Hier presenteren we een protocol dat de middelmatige tot hoge doorvoer functionele karakterisering van gen- en promotorconstructies in secundair stamweefsel van bomen binnen relatief korte tijdsbestek mogelijk maakt. Het is efficiënt, gemakkelijk te gebruiken en breed toepasbaar op een reeks boomsoorten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Secundaire groei stam in de bomen en de bijbehorende houtvorming zijn aanzienlijk, zowel uit biologische en commerciële perspectieven. Echter, relatief weinig bekend is over de moleculaire controle die hun ontwikkeling regeert. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de fysieke, middelen en tijd beperkingen vaak geassocieerd met de studie van de secundaire groeiprocessen. Een aantal van de in vitro technieken zijn gebruikt waarbij het gaat om planten een deel of de hele plant systeem in zowel houtige en niet-houtige plantensoorten. Echter, vragen over hun toepasbaarheid voor de studie van de secundaire groei stam processen, de weerbarstigheid van bepaalde soorten en arbeidsintensiteit zijn vaak onbetaalbaar voor medium tot high throughput toepassingen. Ook als we kijken naar steel ontwikkeling en houtvorming secundaire de specifieke kenmerken in het kader van het onderzoek mogelijk alleen meetbare worden laat in de levenscyclus van een boom na een aantal jaren van groei. Bij het aanpakken van deze uitdagingen alternatief in vivo protocols zijn ontwikkeld, genaamd-geïnduceerde somatische Sector Analysis, die de oprichting van transgene somatische weefsel sectoren direct te betrekken bij het voortgezet stengel van de plant. Het doel van dit protocol is een efficiënte, eenvoudige en relatief snelle manier om transgene plantenweefsel secundaire voor gentherapie en promotor functionele karakterisatie die kunnen worden gebruikt in verschillende boomsoorten creëren verschaffen. Hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat transgene stam sectoren voortgezet kan worden gemaakt in alle levende weefsels en celtypen secundaire stengels van verschillende boomsoorten en hout morfologische kenmerken, zowel als promotor expressiepatronen in secundaire stengels beheersbaar zijn; vergemakkelijken gemiddeld tot hoog throughput functionele karakterisatie.
Inleiding
Boom stengels bevatten een aanzienlijke hoeveelheid van de planeten biomassa en zijn van grote biologische, culturele en commerciële belang. Secundaire stengels maken leefgebied door het verstrekken van middelen en onderdak voor vele andere levensvormen. Ze leveren tal van andere diensten van de ecosystemen waarin ze wonen en werken als een hernieuwbare grondstof voor de productie van hout, pulp en papier en andere hout en niet-houtproducten. Secundaire steel ontwikkeling en meer specifiek houtvorming wordt beheerst door complexe moleculaire systeem dat de ontwikkeling van specifieke celtypen reguleren, de biochemische samenstelling van hun celwanden en hoe zij worden weefsels en organen te vormen. Ontrafeling van de moleculaire basis van secundaire ontwikkeling steel en houtvorming wordt verstoord door vele factoren, waaronder de variabiliteit van hout en steel eigenschappen binnen en tussen de stengels, lange generatie tijden, out-kruising paring systemen, hoge heterozygotie, hoge genetische belasting, seizoensgebonden slaaptoestand, lang volwassentrait vestiging periodes en de enorme fysieke grootte van volwassen bomen. Hierdoor begrip secundaire steel ontwikkeling ten opzichte van de gedetailleerde kennis van de meeste andere aspecten van de moleculaire controle van plantenontwikkeling, nog in de kinderschoenen.
