Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

12.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54532

⸱

9 december 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

Samenvatting

Hypoxie is door klinische waarnemingen en in vitro gegevens in verband gebracht met de metastase van Ewing-sarcoom (ES), maar direct bewijs voor het pro-metastaserende effect ontbreekt en de exacte werkingsmechanismen zijn onduidelijk. Hier beschrijven we een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op ES-disseminatie mogelijk maakt en onderzoek naar de onderliggende betrokken paden. Deze aanpak combineert twee goed gevestigde experimentele strategieën, orthotopisch xenografting van ES-cellen en ligatie van de femorale slagader (FAL), die hindlimbischemie induceert. Menselijke ES-cellen werden geïnjecteerd in de gastrocnemiusspieren van SCID/beige muizen en de primaire tumoren kregen de tijd om te groeien tot een grootte van 250 mm3. In dit stadium werden de tumoren verwijderd (controlegroep) of de dieren werden onderworpen aan FAL om tumorhypoxie te creëren, gevolgd door tumorresectie 3 dagen later. De efficiëntie van FAL werd bevestigd door een significante toename in binding van hypoxyprobe-1 in het tumorweefsel, ernstige tumornecrose en volledige remming van primaire tumorgroei. Belangrijk is dat, ondanks deze directe effecten van ischemie, een verbeterde verspreiding van tumorcellen vanuit de hypoxische tumoren werd waargenomen. Deze experimentele strategie maakt een vergelijkende analyse mogelijk van de metastaserende eigenschappen van primaire tumoren van dezelfde grootte, maar met aanzienlijk verschillende niveaus van hypoxie. Het biedt ook een nieuw platform om de mechanistische basis verder te beoordelen voor de hypoxie-geïnduceerde veranderingen die optreden tijdens metastatische tumorprogressie in vivo. Bovendien, terwijl dit model werd opgezet met behulp van ES-cellen, anticiperen we dat deze experimentele strategie kan worden gebruikt om het effect van hypoxie te testen bij andere sarcomen, evenals tumoren die orthotopisch worden geïmplanteerd op locaties met een goed gedefinieerde bloedtoevoerroute.

Inleiding

Ewing-sarcoom (ES) is een agressieve maligniteit bij kinderen en adolescenten. 1 De tumoren in zachte weefsels en botten, gewoonlijk in de ledematen. Terwijl de aanwezigheid van metastasen is de meest krachtige prognostische factor voor ES patiënt, de onderliggende mechanismen hun ontwikkeling blijven onduidelijk. 2 Tumor hypoxie is een van de weinige factoren betrokken bij ES progressie. Bij ES patiënten, is de aanwezigheid van niet-geperfundeerde gebieden in het tumorweefsel geassocieerd met een slechte prognose. 3 In vitro verhoogt hypoxia invasiviteit van ES-cellen en triggers expressie van pro-metastatische genen. 4-6 Ondanks deze bewijslijnen, geen direct bewijs voor hypoxie geïnduceerde ES progressie en verspreiding bestaat. Bovendien, de mechanismen waarmee hypoxie uitoefent dergelijke effecten zijn momenteel onbekend. Daarom hebben we een in vivo model gemaakt om het gat te vullen tussen de bestaande in vitro data en klinische opmerkingen. Dit modelsysteem maakt direct testen van de effecten van hypoxie op tumoren die zich in hun natuurlijke omgeving, met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om tumorprogressie en metastase in vivo in combinatie met ex vivo pathologische en moleculaire analyses (figuur 1) te volgen.

