De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Samenvatting

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

Samenvatting

Het kenmerk van humorale immuniteit functionele ASC, die synthetiseren en afscheiden Abs specifiek voor een antigen (Ag), zoals een pathogeen, en worden gebruikt voor afweer genereren. Voor de kwantitatieve bepaling van de functionele status van de humorale immuunrespons van het individu, zowel serum Abs en circulerende ASC worden gewoonlijk gemeten als functionele uitlezingen. Bij mensen, perifeer bloed is de meest geschikte en gemakkelijk toegankelijk monster dat kan worden gebruikt voor de bepaling van de humorale immuunrespons opgewekt door gastheer B-cellen. Afzonderlijke B-cel subsets, zoals ASC, kunnen direct worden geïsoleerd uit perifeer bloed via geselecteerde lijn-specifieke Ab-geconjugeerde microparels of via celsortering met flowcytometrie. Bovendien kunnen gezuiverde naïeve en geheugen B-cellen worden geactiveerd en gedifferentieerd in ASC in de cultuur. De functionele activiteiten van ASC bijdragen aan Ab secretie kunnen worden met ELISpot, die een test waarmee enzym convergeert-gebonden immunoabsorptiekolom assay (ELISA) en western blotting technologieën om de opsomming van individuele ASC mogelijk te maken bij de single-cell niveau. In de praktijk is de ELISPOT er steeds meer gebruik vaccineffectiviteit evalueren vanwege het gemak van het hanteren van een groot aantal bloedmonsters. De werkwijzen voor het isoleren van humane B-cellen uit perifeer bloed, zal de differentiatie van B-cellen ASC's in vitro, en de toepassing van ELISPOT voor de kwantificering van totaal IgM- en IgG-ASCs hier beschreven.

Inleiding

B-cellen spelen een centrale rol bij de ontwikkeling van humorale immuniteit. Zij oorspronkelijk ontwikkeld in het beenmerg en in de bloedsomloop als naïeve B-cellen, die migreren naar lymfoïde weefsels zoals de milt, lymfeknopen, amandelen en, voor verdere ontwikkeling. Bij Ag ontmoeting, wat naïeve B-cellen migreren naar lymfoïde follikels, waar de germinal center B-cellen kunnen differentiëren in het geheugen B-cellen en plasmablasten (PBS) / plasmacellen (pc's). Terwijl de meeste PBS / PC egress in de bloedstroom, wat uiteindelijk een verblijf in het beenmerg naar terminale differentiatie ondergaan in langlevende PC ^1. B-cellen in omloop zijn heterogeen, en bij steady state, PBS / pc's zijn zeldzaam in het perifere bloed ^2. Door de beschikbaarheid van lijn-specifieke oppervlakte merkers, flowcytometrie is een populaire werkwijze voor de identificatie en karakterisering van de B-cel populaties in perifeer bloed. Een uitgebreide toepassing van stroom cytometry is de toevoeging van een celsorteerinrichting functie, die de scheiding en isolatie van afzonderlijke subsets van B-cellen met hoge zuiverheid mogelijk maakt. Op basis van de expressie van specifieke oppervlak receptoren in verschillende ontwikkelingsstadia, menselijke circulerende B-cellen worden in het algemeen in drie belangrijke subpopulaties ingedeeld: naïeve B-cellen (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), geheugen B-cellen (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), en PBS / pC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (figuur 1). Naïeve B-cellen door de natuur nog niet tegengekomen Ags. Ze kunnen echter worden onderscheiden in IgM ⁺ CD27 ⁺ B-geheugencel. Hoewel naïeve B-cellen homogeen tot expressie B-cel antigen receptor (BCR) geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld CD19, CD20 en CD22) zij zijn heterogeen in hun immunoglobulinerepertoire ^5. De meeste CD27 ⁺ B-geheugencel kan worden onderscheiden in CD27+ / hi CD38 ⁺ PBS / pc ^6. Bovendien, het geheugen B-cellen en PBS / PC's zijn polyklonaal en vertonen ontwikkelings- en functionele heterogeniteit ^4-7. PBS / pc's in omloop zijn meestal van korte duur en niet uitdrukken CD138, maar die maakte om zich te vestigen in het beenmerg zal terminaal differentiëren en uitgegroeid tot een lange levensduur. Terminaal gedifferentieerde pc's uitdrukken CD138 en down-reguleren van CD27-moleculen op hun oppervlak ^8. Aangezien zowel PBS en computers kunnen uitscheiden Abs zijn in veel gevallen worden ze collectief aangeduid als ASC. Daarentegen kan noch naïeve B-cellen of B-geheugencel aanzienlijke hoeveelheden Abs ^9-10 produceren. Niettemin, wanneer geïsoleerd, zowel naïef en memory B-cellen kunnen worden onderscheiden in ASC in 3-10 dagen wanneer geplaatst in de juiste kweekomstandigheden ^{6, 11-15.} In feite, ASC afgeleid van in vitro differentiatie aandeel vergelijkbaar oppervlak uitingen van CD27 en CD38 met de direct geïsoleerde frOM perifere bloed ^6. Bovendien, het ASC gedifferentieerd in vitro drukken een geringe oppervlakte CD20, op elkaar dat circulerende PBS / pc ^6. Hoewel de kweek afgeleide ASC's zijn korte duur, kunnen ze afscheiden Abs, wat aangeeft dat ze functioneel competent en kunnen bijdragen aan de humorale immuniteit.