Een aantal in vitro technieken zijn gebruikt voor onderzoek en begrijpen secundaire stam ontwikkeling, met name hout en secundaire vorming celwand. Deze protocollen gepaard met het gebruik van de gehele plant of deel systemen, waarbij ofwel transgene planten worden gemaakt of specifieke secundaire cellen of weefsels worden getransformeerd voor de studie van specifieke aspecten van hout en / of secundaire stuurpen ontwikkeling 1. Transgene planten kunnen worden gewonnen na genetische transformatie van diverse plantaardige weefsels en celtypen, maar het is een langzame, met name bij de analyse houtvezel eigenschappen vanwege de lange regeneratie en steel rijpingstijden (in de orde van jaren), hoge technische en arbeid demands, lage omzet van kandidaatgenen alsook problemen in het propageren van een aantal houtachtige plantensoorten. Soortgelijke technieken zijn ontwikkeld in niet-houtige modelsysteem zoals Arabidopsis die succesvol sommige van deze beperkingen te overwinnen, maar niet alle secundaire stamcellen celtypen een aanwezig in deze stammen en kenmerken in verband met seizoensinvloeden levensduur kan niet worden onderzocht bij deze soorten 2. Als alternatief plantendeel systemen, zoals Pinu s radiata calluscultures 3 vermindering van de bijbehorende termijnen. Deze werkwijzen zijn echter beperkt tot de studie van een celtype en lijden soortgelijke beperkingen als vermeld in vitro experimenten. Ook apicale stam culturen 4 waarbij hele stam explantaten hebben aangetoond belofte, maar nog niet zijn toegepast voor de studie van specifieke genen of promotoren van belang. Meer recent is een alternatief protocol waarbij hairy wortelkweken ontwikkeld voor eucalyptus en is met succes5 toegepast, deze wijze nog nodig vitro kweek, omvat zijwortels plaats stengels en tot op heden is beperkt tot één boomsoorten.
Geïnduceerde somatische sector analyse (ISSA), zoals hier beschreven, is ontwikkeld om een aantal van deze problemen het verstrekken van een medium tot high throughput screening functionele tool voor genen en promoters met een vermoedelijke rol in hout vorming en ontwikkeling secundaire stam weefsel te overwinnen. ISSA is een in vivo transformatie en screening systeem dat is ontwikkeld om de tijd voor transgene cellen en weefsels produceren een intacte secundaire stam het ondervangen arbeid verminderen, technische en doorvoer beperkingen van routinematig gebruikt in vitro werkwijzen. De hier beschreven protocollen zorgen voor het gelijktijdig creëren van honderden onafhankelijk getransformeerd weefsel sectoren en cellen in secundaire stengels binnen een korte tijd, in de boomsoorten weefsel van belang zonder gGenetic en / of milieu variatie binnen relatief korte tijd frames en de lage arbeidskosten. ISSA in vivo technieken werden voor het eerst beschreven voor het voortgezet steel 6 en bud 7 weefsels en hebben sindsdien in het voortgezet stam weefsel werd verfijnd door studies van genen en / of promoters die betrokken zijn bij cambial differentiatie en omvatten: tubuline (TON) 8, fascicline-achtige arabinogalactan ( FLA) 9, cellulose synthase (CESA) 10, secundaire celwand geassocieerd NAC domein (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 en echt interessant nieuw gen (RING) H2 eiwit 13. Deze studies werden uitgevoerd in het voortgezet stengels van populieren en eucalyptus planten en gaf inzicht in de cel morfologie, celwand chemie en genexpressie.
De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om de ervaring een samenbrengennd kennis die is opgedaan door de ontwikkeling en toepassing van ISSA uit een reeks van gepubliceerde en ongepubliceerde studies in het afgelopen decennium. Zij richten zich op de in vivo transformatie van secundaire stam weefsels 6 en zich concentreren op studies met Populus alba 'pyramidalis' kloon, Eucalyptus globulus evenals 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen. Dit document neemt onderzoekers via het protocol van het kweken van planten en bacteriën, de transformatie van stamcellen weefsels, de groei en de oogst van het weefsel, de identificatie van transgene cellen en weefsels, voorbereiding op fenotypische evaluaties en methoden voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Terwijl technieken zijn met succes toegepast op de celwand monosaccharide samenstelling meet ook 9,11, als gevolg van de beperkte ruimte, dit document richt zich op technieken die worden gebruikt voor het meten van cellen en weefsel morfologie en het begrijpen van genexpressie patronen in het voortgezet stalleen ems. Dienovereenkomstig, het protocol zoals geschetst is geschikt voor mensen op zoek naar meer inzicht in de rol en / of expressie van genen in verband met secundaire krijgen stelen met behulp van een low cost, technisch eenvoudig, en medium tot high throughput methode.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
- Voorafgaand aan experimenten, werpen nieuwe zaailingen van de gewenste boomsoorten uit zaad of snijden en te groeien boom / s tot de diameter van de steel in de zone voor de experimenten bij benadering 1 cm in diameter.