Aangezien geen gevestigde transgeen model van ES is beschikbaar, de in vivo studies naar metastatische eigenschappen van deze tumoren afhankelijk injecties van menselijke cellen in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel het gebruik van immunologisch verminderde dieren de effecten van het immuunsysteem het ziekteverloop kunnen onderschatten, het vermogen om menselijke cellen gebruiken verhoogt vertaalbaarheid van dergelijke studies. Tussen verschillende xenograft modellen, systemische injecties in de staartader zijn het makkelijkst uit te voeren, maar ze laat de eerste stappen van tumorcel intravasation en ontsnappen aan de primaire plaats van groei. 7-12 Anderzijds, orthoto pic xenografting, die injecties van tumorcellen omvat in bot (femur, rib) of spieren, is technisch uitdagend, maar ook biologisch menselijke kankerbestrijding. 13-16 In het verleden, de hoge morbiditeit geassocieerd met snelle groei van primaire tumoren vaak noodzakelijk euthanasie van dieren voor metastase ontwikkelen. In dit onderzoek gebruikten we een eerder vastgestelde model cel injecties in de gastrocnemiusspier gevolgd door excisie van de resulterende primaire tumor in combinatie met overlangse controle van metastatische progressie van MRI. 17,18 Dergelijke injecties in gastrocnemiusspier in de nabijheid van de tibia zorgen voor tumorgroei in twee natuurlijke milieus ES - spieren en botten - en leiden tot metastasen op afstand te plaatsen typisch getroffen mens. 18 Daardoor is dit model recapituleert nauwkeurig de metastatische processen in ES patiënten tijdens ziekteprogressie.

tent "> De lokalisatie van primaire tumoren bij de onderste achterbeen maakt ook de nauwkeurige regeling van de bloedtoevoer naar de tumor tissue. femorale slagader ligatie (FAL) is een gevestigde techniek gebruikt in angiogenese onderzoek bloedtoevoer naar distale gebieden van blokkeren het been en onderzoeken weefsel vascularisatie in reactie op ischemie. 19,20 Belangrijk is dat de initiële daling van de bloedstroom volgt collaterale tankopening en weefsel reperfusie geobserveerd ongeveer 3 dagen na FAL. 20 wanneer dus uitgevoerd in een tumordragende ledematen, dit model reproduceert hypoxie / reperfusie gebeurtenissen die van nature in snelgroeiende tumoren en maakt het ontsnappen van metastatische tumorcellen door herstel van de perfusie onderste achterbeen via nieuw geopende collaterale vaten. 21 Belangrijk is dat deze procedure moet worden uitgevoerd wanneer de tumorgrootte klein genoeg om buitensporige hypoxie controletumoren (typisch bij de tumordragende calf vol voorkomenume van 150-250 mm3) en zorgt voor aanzienlijke verschillen in tumorhypoxia tussen controle en FAL-behandelde groepen.

Naast het longitudinaal volgen van het effect van hypoxia op ES latentie en de frequentie van metastasen, dit model maakt het ook voor het verzamelen van weefsel en de ontwikkeling van nieuwe cellijnen van zowel primaire tumoren en metastasen. Belangrijker eerdere werk vastgesteld dat-metastasen afgeleide cellijnen vertonen verbeterde metastatisch vermogen bij herintroductie dieren, wat aangeeft dat tumor verspreiding wordt geassocieerd met permanente veranderingen in de tumor cel fenotype, en waarbij het gebruik van deze cellijnen om de metastatische processen ontcijferen valideren. 18 Collectief kunnen deze modellen nu gebruikt worden voor de genetische en moleculaire analyses vereist voor het identificeren van hypoxie geïnduceerde metastatische trajecten.

Hypoxie is een pro-metastatische rol bij het versterken van de maligniteit van verschillende tumors, ons model kan worden gebruikt als een platform om de rol van hypoxie in andere tumortypen die van nature ontwikkelen ledematen, zoals osteosarcoom en rhabdomyosarcoom onderzoeken. 21-23 Bovendien kan dezelfde benadering worden toegepast maligniteiten groeien op andere anatomische locaties met een goed gedefinieerde route van bloedtoevoer. Uiteindelijk kan het model worden gemodificeerd en het nut verder uitgebreid, afhankelijk van de individuele behoeften aan onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Georgetown University Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Cell Voorbereiding voor Orthotope Injecties

