gesloten hoofdletsel of concussive hoofdletsel (CHI) model 7-10. CHI is een modificatie van CCI zonder craniotomie, maar gebruikt toch een traditioneel elektronisch magnetisch effect systeem een hoofd effect opleveren. Een CHI kan een hersenschudding, variërend van licht aanzetten tot matig door het aanpassen van de impact parameters. Verlies van bewustzijn (LOC) kan direct worden waargenomen na een botsing door het detecteren van een afname van de ademhalingsfrequentie of tijdelijke beëindiging van de ademhaling. De periode van LOC wordt gebruikt om de ernst van de schade te bepalen. Dit artikel is voorzien van een licht verbeterde en geactualiseerde versie van een repetitieve CHI (rCHI) model bij muizen, samen met een uitvoerige stap-voor-stap protocol en representatieve resultaten. De rCHI model onderzoekstrategieën eenopnieuw gunstig bepalen mTBI effecten en mogelijke behandelingen, vooral omdat er geen individueel diermodel kan imiteren alle hersenschudding-geïnduceerde pathologische veranderingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd onder protocollen # 201207692 door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Florida en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren goedgekeurd.
1. Animal Care
- Gebruik de 3-4-maanden-oude mannelijke C57BL / 6J muizen. Zorg voor beddengoed, nestmateriaal, voedsel en water ad libitum. Houd de muizen in omgevingstemperaturen geregeld op 20-22 ° C met een constante 12-uur licht / 12 uur donker cycli.
2. Pre-impactie Voorbereiding
- Bevestig een op maat gemaakte siliconen-rubber beklede metalen punt aan een elektromagnetisch stereotaxische effect apparaat. Controleer de vlakke bodem van de tip is evenwijdig aan het oppervlak van het probe uiteinde (Figuur 1A).
- Verdoven de muis met 4% isofluraan anesthesie gevolgd door handhaving van 2,5% isofluraan. Controleer de verdoving via de stroommeter. Monitor de verdoving niveau totdat het dier bereikt een chirurgische niveau van anesthesie door het tonen van het verlies van pedaal terugtrekking reflex.
- Zet de muis in een buikligging op een verwarmingselement. Gebruik een trechtervormige neuskegel de muis onder verdoving houden. Volledig scheren het hoofd met behulp van een trimmer. Gebruik petrolatum oogzalf op de ogen van de muis tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
3. Impact Parameters Instelling
NB: De impact systeem omvat een besturingskast om de impact parameters in te stellen, een actuator aan de impactie uit te voeren, en een digitale stereotactische frame met 3-beweging assen.
- Pre-set de snelheid van het effect apparaat tot 4 m / sec en dwell time tot 240 msec op de bedieningskast.
4. Plaatsing van de Impact Center
- Liep zachte verwarmingselement onder het lichaam van het dier om de lichaamstemperatuur nabij 39 ° C te houden. Monteer de muis in een stereotactische frame in een prone positie met de stompe uiteinden oor bars.
- Verlaag de impact tip in de buurt van het hoofd van de muis door het bewegen van de Z-driver. Stel de vlakke effect uiteinde (9 mm diameter) door de X- en Y-drivers bewegen halverwege de doelcoördinaten boven de pijlnaad.
- Controleer een rand van de impact tip verticaal evenwijdig aan een denkbeeldige horizontale lijn tussen de twee oren (figuur 1C). Het centrum effect komt overeen met de centrale pijlnaad halverwege interfrontal en lambdoid hechtingen (interaurale 9 mm voor interaurale 0 mm, lateraal 4,5 mm).
5. Impact Diepte instellen
- Om correct in te stellen van de impact diepte, gebruik bijkomende sonde met de geïsoleerde siliconen-rubber beklede invloed tip vervangen.
- Om ervoor te zorgen dat er geen verschuiving van de impact centrum na het inschakelen tips, stel de X- en Y-kanaal op het digitale stereotaxische bedieningspaneel op nul voordat u de tips.
- Verplaats de probe tip naar het midden van de impact gebied door de X-en Y-drives met de hand te bewegen.
- Clip contact sensor aan de staart van de muis.
- Verplaats de impactor (Z rijden) naar beneden tot de punt van de sonde raakt het oppervlak van de impact website.
- Stel de Z-kanaal op de stereotaxische bedieningspaneel op nul.
- Verplaats de impact uiteinde naar het raakvlak van handmatig instellen X- en Y-drivers (niet nul knoppen op de digitale stereotaxische regelpaneel) tot X- en Y-drivers nul (indien het effect tip eerder geplaatst).
- Trek de actuator door het bewegen van het uitschuiven van de schakelkast. Handmatig verplaatsen de impactor omlaag (Z bestuurder) van 4 mm.
6. Impact
- Trigger het effect door te klikken op het effect schakelaar op de bedieningskast en het bereiken van een vervorming diepte van 4 mm.
7. Post-impactie
- Meet de tijd van het effect tot de muis eerste ademhaling met een timer.
- Verwijder het dier uit het instrument en leg ze op een warme pad om hun lichaamstemperatuur te handhaven. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Zorg voor herstel alvorens terug te keren het dier terug in een schone kooi. Heeft een dier niet terug naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
- Observeren en wegen van de muizen dagelijks. Wanneer de muizen tekenen van pijn, intraperitoneaal injecteren met Meloxicam 1 - 2 mg / kg om 12-24 uur.