Opmerking: De tijd die nodig is kan variëren als gevolg van de groei van planten tarieven dus mogelijk tussen 08:57 maanden voor deze stap.
2. Binary Vector Creation
- Voeren werk uit deze rubriek te vinden in hoofdstuk 7 in een laboratorium of kas waar Agrobacterium tumefaciens kan worden behandeld en dat de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen voor het laboratorium voorgeschreven wordt gebruikt.
- Bereid een binaire vector die ofwel een gen van belang knockdown of overexpressie cassette en een β-glucuronidase (GUS) reportergen cassette of een promoter van belang gefuseerd met een GUS-gen afhankelijk van het type onderzoek.
Opmerking: Er zijn een aantal binaire vector backbones die in de handel of kunnen worden geproduceerd door middel van onderzoeksnetwerken evenals tal van technieken om genen en promotoren van belang in te voegen in binaire vectoren. In het kader van dit protocol is het aan de experimentator om de beslissing over de wijze waarop een binaire vector te maken te maken. - Transformeren binaire vector in een ontwapende stam van A. tumefaciens met behulp van elektroporatie of heat shock 14 en op te slaan op de juiste wijze totdat het nodig is voor experimenten.
- Herhaal stap 2.2 voor positieve en / of negatieve controles.
Opmerking: Negatieve controles moet een binaire vector die geen gen van interesse voor een gen van interesse studie en een promoter GUS voor een promoter van interesse studie omvatten. Positieve controle voor een promoter van interesse studie moet een bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (CaMV35S) gefuseerd met een GUS reporter.
3. Bereiding van A. tumefaciens voor Inenting
- Ten minste een week vóór experimentation, neem een kleine hoeveelheid (ongeveer 1 pl) van A. tumefaciens voorbereid tijdens stap 2.2 en 2.3 en verspreid dun op aparte LB-medium met agar 14 platen met geschikte antibiotica voor bacteriële selectie. Groeien bij 28 ° C in een incubator om kleine kolonies vormen en bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig.
- 48 uur voor experimenteren, dragen een kolonie van A. tumefaciens van elke plaat in afzonderlijke 50 ml met schroefdop buizen met 5 ml voorverwarmde (28 ° C) LB-medium 14 die geschikte antibiotica voor bacteriële selectie en schud bij 200 rpm op een shaker incubator gedurende ongeveer 48 uur bij 28 ° C tot mengsel is erg bewolkt.
- Tussen 4-6 uur voorafgaand aan het enten van stengels (deel 4) voeg 1 ml van de LB / A. tumefaciens mengsel in een verse 50 ml buis met schroefdop 19 ml (1:20 verdunning) vers warm (28 ° C) LB-medium met geschikte antibioticabacteriële selectie. Als optische dichtheid (OD) bij 600 nm (OD 600, zoals gemeten door spectroscopie) boven 0,1, verdund verder met warme LB totdat dit wordt bereikt.
- Plaats verdund LB / A. tumefaciens mengsel weer op de shaker incubator schudden onder dezelfde omstandigheden (200 rpm, 28 ° C) tot OD 600 tussen 0,4-0,6 en verwijderen.
- Centrifuge LB / A. tumefaciens mengsel gedurende 15 min bij 1000 xg en 4 ° C.