  1. Cultuur menselijke embryonale cellen onder normale omstandigheden. Gebruik ongeveer een 15-cm celkweek plaat niet meer dan 70% van de samenvloeiing voor injectie van 5 muizen.
    OPMERKING: Voor deze studie, SK-ES1 cellen werden gekweekt in McCoy's 5A medium met 15% foetaal runderserum (FBS) op met collageen beklede platen en TC71 cellen werden gekweekt in RPMI met 10% FBS en 1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES). Beide media werden aangevuld met antibiotica - penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 ug / ml) en fungizon (1 ug / ml).
  2. Was de ES-cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsinize bij 70% confluentie met 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 5 min.
  3. Verwijder de ES-cellen van de plaat met celkweek media, centrifugeer 5 min bij 200 xg bij kamertemperatuur. Resuspendeer de ES-cellen in 10 ml koude PBS en tel het aantal cellen.
  4. Centrifugeer ES cellen gedurende 5 min bij 200 xg bij kamertemperatuur, en vervolgens opnieuw te suspenderen in 2 x 10 7 (SK-ES1) of 10 7 (TC71) cellen per ml in koude PBS. Houd de uiteindelijke celsuspensie op het ijs tijdens het uitvoeren van injecties.

2. Orthotope Injectie van ES-cellen in Gastrocnemius Muscle

  1. Gebruik 4-6 weken oude vrouwelijke SCID / beige muizen.
  2. ES cellen te injecteren, zachte hand de muis en stabiliseren het linkerbeen tussen de vierde en vijfde vingers, waardoor de mediale zijde van het onderste achterbeen.
  3. Met behulp van een 28 G ½, injecteer 0,1 ml van de vooraf bereide celsuspensie die ofwel 2 x 10 6 (SK-ES1) of 10 6 (TC71) ES-cellen in de gastrocnemius spier (Figuur 2A) bevat.
    LET OP: Hoewel het maximale volume voor intramusculaire injreflecties typisch 0,05 ml, voor deze procedure de volumetoename aan 0,1 ml is nodig vanwege het grote aantal cellen geïnjecteerd. Deze procedure is goedgekeurd door de Georgetown University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
    1. Steek de naald in de gastrocnemiusspier voren bij ongeveer 30 - 45 graden in de richting van het tibiale kam / tuberositas.
    2. Iets van de naald terug te trekken als het eenmaal het scheenbeen kuif / tuberosity raakt. Injecteer langzaam de celsuspensie oplossing, geleidelijk terugtrekken van de naald om de druk vrij te geven.
  4. Bewaken van de geïnjecteerde muizen in de komende 24 uur op tekenen van nood.
    LET OP: Onderzoekers met minder ervaring in het omgaan met dieren zou moeten overwegen verlamming muizen voor tumorcel injecties. Sommige instellingen kan anesthesie om veiligheidsredenen nodig is.

3. Monitoring Primaire tumorgroei

  1. Bewaken van de groei van de primaire tumoren dAily totdat de tumorgrootte bereikt het gewenste volume.
    Opmerking: In de huidige studie, een kalf volume van 250 mm3 werd gebruikt als uitgangspunt voor het experiment (figuur 2B). Gewoonlijk duurt het ongeveer 1-2 weken voor de tumoren om deze grootte te bereiken.
    1. Meet het kalf omvang dagelijks met digitale schuifmaat via de mediale-laterale en anterior-posterior lengtes.
    2. Bepaal het kalf volume door de formule (D xd 2/6) x 3,14, waarbij D de grootste diameter en d is de kortere diameter van de tumordragende lagere achterbeen.
      OPMERKING: De grootte van de normale volwassen muis kalf van ongeveer 40-50 mm3. Het volume toenemen door tumorgroei en op het vervolg zal het kalf hoofdzaak bestaan ​​uit tumorweefsel.