8. Repetitive Impaction
- Geef de muizen extra letsel op dagen 4, 7 en 10 na de aanvankelijke verwonding (72 uur interval tussen impacts).
9. Immunohistochemie (IHC)
- transcardial perfusie
- Verdoven de muizen via intraperitoneale injectie met 200 m / kg pentobarbital.
- Evalueren en verzekeren chirurgische-plane anesthesie door een teen knijpen. secure de muis in rugligging door voorzichtig taping de voorpoten en achterpoten van een Styrofoam werkoppervlak in een zuurkast.
- Maak een incisie door de huid langs de thoracale middellijn van net onder de zwaardvormig proces om het sleutelbeen. Voeg twee extra incisies in de processus xiphoideus en verder langs de basis van de ventrale laterale ribbenkast.
- Open de borstholte en bloot het hart door te snijden door middel van de thoracale spieren en ribbenkast.
- Beveilig het kloppend hart met stompe pincet en een 1-2 mm incisie in de linker hartkamer.
- Steek een vlinder naald in de rechterboezem onmiddellijk. Begin de infusie van 20 ml zoutoplossing door het indrukken van de spuit langzaam.
- Overschakelen van zoutoplossing om 4% paraformaldehyde. Verder perfusie met 20 ml paraformaldehyde.
- Onthoofden de muis en verwijder de huid met een schaar. Isoleer de hersenen uit de schedel met een bot mes.
- Cryostat snijden
- Insluiten hersenweefsel in optimale snij-temperatuur (LGO) formulering en bevriezen bij -80 ° C. Plaats de hersenen in de cryostaat in een sagittale richting. Snijd de hersenen secties 5 micrometer dik.
- kleuring
- Droog de vriescoupes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Incubeer de glaasjes met 100 gl 2% geitenserum en 0,1% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij KT.
- Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer dan de dia's met anti-GFAP (1: 200) of anti-ferritine-antilichaam (1: 200) afzonderlijk een nacht bij 4 ° C.
- Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer vervolgens dia gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met biotine-geconjugeerd secundair antilichaam.
- Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer daarna de glaasjes met avidine-biotine complex (ABC) oplossing (1:50) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. Incubeer daarna in 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substraatoplossing (50 ml PBS, 10 gl H 2 O 2, 10 mg DAB pil, filter alvorens) gedurende 5-8 min. Let op de dia's onder de microscoop tot de positieve cellen verschijnen.
- Spoel de dia's in langzaam stromend leidingwater gedurende 5 minuten. Clean dia's met een lab-wipe. Monteer vervolgens de secties met montage medium en dekglaasje.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit model (Figuur 1 AC), waren er korte periodes van hijgend en ondiepe ademhaling. Een verlies van bewustzijn (onbewuste) wordt gedefinieerd als een daling van de ademhaling of transiënte beëindiging van de ademhaling voor hervatting van de normale ademhaling. Invloed op het midden van het hoofd veroorzaakt kortdurende bewusteloosheid (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sec bij iedere stoot afzonderlijk, figuur 1D). Muizenhersenen toonde nor...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om hersenletsel morfologisch vergelijkbaar met de klinische toestand na te bootsen, zijn post-hersenschudding symptomen verwacht. Post-hersenschudding symptomen over het algemeen zijn hoofdpijn, duizeligheid, vermoeidheid, geheugen en slaapproblemen, moeite met concentreren evenals angst en depressieve stemming. Aangezien somatische symptomen nog niet meetbaar in diermodellen kunnen zijn, worden de wijzigingen van motorische en cognitieve functies en emotioneel gedrag als criteria voor rationeel hersenschudding evaluati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financieel belang dat bekendgemaakt moet worden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door financiering van een Florida Health-subsidie (Onderzoeksfonds voor hersen- en ruggenmergletsel) (KKW).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| anesthesia machine | Eagle Eye Anesthesia, Inc | Model 150 | anesthesie |
| Electromagnetic Impactor | LeicaBiosystems | Impact One Stereotaxic Impactor | impaction uitvoeren |
| Digital Stereotaxic instrument | LeicaBiosystems | 39462501 | muis monteren en positioneringstips |
| Sicilone rubber-coated metal tip | Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL | op maat gemaakt | impacttip |
| Lithium Ion All-in-One Trimmer | WAHL Home Products | 9854-600 | muishaar scheren |
| paper clips | op maat gemaakt | probetip | |
| Cotton tipped applicators | MEDLINE | MDS202055 | hoofd scrubben met saline |
| Tissue Tek O.C.T. | ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | weefsel inbedding |
| anti-GFAP | Dako | CA93013 | antilichaam voor IHC |
| anti Ferritin | Sigma | F6136 | antilichaam voor IHC |
| VECTASTAIN Elite ABC kit | Vector laboratories | PK-6100 | IHC detectiesysteem |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope scanner | Leica Microsystems Inc, | dia's scannen | |
| Leica AutoStainer XL | Leica the pathology Company | ST2010 | H&E kleuring |
| DAB | sigma | D3939 | IHC detectiesysteem |
Referenties
- Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
- Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64(2014).
- Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
- Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178(2015).
- Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
- Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