- Giet vloeistof en onmiddellijk mengen A. tumefaciens pellet in 1 ml gekoelde MS media 15, over te brengen naar 2 ml microbuisjes en op te slaan op ijs tot die nodig is voor enting (deel 4). Deze oplossing wordt aangeduid als Enten Media.
4. Enten van Plant Stem met A. tumefaciens
- Start experimenten tijdens de late voorjaar of de vroege zomer met behulp van planten die in paragraaf 1, die een actieve en snelgroeiende cambium hebben. Een goede diagnostisch voor eenactieve en snelgroeiende cambium is dat het floëem gemakkelijk kan worden afgepeld van het xyleem.
- Een duidelijke rechte stuk stengel nabij de basis van de plant en alle bladeren en takken te verwijderen.
- Met behulp van een scherpe scalpel (bij voorkeur No. 11) of scheermesje, maak een 1 cm 2 'cambial venster' in een vrije doorsnede van de stam door de invoering van twee verticale parallelle incisie door het floëem van 20 mm in de lengte en een 5 mm van elkaar dan een horizontale snede dat de twee verticale sneden hun basale einde verbindt.
- Schil het floëem strook door de insnijding boven het ontwikkelen xyleemweefsel belichten en voldoende Inoculatie Media toevoegen van 3,6 stap op het oppervlak van de blootgestelde ontwikkelen xyleem pipetteren (typisch 5-10 pl) nat. Onmiddellijk plaats de floëem strip.
- Bind het floëem strip aan de steel goed af met Parafilm.
- Herhaal stap 4,2-4,5 voor extra cambial vensters voor de gen (en) of de promotor (s) van belang tot eenny nieuwe cambial ramen minste 1 cm boven of onder andere cambial ramen en bij een 90 ° verschuiving.
- Volledige stappen 4,2-4,5 voor de positieve en negatieve controlevectoren (stap 2.4) zodat elk vector wordt toegevoegd aan dezelfde stam van elke plant gebruikt in het experiment.
- Monitor groei stengeldiameter regelmatig en oogst GUS-test (punt 5) als radiale groei van ten minste 5 mm waargenomen in stammen.
Opmerking: De hoeveelheid radiale groei nodig is afhankelijk van de hoeveelheid weefsel vereist voor downstream analyse.
5. Oogsten voor GUS histologisch Assay
- Accijnzen de 'cambial window' van de stengel verwijderen van elk weefsel geen deel uit van de nieuwe groei binnen de cambial venster.
- Voor studies met betrekking tot xyleem en floëem cel / weefsel morfologie rijpen, schil de floëem van het xyleem.
- Voor studies waarbij de cambial zone moet intacte promoter of expressiepatronen nog worden beoordeelded, snijd de cambial raam dwars met een scheermesje of een ander scherp mes in schijven van tussen de 0,5 en 1 mm dik.
- Plaats verwerkt cambial venster weefsels in 14 ml ronde bodem buizen en tweemaal spoelen met 0,1 M fosfaatbuffer bij pH 7 14. Controleer of het weefsel volledig ondergedompeld blijft in oplossing gedurende ten minste vijf minuten en alle overmaat oplossing wordt verwijderd eind de tweede spoeling.
- Voeg 5 ml GUS reagens (0,5 mM X-gluc (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-glucuronzuur), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM kalium ferricyanide (III), 0,05 mM kaliumferrocyanide (II), aangevuld tot eindvolume van 0,1 mM fosfaatbuffer pH 7,. zie Hawkins et al 16) aan elke buis. Als weefsel niet volledig onder water, voeg extra GUS reagens.
- Incubeer buizen gedurende 10 minuten bij 55 ° C in het donker.
- Incubeer buizen nog eens 12-16 uur op een shaker incubator bij 37 ° C in het donkermiddels voorzichtig roeren (tussen 30 en 60 rpm) om te mengen.
- Na verwijdering van shaker incubator willekeurig controleer de pH van GUS reagens in een klein deel van de buizen met behulp van lakmoespapier met een pH-bereik 0-7.
- Als een van de buizen een pH van minder dan 6 labelen. Blijf de rest van de buizen controleren op pH bevestigen en het etiket als pH 6 of lager.