Zowel ELISA en ELISPOT zijn veruit de meest toegepaste methoden waarmee functionele gegevens over de humorale immuunrespons te verkrijgen. ELISA is een 96-well-plaat gebaseerde bepaling, en wordt vaak gebruikt om de titers van serum Ag-specifieke Abs en andere analyten (bijvoorbeeld cytokines) te meten. Het is handig en schaalbaar. ELISA is ontworpen om een vaste fase enzym-assay om de aanwezigheid van Abs of andere stoffen, zoals serum te detecteren, in een vloeistofmonster ^16. De uitlezingen uit serum ELISA's op grote schaal gebruikt om de immuunrespons van het lichaam representeren. Een hulpmiddel voor de verwerving van readouts van ELISA assays is een spectrofotometer microplaat reader. De lezer kan de optische dichtheid (OD) van de eindproducten typisch resulterend uit de reactie van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde detectie Abs en hun specifieke substraten ¹⁷ bepalen. Met betrekking tot het rapporteren van de humorale immuunrespons, serum levels Ab bepaald met ELISA duiden het collectief, maar geen individuele prestaties van ASC in het lichaam. Bovendien ELISA geen rekening gehouden met de bijdrage van geheugen B-cellen, die niet afscheiden Abs.

Zoals ELISA, ELISpot is een veel gebruikte werkwijze voor het detecteren en volgen van de immuunreactie in perifere bloedmonsters ^17-18. ELISpot is een techniek soortgelijk aan een sandwich ELISA. Daarin worden cellen geplaatst in de polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan backed putjes van 96-putjes microplaten voor een korte termijn cultuur. De ELISPOT-test is analoog aan het uitvoeren van Western blotting op een microplaat en developing de vlekken op het PVDF membraan in elk putje. Een geautomatiseerde ELISPOT reader systeem of een stereomicroscoop voor handmatige telling vereist. Het belangrijkste voordeel van ELISPOT in het detecteren van een immuunreactie zijn uitstekende gevoeligheid in de kwantificering van ASC en cytokine-afscheidende cellen. Rapporteert de functionele activiteiten in humorale en cellulaire immuniteit, respectievelijk. In de meting van humorale immuunsysteem, zijn serum Ab niveau bepaald door ELISA en het aantal ASC erin genoemde ELISpot vaak gecorreleerd, maar de data uitlezingen uit deze twee assays hebben enkele verschillen in functionele implicaties ^19-20. Het belangrijkste voordeel van ELISpot is de gevoeligheid van de methode. De serum Ab titers gerapporteerd door ELISA wordt voorgesteld semi-kwantitatief OD uitlezingen, duidt de relatieve Ab niveau of meer kwantitatief, zoals concentreren uitlezingen bij een bekende hoeveelheid van de juiste isotypen van Abs is opgenomen ter referentie. Daarentegen zijn de resultaten van ELISpot zijn presented de absolute aantal ASC in een cel pool van belang (bijvoorbeeld gefractioneerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en gezuiverde B-cellen uit PBMC). ELISpot kan een enkele ASC te detecteren, maar ELISA vereist Ab bedragen van ASC geoptimaliseerde test-afhankelijke concentraties voorafgaand aan de meting te bereiken. Daarom ELISpot is duidelijk superieur aan ELISA gevoeligheid van kwantificering. Bovendien ELISpot is ook geschikt voor het kwantificeren van de in vitro gedifferentieerde ASC van geactiveerde B-geheugencel. Geheugen B-cellen niet scheiden Abs, maar kunnen differentiëren naar ASC bij activering; ze hebben dus geen bijdrage aan serum Abs gedetecteerd door ELISA. Aldus ELISpot is de voorkeursmethode bij het meten van de immuunrespons van circulerende geheugen B-cellen na activering in kweek. Het zorgt voor de controle op de handhaving van langdurige humorale immuniteit.

