Hier presenteren we een protocol dat de middelmatige tot hoge doorvoer functionele karakterisering van gen- en promotorconstructies in secundair stamweefsel van bomen binnen relatief korte tijdsbestek mogelijk maakt. Het is efficiënt, gemakkelijk te gebruiken en breed toepasbaar op een reeks boomsoorten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Secundaire groei stam in de bomen en de bijbehorende houtvorming zijn aanzienlijk, zowel uit biologische en commerciële perspectieven. Echter, relatief weinig bekend is over de moleculaire controle die hun ontwikkeling regeert. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de fysieke, middelen en tijd beperkingen vaak geassocieerd met de studie van de secundaire groeiprocessen. Een aantal van de in vitro technieken zijn gebruikt waarbij het gaat om planten een deel of de hele plant systeem in zowel houtige en niet-houtige plantensoorten. Echter, vragen over hun toepasbaarheid voor de studie van de secundaire groei stam processen, de weerbarstigheid van bepaalde soorten en arbeidsintensiteit zijn vaak onbetaalbaar voor medium tot high throughput toepassingen. Ook als we kijken naar steel ontwikkeling en houtvorming secundaire de specifieke kenmerken in het kader van het onderzoek mogelijk alleen meetbare worden laat in de levenscyclus van een boom na een aantal jaren van groei. Bij het aanpakken van deze uitdagingen alternatief in vivo protocols zijn ontwikkeld, genaamd-geïnduceerde somatische Sector Analysis, die de oprichting van transgene somatische weefsel sectoren direct te betrekken bij het voortgezet stengel van de plant. Het doel van dit protocol is een efficiënte, eenvoudige en relatief snelle manier om transgene plantenweefsel secundaire voor gentherapie en promotor functionele karakterisatie die kunnen worden gebruikt in verschillende boomsoorten creëren verschaffen. Hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat transgene stam sectoren voortgezet kan worden gemaakt in alle levende weefsels en celtypen secundaire stengels van verschillende boomsoorten en hout morfologische kenmerken, zowel als promotor expressiepatronen in secundaire stengels beheersbaar zijn; vergemakkelijken gemiddeld tot hoog throughput functionele karakterisatie.
Inleiding
Boom stengels bevatten een aanzienlijke hoeveelheid van de planeten biomassa en zijn van grote biologische, culturele en commerciële belang. Secundaire stengels maken leefgebied door het verstrekken van middelen en onderdak voor vele andere levensvormen. Ze leveren tal van andere diensten van de ecosystemen waarin ze wonen en werken als een hernieuwbare grondstof voor de productie van hout, pulp en papier en andere hout en niet-houtproducten. Secundaire steel ontwikkeling en meer specifiek houtvorming wordt beheerst door complexe moleculaire systeem dat de ontwikkeling van specifieke celtypen reguleren, de biochemische samenstelling van hun celwanden en hoe zij worde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
- Voorafgaand aan experimenten, werpen nieuwe zaailingen van de gewenste boomsoorten uit zaad of snijden en te groeien boom / s tot de diameter van de steel in de zone voor de experimenten bij benadering 1 cm in diameter.
Opmerking: De tijd die nodig is kan variëren als gevolg van de groei van planten tarieven dus mogelijk tussen 08:57 maanden voor deze stap.