Opmerking: De monsters met een pH beneden 6 kan niet geschikt zijn voor analyse. Deze monsters van verdere analyse worden uitgesloten.
- Als een van de buizen een pH van minder dan 6 labelen. Blijf de rest van de buizen controleren op pH bevestigen en het etiket als pH 6 of lager.
- Decanteer GUS reagens en vervangen door 70% ethanol voldoende om weefsel te dekken.
- Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is.
6. Identificatie van transgene Tissue
- Met behulp van een tang, neem alles uit de cambial venster weefsel uit een buis en plaats in de kleine lade of petrischaaltje mogelijk te maken voor microscopische visualisatie.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop tussen 1X en 4X vergroting identificeren en tally het aantal cellen of weefselsdie moeten een helder blauwe vlekken. Blauw gekleurde cellen of weefsel worden aangeduid als een sector vanaf dit punt. Tally ze op de volgende manieren.
- Voor monsters waar de floëem is verwijderd (stap 5.1.1), tel het aantal sectoren in cambial weefsel gevonden op het oppervlak van de ontwikkeling van xyleem (cambial sector, figuur 1a).
- Voor monsters die in schijven (stap 5.1.2) hebben gesneden, tel het aantal sectoren in de andere cel of weefsel types (figuur 1b, 1c, 1d). Sectoren kan worden gevonden in de volgende soorten weefsel: de periderm (periderm sector, figuur 1e), floeem (bastweefsel sector, figuur 1f), cambial weefsel (cambial sector, figuur 1g, 1h, 1I), wond parenchym (Wound Parenchyma Sector, Figuur 1j) en in thyllen (Tylose sector, figuur 1k).
- Tijdens een microscopischeBEOORDELING ervoor te zorgen dat beide zijden van een schijf zijn bekeken en dat sectoren die zich voordoen over twee schijven zijn op elkaar afgestemd zodat de nummers niet worden overschat.
- Plaats alleen het weefsel dat sectoren terug in de buis met 70% ethanol en opslag totdat het nodig is.
- Herhaal stap 6,1-6,3 voor bijkomende cambial vensters zoals de positieve en / of negatieve controle.
- Bereken de gemiddelde transformatie-efficiëntie voor ieder sector voor elk gen of promotor van belang en de controles afzonderlijk door het totale aantal sectoren te delen door het totale aantal van 1 cm 2 cambial ramen om een gemiddeld aantal transformatiegevallen per cm2 Cambium leiden geënt (ATScm -2).
- Ga verder met stap 7.2 en 8 voor de analyse van de promotor expressie patronen en stap 7.1, 7.2 of 7.3 voor technieken om cellen en weefsels morfologie beoordelen cambial weefsel.
7. Analyse van deCell en Tissue morfologie in cambial Tissue
Let op: Hieronder vindt u een selectie van technieken die met succes zijn gebruikt voor de analyse van de ISSA afgeleid monsters.
- Analyse van xyleem celoppervlak, lumenoppervlak, celwanddikte en celwand omgeving middels Scanning Electron Microscopy (SEM).
Let op: Dit protocol vereist een minimale monstervoorbereiding en zorgt voor een relatief hoge doorvoer van de sector analyse met betrekking tot de morfologische kenmerken geschetst.- Vanaf deze stap verder zorg er dan voor laboratoriumjas, oogbescherming en handschoenen worden gebruikt wanneer houtige weefsel wordt gehanteerd en behandeld.
- Identificeer een cambial sector voor analyse en maakt een incisie van ongeveer 0,5 mm tot weerszijden ervan middels een enkele rand scheermesje een schijf (Figuur 2a) te creëren.
- Snijd het overtollige xyleemweefsel laat ongeveer 1 mm van xyleem weefsel om de tangentiële kant van de sector (Figuur 2b).
- Voorzichtigly dwars doorgesneden door het midden van de sector met eenzelfde dubbele rand scheermesje (figuur 2c).