Protocol

Humaan perifeer bloed moet worden verkregen van gezonde donoren in het kader van informed consent, en het gebruik van bloedmonsters moeten voldoen aan de door de individuele institutionele review boards erkende richtlijnen. In deze studie, het protocol om menselijk bloed te gebruiken in een demonstratie van de resultaten van flowcytometrie (Figuur 1) en ELISpot assays (figuur 3) werd goedgekeurd door de interne Review Board van de National Taiwan University Hospital (protocol nummer 201307019RINB).

1. isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen

1. Teken ~ 10 ml bloed uit de mediaan cubitaal ader (in de cubital fossa anterior aan de elleboog) in een 15-mL buis met K ₂ EDTA (1,5 tot 2,0 mg / ml bloed) en onmiddellijk de buis omkeren meerdere malen te stollen te voorkomen vorming.
2. Voeg 35 mL autoclaaf (121 ° C, 15 min) rode bloedcellen (RBC) lysis buffer (150 mM _NH4CI, 10 mM _KHCO3 en 1 mM EDTA; pH 7,4) naar de buis die vers bloedmonster (≥ 3: 1 vol / vol) en incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende maximaal 5 minuten.
   Opmerking: Het uiterlijk van lichttransmissie door de buis geeft de beeindiging van RBC lysis.
3. Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat de pellet is wit van kleur.
4. Resuspendeer de pellet met 10 ml autoclaaf fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na ₂ HPO ₄ en 1,47 mM KH _{2PO 4,} pH 7,4) en gecentrifugeerd zoals in stap 1,3.
5. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet met 10 ml RPMI 1640 medium (supplementen: 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 0,25 ug / ml amfotericine B, en 2 mM L-glutamine) en plaat de cellen in een 10-cm cultuur schotel (10 ml bloed per gerecht). Plaats de schotel in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 30 minuten.
6. Zwenk de cultuur schotel een paar keer en plaats dekweekmedium (schorsing cellen) in 15 ml plastic conische buizen. Gooi de hechtende cellen (voornamelijk macrofagen) op kweekschalen.
7. Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
8. Resuspendeer de pellet met 1 ml RPMI 1640 medium. Tel het aantal cellen met een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
   OPMERKING: De levensvatbaarheid van de geïsoleerde leukocyten gewoonlijk meer dan 90% door trypan blauw exclusie.
9. Centrifuge in stap 1,7 en resuspendeer de cellen in ~ 200 pi koude PBS buffer (0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 5-10 x 10 ⁶ cellen / ml.
10. Voeg 5 ul gebiotinyleerd anti-humaan Ab cocktail specifieke bloedcellen (voor negatieve selectie van B-cellen) per 10 ⁶ cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min ^21.
    OPMERKING: De anti-humaan Ab cocktail moet tenminste Abs specifiek CD2 (of CD3), CD14 en CD16.
11. Voeg een 10-voudige overmaat volumesteriel PBS aan de cellen gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 5 min en gooi het supernatant.
12. Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine-geconjugeerd microbolletjes (5 ul per 10 ⁶ cellen) aan de pellet en meng.
13. Incubeer op ijs gedurende 30 min in een 15 ml plastic conische buis.
14. Voeg 2 mL PBS buffer in de buis.
15. Breng de buis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 min. De bruine microkorrels geleidelijk hechten aan de buiswand naast de magneet ^22.
16. De overige in de magnetische stand buis voorzichtig overdracht van de supernatant in een nieuwe steriele 15 ml buis ^22.
17. Herhaal stap 1,14-1,16, en combineren de twee supernatanten die de ongerepte B-cellen bevatten. Gooi de microbolletjes.
18. Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
19. Resuspendeer de pellet in RPMI 1640 medium voor downstream experimenten.
    LET OP: Typisch, 1-5 x 10 ⁵ B-cellen witha zuiverheid van meer dan 95% van 10 ml perifeer bloed kunnen worden geïsoleerd ^23.