2. Binary Vector Creation
- Voeren werk uit deze rubriek te vinden in hoofdstuk 7 in een laboratorium of kas waar Agrobacterium tumefaciens kan worden behandeld en dat de nodige persoonlijke beschermin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met dit protocol alle live secundaire stamcellen en weefseltypes is aangetoond dat vatbaar zijn A. tumefaciens transformaties en gedefinieerd in typen sector op basis van het celtype oorspronkelijk getransformeerde en latere ontwikkelingsstoornissen groeipatroon. Sector typen zijn periderm, floëem, cambial, wond parenchym en tylose (figuur 1b, 1c, 1d) en is te vinden in consistente locaties te beschrijven in het vervolg van deze.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ISSA protocol is een relatief eenvoudige en efficiënte methode voor het creëren van transgene stam weefsels in boomsoorten in de ruimte van een paar maanden voor de analyse van genen en promoters van belang betrokken zijn in hout en steel formatie. Kleine moeite, voorbij het houden van planten in leven, is nodig om transgene stam weefsel na inenting, die staat in tegenstelling tot in vitro methoden, waar uitgebreide kweek is nodig om weefsel of planten, waar de houtproductie kan tot jaar te beginnen of wanne.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de financieringssteun voor een aspect van het werk bedanken via Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) en LP0211919 (GB) en industriepartners Sappi en Mondi, evenals de Australian Postgraduate Award (EM) van de Australian Research Council en de Young Innovators and Scientist Award via het Australian Department of Agriculture (LT). We willen ook Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan en Simon Southerton bedanken voor de vele discussies en ideeën die ze naar voren brachten tijdens de ontwikkeling van dit protocol en aan Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel en Noemie Defaix voor hun hulp bij laboratoriumgere....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plants | NA | NA | Raadpleeg lokale kwekerijleveranciers voor planten zoals nodig |
| Agrobacterium strain | NA | NA | Er zijn veel mogelijke wegen om Agrobactrium-stammen te verkrijgen. We raden u aan contact op te nemen met uw lokale onderzoeksgemeenschap, aangezien er mogelijk beperkingen zijn bij het verkrijgen van de bacteriën in uw land en regio. |
| Binaair vector (gen en promotor) | NA | NA | We hebben een reeks vectoren ontwikkeld om het ISSA-protocol te gebruiken met behulp van het Gateway Recombinase-systeem. Dit omvat overexpressie, RNAi knockouts en promotorfusievectoren op basis van aangepaste pCAMBIA-vectoren en we zijn blij om te verstrekken indien nodig. Daarnaast zijn er veel vectoren beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap. |
| LB media | Sigma | L3022 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| LB media met agar | Sigma | L2897 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Antibiotica | Sigma | NA | Het catalogusnummer is afhankelijk van het antibioticum dat u nodig hebt, aangezien een reeks antibiotica worden gebruikt voor bacteriële selectie in binaire vectoren. Dit product kan van een reeks bedrijven worden verkregen |
| 50 ml Schroeftopbuizen | Fisher Scientific | 14-432-22 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| MS Media | Sigma | M9274 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Scalpelblad nr. 11 | Sigma | S2771 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Dit is het beste product om te gebruiken om het cambiale venster na de creatie te binden |
| 14 ml ronde buisjes met bodem | Thermo Scientific | 150268 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| EDTA | Sigma | E6758 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Triton | Sigma | X100 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| X-Gluc | X-GLUC direct | Je moet naar de website gaan om te bestellen - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Kaliumferricyanide(III) | Sigma | 244023 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Kaliumferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Litmuspapier | Sigma | WHA10360300 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Eenzijdige scheermesjes | ProSciTech | L055 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Tweezijdige scheermesjes | ProSciTech | L056 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Stelvink met schroefdop | ProSciTech | L6204 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Ethanol | sigma | E7023 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| LR wit | ProSciTech | C025 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Inbeddingsvorm | ProSciTech | RL090 | We bevelen deze variant aan, maar er zijn tal van opties beschikbaar |
| Wateroplosbaar montagemedium | ProSciTech | IA019 | Een voorbeeld van een montagemedium dat kan worden gebruikt, maar er bestaan ook andere opties die kunnen worden verkend. |
| Waterstofperoxide | Sigma | 216763 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| IJsazijn | Sigma | A9967 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Safranine O | ProSciTech | C138 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Dit is het instrument dat voor een deel van deze studie is gebruikt, maar elke andere SEM die een lage vacuümmodus heeft, kan worden gebruikt | |
| ImageJ beeldsoftware | kan worden verkregen via de volgende URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referenties
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinni....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