- Maak twee extra ondiepe radiale insnijdingen op het dwarsvlak weerszijden van sector tot de transgene weefsel (figuur 2d) af te bakenen. Als GUS kleuring niet diep zal doordringen in het weefsel te volgen langs de radiale bestanden van cellen aan weerszijden van lood weefsel gevonden op de cambial oppervlak.
- Bevestig bereid cambial sector gezicht tot stadium van een SEM pin stomp te monteren met behulp van SEM geleidende tape (figuur 2e) en in exsiccator te houden totdat het nodig is voor SEM visualisatie.
- Herhaal de stappen 7.1.2 tot en met 7.1.6 voor bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Met behulp van een SEM in een lage vacuüm-modus (energie 5 kV, spot 3,0 nm), visualiseren en neem foto's van de cellen / weefsel in de sector, evenals de cellen / weefsel direct naast de sector (figuur 2F). De hoeveelheid vergrotingafhankelijk van de kenmerken van belang. Voor xyleem vezels, 2,000X geschikt is (figuur 2G).
- Zodra een cambial sector is gevisualiseerd en foto's die met een geschikte vergroting, meten xyleem cel / weefsel morfologische kenmerken van belang het gebruik van image meetsoftware.
- Voor statistische analyse voeren meerdere paarsgewijze analyses gebruikmakend van gepaarde t-tests om het verschil tussen morfologische gemeten in de transgene sector en de naburige niet-transgene controle cellen / weefsel (gemeten in 0,5 mm uit sector rand) voor elke sector van een p bepalen vergelijk -waarde.
- Herhaal stap 7.1.10 voor de negatieve controle.
- Wanneer de positieve controle toont een lage p- waarde (α <0,05) Bereken het verschil tussen de transgene en naburige niet-transgene cellen / weefsel voor een morfologische eigenschap. Gebruik 'verschilwaarde in een gepaarde t-test om het effect van het gen van belang te vergelijken met de negative controle om een p-waarde te bepalen.
- Histochemische analyse van cambial cel / weefsel morfologie of promotor expressie patronen in stamcellen / weefsels met behulp van licht microscopie.
Opmerking: Terwijl meer tijd in beslag, deze methode zorgt voor meer analysemogelijkheden inclusief aspecten van cambial dynamiek, bijvoorbeeld cambial breedte als promotor expressie patronen. Bovendien, wanneer geen toegang een SEM Dit protocol kan worden gebruikt als alternatief voor stap 7,1.- Accijns sector plaats middels scheermesje en een aantal omliggende weefsel in kleine blokken (niet groter dan 1 mm 3) en plaats direct in 1-3 ml 100% ethanol in een monsterflesje met schroefdop ten minste 2 dagen bij 4 ° C op een schudinrichting. Bereid het blokje op een manier die het mogelijk maakt het oppervlak van belang worden benaderd door een microtoom.
- Herhaal dit voor eventuele bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Verwijder vloeistof en te vervangen door 25% ethanol: 75% LR wit mengsel gedurende 2 dagen het handhaven van omstandigheden.
- Herhaal stap 7.2.3 met 50% ethanol: 50% LR wit, 25% ethanol: 75% LR wit en dan eindelijk tweemaal met 100% LR wit.
- Plaats kleine blok in Inbedding Mold met het oppervlak van belang afgestemd op de korte kant en zorgvuldig bedekken met verse LR wit en polymeriseren volgens instructies van de fabrikant.
- Snijd 5 um secties van het oppervlak plaats op een roterende microtoom en monteren op een glasplaatje. Gebruik Safranine O (0,01%) kleuring celwand en / of andere functies te visualiseren.
- Voeg montage media, leg een deksel slip en laat 's nachts in te stellen.
- Bekijk onder een lichtmicroscoop tussen beeld vast te leggen 100X en 600X vergroting en.
- Leg morfologische kenmerken van beelden met behulp van beeld meetsoftware.
- Voor statistische analyse van de kwantitatieve morfologische kenmerken, volgen op stap 7.1.10.