2. Zuivering en scheiding van Herdenking en Naïve B Cellen van Geïsoleerde B-cellen

1. Gebruik cellen gezuiverd van stap 1 en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
2. Resuspendeer de cellen in 100 ul koud PBS buffer na centrifugatie bij 600 x g en kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
3. Voeg 1-2 ug gebiotinyleerd CD27 mAb per 10 ⁶ cellen en incubeer op ijs gedurende 30 min.
4. Voeg 10 mL van PBS buffer aan de buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten.
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 ui PBS buffer.
6. Voeg gelijke hoeveelheden streptavidine magnetische microkralen (1-2 ug / 10 ⁶ cellen) aan cellen in een 15 ml plastic conische buis.
7. Voorzichtig goed mengen en incubeer op ijs gedurende 30 min.
8. Voeg 2-3 ml PBS-buffer aan de buis.
9. Plaats debuis in een magnetische standaard en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de bruine microkralen te hechten aan de zijde het dichtst bij de magneet.
10. De buis in de magnetische stand voorzichtig breng de vloeistoffractie in een nieuwe steriele buis. Deze fractie bevat de verrijkte CD27 ^- naïeve B-cellen.
11. Voeg 5 ml tot de buis met de microbolletjes en voorzichtig resuspendeer de microbolletjes (dat wil zeggen, de verrijkte fractie van CD27 ⁺ memory B-cellen) ^24-25.
12. Centrifugeer bij 600 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellets met RPMI 1640 medium voor de stroomafwaartse experimenten.
    OPMERKING: Gewoonlijk ~ 30-60% van B-cellen kan worden gezuiverd zoals CD27 ⁺ geheugencellen van de PBMC van een gezonde donor ^{7, 25-26.}

3. Cell Sorting voor de inzameling van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc's

1. Met de cellen gezuiverd uit stap 1 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische cel teller.
2. Resuspendeer de cellen in koude PBS buffer bij een concentratie van 10 ⁷ per ml in 5 ml polystyreen buis.
3. Voeg 1-2 ug humaan IgG per 10 ⁶ cellen en incubeer op ijs gedurende 10 min voor het Fc blok.
4. Voeg 1 ug elk van anti-CD19-APC (kloon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (kloon: O323) en anti-CD38-PE (kloon: HIT2) per 10 ⁶ cellen; Meng goed en incubeer op ijs gedurende 30 min ^{4, 27.}
5. In de laatste 5 min in stap 3.4, voeg 5 pi van de commerciële 7-amino-actinomycine D (7-AAD).
6. Voeg 2 ml PBS aan de buis, vortex en centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten.
7. Resuspendeer de cellen in sortering buffer (steriel PBS met 2% BSA en 2 mM EDTA) bij een concentratie van 1-5 x 10 ⁷ cellen per ml in een 15 ml buis.
8. Filter de cellen door een nylon mesh cel zeef (40 um poriegrootte) naar cel klonten te elimineren.
9. Scheid de cellen met een flowcytometrische sorterener uitgerust met drie lasers: violet (405 nm), blauw (488 nm) en rode (640 nm).
   LET OP: De blauwe laser alleen al is voldoende voor 3-kleur cytometry ^27-28 stromen.
10. Sorteren van de cellen in drie 15-ml buisjes (die 5 ml RPMI medium) voor het gelijktijdig verzamelen van naïeve B-cellen (CD19 ⁺ CD27 ^-), geheugen B-cellen (CD19 ⁺ CD27 ⁺⁾ en PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / hi} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    OPMERKING: Gesorteerd naïeve en memory B cellen kunnen worden gekweekt zoals beschreven in stap 4.