4. Femorale Artery Ligatie (FAL) voor het induceren van hypoxie in de tumor-dragende achterbeen

  1. Bereid de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze operatie: curved of wees fijne tang, wees tang, chirurgische schaar en een naald houder. Steriliseren deze tools voorafgaand aan de operatie met behulp van een autoclaaf of een hot-bead sterilisator. Daarnaast hebben mooie wattenstaafjes klaar voor deze operatie.
    LET OP: Het wordt aanbevolen dat de instrumenten die opnieuw worden gesteriliseerd bij de tips die nodig zijn tijdens de procedure.
  2. Injecteer analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg) subcutaan (SQ). Op te sporen en te bevestigen hypoxie Injecteer hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
    Opmerking: Deze dosis komt overeen met 1,5 mg per muis en wordt bereikt door het injecteren van 0,1 ml van 15 mg / ml hypoxyprobe oplossing in PBS intraperitoneaal (IP). De hypoxyprobe is dan detecteerbaar postmortem in dierlijk weefsel door immunohistochemie.
  3. Plaats de muis in een anesthesie inductie kamer met 3-5% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l / min.
  4. Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de induction kamer. Plaats het dier in rugligging op een steriel laken geplaatst boven op een warming pad op het bedrijfsresultaat oppervlak. Gebruik een neuskegel aan te sluiten op een continue stroom van 1-3% isofluraan in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,8 l / min.
    1. Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. Om grondig ontharen de chirurgische gebied, van toepassing ontharingscrème, waardoor het op de huid niet meer dan 10 sec. Veeg uit de ontharingscrème met behulp van een ethanol prep pad.
  5. Uit te breiden en te beveiligen het achterbeen met een stuk tape ongeveer 45 graden vanaf de middellijn van de muis. Zodra het achterbeen veilig is, veegt u de blootgestelde huid met 10% povidon / jood wattenstaafje / oplossing, gevolgd door ethanol, het herhalen van twee keer per stuk. Voor de rest van de chirurgische procedure, gebruikt een stereomicroscoop om een ​​vergroot aanzicht van het achterbeen regio te krijgen.
  6. Met behulp van puntige pincet en chirurgische schaar, maken een incisie van het skin, ongeveer 1 cm lang, van halverwege de dij in de richting van de liesstreek. Met behulp van een zoutoplossing bevochtigde fijne wattenstaafjes, zachtjes borstelen weg onderhuids vetweefsel rondom de dijspier.
  7. Zorgvuldig onthullen de onderliggende femoralis via stompe dissectie door het onderhuidse vetweefsel. Stabiliseren van de wond en chirurgische veld aan het vaatstelsel van de mid-upper adductor bloot te leggen.
  8. Met behulp van fijne tang voorzichtig doorboren door de membraneuze dij schede aan de neurovasculaire bundel bloot te leggen. Met behulp van een schone set van fijne tang, ontleden en scheiden de dijbeenslagader van de femorale ader en zenuw aan het proximale locatie in de buurt van de lies, distale aan de lies ligament. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het doorboren van de lies muur.
  9. Na dissectie, langs een streng van 6-0 zijden hechtdraad onder de dij slagader en distaal van de tak van de laterale circumflex dijbeenslagader (LCFA). Afsluiten van de dij slagader met behulp van dubbele knopen (figuur 3).
  10. Sluit de incisie met behulp van 6-0 polypropyleen hechtingen. Na het sluiten van de incisie, injecteren SQ 0,5 ml warm zoutoplossing voor de vochtbalans therapie. Plaats het dier op een warm kussen gedrapeerd in het herstel kooi en controleren continu tot wakker.
  11. Monitor de dieren gedurende eerste 6 uur na de operatie en injecteer het analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) elke dag gedurende 3 dagen. Verwijder hechtingen 10 dagen na de operatie met behulp van steriele schaar.

5. primaire tumor Excision door beenamputatie

OPMERKING: amputeren de tumordragende lagere achterbeen wanneer de kuitomvang 250 mm3 voor de controlegroep of 3 dagen na FAL de hypoxische groep bereikt.