- Voor de kwalitatieve analyse van morfologische kenmerken,vergelijken en beschrijven patronen waargenomen voor het gen of de promoter van belang en de negatieve en / of positieve controle.
- Analyse van microfibril Angle (MFA) in Gemacereerde Vezels met behulp van licht microscopie.
- Accijns transgeen xyleemweefsel direct van een sector en uit niet-transgene weefsel ernaast (binnen 0,5 mm, figuur 2h) en overbrengen in afzonderlijke 1,5 ml buizen. Herhaal dit voor eventuele bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Compleet stappen 7.3.3 tot 7.3.5 in een zuurkast.
- Voeg 250 ul van waterstofperoxide en 250 ui ijsazijn aan elke buis.
- Plaats buis verwarmingsblok bij 90 ° C gedurende 2 uur in zuurkast.
- Verwijder weefsel van buizen en zorgvuldig te spoelen met gedestilleerd water ten minste twee keer.
- Met behulp van een in water oplosbaar montage media, monteren weefsel op een glasplaatje en plagen elkaar met scherpe tang voorafgaand aan het aanbrengen van een cover slip.
- Uitzichtonder een lichtmicroscoop en vastleggen beelden van individuele vezels bij een vergroting van meer dan 400 x.
- Om microfibril hoek van vezels bepalen, meten de hoek tussen de put openingen en / of celwand strepen en de lange as van de vezel (figuur 2i) middels het meten software.
- Voor statistische analyse, volgen op stap 7.1.10.
8. Analyse van Promoter Expression Patterns
- Analyse van Promoter Expression Patronen in Secundaire Stem Doekjes.
- Kloppen de frequentie van elk type sector voor de promotor van belang en de positieve en negatieve controles uit stap 6.2.2.
- Vergelijk de frequentie van de verschillende types sector de promoter van belang met de positieve controle gebruikt chikwadraattoetsen p-waarden vast te stellen. Verdere analyse van de cel / weefsel specificiteit kan worden uitgevoerd met behulp van stap 7.2 als nodig is.
- Als er meer dan één promotorvan belang wordt onderzocht herhaal deze analyse maakt een vergelijking tussen alle initiatiefnemers van belang en de positieve controle.
- Als sectoren of blauwe vlekken worden waargenomen in de negatieve controle deze add vervolgens aan de analyse of te verlaten, afhankelijk van de omvang of als endogene kleuring wordt vermoed (zie Discussie).
- Analyse van Promoter Expression Patterns Tijdens cambial Afgeleide ontwikkeling en differentiatie.
- Met behulp van een stereomicroscoop, visualiseren cambial alle sectoren (figuur 1g, 1h, 1i) geïdentificeerd in stap 6,2 en bepaalt de aanwezigheid / afwezigheid van blauwe kleuring in drie typen weefsels afgeleid van het cambium; het floëem (P), de ontwikkeling van xyleem (X1) of ontwikkeld xyleem weefsel (X2) (zie figuur 3a).
- Volgens stap 8.1.2, vergelijkt de frequentie van aanwezigheid / afwezigheid van GUS kleuring in de P, X1 en X2 regio promotor interest met de positieve controle gebruikt chikwadraattoetsen p-waarden vast te stellen. Verdere analyse van de cel / weefsel specificiteit kan worden uitgevoerd met behulp van stap 7.2 als nodig is.