  1. Scheer haar van de tumor-dragende ledematen van de distale tibia aan het bekkengebied met tondeuses, terwijl zachtjes houden van het dier. Injecteer de analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) voor de behandeling.
  2. Plaats de muis in een anesthesie inductie chamber met 3-5% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l / min. Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
  3. Plaats het dier in de juiste zijligging op een steriele doek geplaatst op een verwarmingskussen op het werkoppervlak. Gebruik een neuskegel aan te sluiten op een continue stroom van isofluraan 1-3% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,8 l / min. Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen
  4. Bereid de operatieplaats via 10% povidon / jood wattenstaafje / oplossing, gevolgd door ethanol, 3 keer herhalen. Breng een steriel gaas (bijvoorbeeld chirurgische doek) via muis een steriele chirurgische veld te verkrijgen.
  5. Wordt middelste femorale omtrek incisie, gevolgd door stompe dissectie en intrekken van de huid proximaal. Maak de mediale femorale neurovasculaire pedikel op de middelste zijde van het been, en ligerenin de buurt van de lies ligament met behulp van 4-0 gecoate (polyglactin 910) absorbeerbare hechtmateriaal.
  6. Voer een mid-femorale doorsnijding van spiergroepen met een schaar, gevolgd door stompe dissectie van zacht weefsel aan de coxofemorale gewricht. Met behulp van een bot mes, het uitvoeren van een mid-femorale osteotomie. Met behulp van een steriele fijne wattenstaafje of een absorbeerbare gelatine spons, voorzichtig op de osteotomie site om een ​​minimum te beperken en te voorkomen bloeden.
  7. Sluit de bovenliggende huid met behulp van chirurgische wond clips en injecteer 0,5 ml warm zoutoplossing SQ voor vochtbalans therapie. Plaats het dier op een warm kussen gedrapeerd in het herstel kooi en controleren continu tot wakker.
  8. Bij chirurgie, verzamel weefselmonsters uit primaire tumoren RNA, DNA of eiwit isolatie snap bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Voor primaire celkweek, verzamelen van weefselmonsters bij deze stap, zoals beschreven in hoofdstuk 9 hieronder. Bevestig de resterende ledematen weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologie en immunochemisproberen, waaronder hypoxyprobe-1 detectie.
  9. Controleer de dieren voor vervoer, pijn en voedselconsumptie tijdens de eerste 6 uur na de operatie en vervolgens dagelijks gedurende 3 dagen. Injecteer de analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) dagelijks gedurende 3 dagen. Verwijder de wond clips 10 dagen na amputatie met behulp van een wond clip remover.

6. Monitoring muizen voor de aanwezigheid van metastasen

  1. Let op de muizen elke dag en een week te evalueren ze klinische tekenen van een metastase ten minste tweemaal.
    1. Observeer de dieren op de aanwezigheid van macrometastases presenteren als massa's die zich ontwikkelen op verschillende locaties, typisch schouders, contralaterale poten en kaken. Daartoe zorgvuldig palperen hoofd, nek en okselstreek en contralaterale achterbeen. Controleer op inwendige organen uitzaaiingen via een opgezette buik, samen met MRI-scan.
    2. Controleren op de aanwezigheid van longmetastasen door de xyphoid proces (de onderkant van het borstbeen) met index vinger. 24
      LET OP: Deze druk vermindert het middenrif ademhaling capaciteit. Muizen met geavanceerde longmetastasen vertonen tekenen van ademnood gemanifesteerd door moeizame ademhaling.
    3. Observeer de dieren neurologische symptomen, zoals verlamming en ataxie suggereren metastasen aan het centrale zenuwstelsel.
    4. Controleer de muizen ten minste eenmaal per week voor gewichtsverlies, als indicatie van potentiële ziekteprogressie. Gewichtsverlies van meer dan 15% van de pre-procedure gewicht wordt beschouwd als een humaan eindpunt.

7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) voor het detecteren van Metastases

  1. Voer MRI om uitzaaiingen op gewenste tijdstippen te detecteren. 18
    LET OP: In de huidige studie werd een 7-Tesla horizontale spectrometer gebruikt. MRI werd uitgevoerd op dag 15 en 35 na de amputatie voor SK-ES1 cellen en op dag 15 voor TC71 cellen.
  2. Plaats de muis in een anesthesie inductie chamber met 1-3% isofluraan in een gasmengsel van 30% zuurstof en 70% stikstofoxide.
  3. Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
  4. Breng de verdoofde muis op een stereotaxische houder met ademhaling en temperatuur monitorization met continue toediening van 1,5% isofluraan en 30% lachgas. Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. Afbeelding van het dier, hetzij in een 40 of 23 mm Bruker muis volume spoel voor het gehele lichaam of brain imaging, respectievelijk.
  5. Gebruik een tweedimensionale, T2-gewogen RARE sequentie: TR = 3000 msec, TE = 24 msec, matrijs = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, plakdikte = 0,5 mm, RARE factor = 4 en gemiddelde = 4. 18
  6. Plaats het dier in een warme herstel kooi en monitoren continu tot wakker.
    NB: De muizen zal snel herstellen, omdat een ondiepe vlak van anesthesie wordt gebruikt.
  7. Bewaken van de dieren tijdens de eerste 6 uur na beeldvorming om ervoor te zorgen dat er geen nadelige effecten van de narcose.

8. euthanasie en autopsie

  1. Euthanaseren de muizen eenmaal het heden met uitzaaiingen aantoonbaar met MRI en / of klinische symptomen van progressie van de ziekte dieren.
    LET OP: In de huidige studie werden de muizen op dag 50 gedood en 25 post-amputatie voor dieren die SK-ES1 en TC71 xenotransplantaten, respectievelijk. In sommige gevallen eerder euthanasie noodzakelijk vanwege een hoge belasting metastase.
  2. Euthanaseren de muizen door blootstelling aan CO2 op 1,5 l / min (CO 2 bij 10 - 30% van de euthanasie kamer vol / min). Om dier dood te garanderen, uit te voeren cervicale dislocatie na CO 2 blootstelling.
  3. Spuit de hele muis met 70% ethanol en plaats deze in de laminaire stroming kap. Verzamel het bloed door het hart doorboren met behulp van een 25 G ½ naald met een 1 ml spuit en transfer naar een bloedinzameling tuzijn die 2 mg van EDTA.
  4. Verzamel de volgende weefsels: milt, bijnieren, eierstokken, nieren, lever, longen, hersenen, rechterbeen, beenmerg zowel humeri en de wervelkolom, alsmede macroscopische metastasen aanwezig in andere locaties. 25,26
  5. Fix helft van elk weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologie en immunochemische, waaronder hypoxyprobe-1-detectie. Snap bevriezen de andere helft in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor RNA, DNA of eiwit isolatie. 25,26 Voor primaire celkweek, het verzamelen van weefselmonsters zoals beschreven in hoofdstuk 9 hieronder.

9. Primaire Cell Culture

  1. Om primaire celkweek te voeren, ontleden weefsel van de geamputeerde ledemaat (paragraaf 5 hierboven) of tijdens de autopsie (paragraaf 8 hierboven) onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap.
  2. Bereid celkweekmedia geschikt is voor de cellijn die voor orthotope injecties, aangevuld met penicilline (200 eenheden / ml),streptomycine (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) en 0,2% mycoplasma profylactische antibiotica. Plaats 2,5 ml van de primaire kweekmedium in een 6-cm celkweek plaat.
  3. Selecteer levensvatbaar tumorweefsel gebieden uit primaire tumoren of metastasen, en vervolgens 2-3 segmenten van 2-3 mm elk met behulp van steriele schaar te isoleren.
    OPMERKING: vitaal tumorweefsel wordt meestal aan de randen van de tumor en kan necrose worden onderscheiden door zijn roze of rode kleur, glans en significante algehele natte uitstraling. Daarentegen wordt necrotisch weefsel vaak gezien in het midden van de tumor en presenteert als een witachtige / crème kleur massa met een doffe, kaasachtige verschijning. 27
  4. Breng de geïsoleerde segmenten om een ​​6-cm celkweek plaat die primaire kweekmedium in stap 9.2 beschreven.
  5. Kweekcellen onder standaard condities, zoals beschreven in hoofdstuk 1 (NB) en 9.2. 18,28 Controleer de cultuur voor mobiele uitgroei die voortvloeien uit het weefsel stukken, which worden waargenomen binnen een paar dagen. Zodra cellen te bereiken samenvloeiing, trypsinize en propageren ze volgens de standaard celcultuur technieken.
    OPMERKING: De primaire celkweek kan vervolgens worden gebruikt om groei en metastatische eigenschappen van de cellen afkomstig van controle- en hypoxische tumoren, en hun moleculaire functies te evalueren, zoals eerder beschreven. 18