- Zie stappen 8.1.2.1 en 8.1.2.2 voor aanvullende overwegingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met dit protocol alle live secundaire stamcellen en weefseltypes is aangetoond dat vatbaar zijn A. tumefaciens transformaties en gedefinieerd in typen sector op basis van het celtype oorspronkelijk getransformeerde en latere ontwikkelingsstoornissen groeipatroon. Sector typen zijn periderm, floëem, cambial, wond parenchym en tylose (figuur 1b, 1c, 1d) en is te vinden in consistente locaties te beschrijven in het vervolg van deze...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ISSA protocol is een relatief eenvoudige en efficiënte methode voor het creëren van transgene stam weefsels in boomsoorten in de ruimte van een paar maanden voor de analyse van genen en promoters van belang betrokken zijn in hout en steel formatie. Kleine moeite, voorbij het houden van planten in leven, is nodig om transgene stam weefsel na inenting, die staat in tegenstelling tot in vitro methoden, waar uitgebreide kweek is nodig om weefsel of planten, waar de houtproductie kan tot jaar te beginnen of wanne...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de financieringssteun voor een aspect van het werk bedanken via Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) en LP0211919 (GB) en industriepartners Sappi en Mondi, evenals de Australian Postgraduate Award (EM) van de Australian Research Council en de Young Innovators and Scientist Award via het Australian Department of Agriculture (LT). We willen ook Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan en Simon Southerton bedanken voor de vele discussies en ideeën die ze naar voren brachten tijdens de ontwikkeling van dit protocol en aan Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel en Noemie Defaix voor hun hulp bij laboratoriumgerelateerd werk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plants | NA | NA | Raadpleeg lokale kwekerijleveranciers voor planten zoals nodig |
| Agrobacterium strain | NA | NA | Er zijn veel mogelijke wegen om Agrobactrium-stammen te verkrijgen. We raden u aan contact op te nemen met uw lokale onderzoeksgemeenschap, aangezien er mogelijk beperkingen zijn bij het verkrijgen van de bacteriën in uw land en regio. |
| Binaair vector (gen en promotor) | NA | NA | We hebben een reeks vectoren ontwikkeld om het ISSA-protocol te gebruiken met behulp van het Gateway Recombinase-systeem. Dit omvat overexpressie, RNAi knockouts en promotorfusievectoren op basis van aangepaste pCAMBIA-vectoren en we zijn blij om te verstrekken indien nodig. Daarnaast zijn er veel vectoren beschikbaar voor de onderzoeksgemeenschap. |
| LB media | Sigma | L3022 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| LB media met agar | Sigma | L2897 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Antibiotica | Sigma | NA | Het catalogusnummer is afhankelijk van het antibioticum dat u nodig hebt, aangezien een reeks antibiotica worden gebruikt voor bacteriële selectie in binaire vectoren. Dit product kan van een reeks bedrijven worden verkregen |
| 50 ml Schroeftopbuizen | Fisher Scientific | 14-432-22 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| MS Media | Sigma | M9274 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Scalpelblad nr. 11 | Sigma | S2771 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Dit is het beste product om te gebruiken om het cambiale venster na de creatie te binden |
| 14 ml ronde buisjes met bodem | Thermo Scientific | 150268 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| EDTA | Sigma | E6758 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Triton | Sigma | X100 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| X-Gluc | X-GLUC direct | Je moet naar de website gaan om te bestellen - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Kaliumferricyanide(III) | Sigma | 244023 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Kaliumferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Litmuspapier | Sigma | WHA10360300 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Eenzijdige scheermesjes | ProSciTech | L055 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Tweezijdige scheermesjes | ProSciTech | L056 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Stelvink met schroefdop | ProSciTech | L6204 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Ethanol | sigma | E7023 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| LR wit | ProSciTech | C025 | Hetzelfde product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Inbeddingsvorm | ProSciTech | RL090 | We bevelen deze variant aan, maar er zijn tal van opties beschikbaar |
| Wateroplosbaar montagemedium | ProSciTech | IA019 | Een voorbeeld van een montagemedium dat kan worden gebruikt, maar er bestaan ook andere opties die kunnen worden verkend. |
| Waterstofperoxide | Sigma | 216763 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| IJsazijn | Sigma | A9967 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Safranine O | ProSciTech | C138 | Een vergelijkbaar product kan van een andere onderneming worden verkregen |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Dit is het instrument dat voor een deel van deze studie is gebruikt, maar elke andere SEM die een lage vacuümmodus heeft, kan worden gebruikt | |
| ImageJ beeldsoftware | kan worden verkregen via de volgende URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referenties
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