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na injectie van ES-cellen in gastrocnemiusspier, worden de primaire tumoren kunnen groeien tot een kuitomvang van 250 mm 3 (figuur 1, 2). De tijd die nodig is voor de tumoren bereikt dit volume varieert kenmerkend 10-15 dagen TC71 20-25 dagen SK-ES1 xenotransplantaten, respectievelijk. Tumoren op een kalf volume van 250 mm3 vertonen een relatief lage endogene hypoxie (ongeveer 3% van tumorweefsel), gebaseerd op hypoxybrobe-1 (pimonidazole) kleuring ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons model omvat de vergelijking van metastase in twee experimentele groepen - een controlegroep, waarbij tumoren kunnen ontwikkelen in de achterpoot, gevolgd door amputatie van een kalf volume van 250 mm3 bereiken en een hypoxie blootgestelde groep, waarbij de tumor lager achterbeen wordt onderworpen aan FAL hetzelfde volume, gevolgd door amputatie 3 dagen later. Hoewel in deze experimenten de FAL behandelde tumoren worden geamputeerd met enige vertraging ten opzichte van de controlegroep tumoren, is hun groo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (NIH)-subsidies: UL1TR000101 (voorheen UL1RR031975) via het Clinical and Translational Science Awards-programma, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 en 1R21CA198698 aan JK. MRI werd uitgevoerd in het Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) van het Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center en weefselverwerking in de Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center's Histopathology & Tissue Shared Resource, beide ondersteund door NIH/NCI-subsidie P30-CA051008. De auteurs danken Dan Chalothorn en James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, voor hun hulp bij postmortem röntgenangiografie en het verschaffen van inzicht en expertise over collaterogeneze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cellsATCC
TC71 Human ES cellsVriendelijk verstrekt door Dr. Toretsky
McCoy's 5A (gewijzigd) MediumGibco by Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSSigma-AldrichF2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco by Life Technologies25200-056
Penicillin-StreptomycinGibco by Life Technologies15140-122
Fungizone® AntimycoticGibco by Life Technologies15290-018
MycoZap™ ProphylacticLonzaVZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetrationBD Biosciences354249
SCID/beige muizenHarlan of Charles River250 (Charles River) of 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes met permanent bevestigde 28 G ½ naaldBD329424
Saline (0,9% natriumchloride-injectie, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
Digitale schuifmatenWorld Precision Instruments, Inc501601
Chirurgische werktuigenFine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazolhydrochloride vast)HPI, IncHP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)HPI, IncCCI-103F-250mg
Povidon-jodium SwabstickPDIS41350
Steriele alcohol preparaat padFisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M. (oogvocht ooglijfolie) Major PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Onderlagen met waterdichte vochtbarrièreVWR56617-014 
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper met maat 50 mesOster078005-050-002 (kniptang), 078919-006-005 (mes)
Nair Lotion met babyolieChurch & Dwight Co., Inc.
Zijde 6-0Surgical Specialties Corp752B
Prolene (polypropyleen) hechtdraad 6-0Ethicon8680G
Vicryl (Polyglactin 910) hechtdraad 4-0 EthiconJ386H
Fisherbrand Applicators (Gepuurd katoen)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam Absorbeerbare tandsponsjes - Maat 4Pfizer Pharmaceutical9039605
Autoclip Wondclip ApplicatieBD427630
Stereo MicroscoopOlympusSZ61
Autoclip verwijderaarBD427637
Aound clipBD427631
MRI 7 TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0 softwareBruker Corporation
CO2 Euthanasie systeemVetEquip
25 G 5/8 Naald (voor hartpunctie)BD305122
0,1 ml spuit (voor hartpunctie)TerumoSS-01T
K3-EDTA Microbuis 1,3 mlSarstedt41.1395.105
10% Neutraal Boter FormaldehydeFisher ScientificSF100-4

Referenties

  1. Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
  2. Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
  3. Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
  4. Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
  5. Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
  6. Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
  7. Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
  8. Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
  9. Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
  10. Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
  11. Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
  12. Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
  13. Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
  14. Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
  15. Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
  16. Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
  17. Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
  18. Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
  19. Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
  20. Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
  21. Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
  22. Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
  23. Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
  24. Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
  25. Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
  26. Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
  27. Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
  28. Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
  29. Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
  30. ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Tumorhypoxieligatie van de arteria femoralisorthotopische xenotransplantatieEwing-sarcomcellenHypoxyprobe-1-kleuringmetastase-analyseprimaire tumorgroeiischemie van de achterpootSCID Beige-muizen
In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.