4. In vitro differentiatie van de geïsoleerde menselijke CD19 ⁺ B-cellen, CD19 ⁺ CD27 ⁺ B-geheugencel, en CD19 ⁺ CD27 ^- Naïve B-cellen

1. Met de cellen gezuiverd stappen 1,19, 2,10, 2,11 en 3,10 Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer of een automatische celteller.
2. Resuspendeer de cellen met RPMI 1640 mediumbij een concentratie van 1 - 10 x 10 per ⁵ ml aliquot en deze in de putjes van een 12-wells plaat.
3. Voeg CpG (ODN 2006) bij 5 ug / 10 ⁶ cellen / ml ^{18, 29.}
4. Cultuur van de cellen in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 5 dagen.
5. Oogst de cellen uit elk putje, plaats ze afzonderlijk in 15 ml buizen, voeg 5 ml PBS aan elke buis en centrifugeer ze op 600 xg en KT gedurende 5 min.
6. Tel de cellen met een hemocytometer of een automatische celteller. Resuspendeer de cellen in een concentratie van 1-10 x 10 ⁵ per ml met RPMI 1640 medium.

5. Assay ELISpot

1. Voeg 30 ul van 35% ethanol in gedestilleerd water aan elk putje van de ELISPOT platen gedurende 30 s.
   OPMERKING: Bij pipetteren, raak het membraan in de putjes te allen tijde.
2. Keren de ELISpot platen om de ethanol te verwijderen.
3. Zet 150 ul van geautoclaveerd DDH ₂ O in elk putje en incubeerze op kamertemperatuur 5 minuten doorspoelen van de resterende ethanol; volg met een wassen steriel PBS bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
   OPMERKING: Stappen 5,1-5,3 is optioneel, afhankelijk van de vervaardiging van de platen.
4. Put 50 ui 5 ug / ml polyklonaal F (ab ') _2-fragment van anti-humaan Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in elk putje van de ELISPOT platen en incubeer ze bij 4 ° C overnacht (voorkeur) of 37 ° C gedurende 2 uur ^11.
   OPMERKING: Dicht de randen van platen met Parafilm tot gebruik.
5. Inverteer de platen om ongebonden Abs tweemaal verwijderen, voeg 200 ul van PBS aan elk putje en incubeer ze op kamertemperatuur 3 minuten per keer.
6. Voeg 200 ul PBS met 5% BSA (of RPMI 1640 medium) aan elk putje voor het blokkeren en incubeer ze op kamertemperatuur 2 uur.
7. De platen om de blokkerende buffer te verwijderen. Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5.
8. Voeg 100 ul RPMI 1640 medium aan elk putje en incubeer ze op 37 ° C.
9. Als u klaar bent om de cellen te zaaien, keren de platen aan de RPMI 1640 medium te verwijderen.
10. Zaad 100 pl (5 x 10 ^4), 50 gl (2,5 x 10 ^4), en 25 pl (1,25 x 10 ⁴⁾ van de cellen (van stap 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 en 4,6) in de putjes van een ELISpot plaat. Met RPMI 1640 medium, breng het volume op 150 ul / putje.
    Opmerking: Een minimum van één of twee 2-voudige seriële verdunningen van de cellen plateren wordt aanbevolen.
11. Incubeer de platen in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 8-14 uur ^18. Vermijd het verplaatsen van de platen tijdens de incubatie.
12. Inverteer de platen en de cellen RPMI 1640 medium te verwijderen.
13. Voeg 200 ul / putje PBS-T (PBS met 0,05% Tween 20) en incubeer ze 5 maal bij kamertemperatuur, elke keer gedurende 3 min. Keer de plaat om de wasbuffer tussen elk van de 5 wasbeurten verwijderen.
14. Voeg hetzij geit anti-menselijk IgG-alkalisch fosfatase (AP), Fcy-specifieke Abs (IgG detectie, 1: 5000 in PBS-T) Of geit anti-humaan IgM-AP, Fcμ fragment-specifieke Abs (voor IgM detectie, 1: 5000 in PBS-T) in de aangegeven putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur in het donker.
15. Was tweemaal met elk putje 200 pl PBS, als in stap 5,5.
16. Voeg 50 ul / putje bromochloroindolyl fosfaat-nitro blauw tetrazolium (BCIP / NBT) substraatoplossing. Paars-gekleurde vlekken normaal verschijnen in 5 - 15 min.
17. Voeg 100 ul / putje van DDH ₂ O om de over-ontwikkeling van vlekken te voorkomen.
18. Spoel de platen met stromend leidingwater na de volledige ontwikkeling van alle spots.
19. Verwijder de underdrain van de platen en laat ze aan de lucht drogen in het donker.
20. Tel de spots toepassing van een geautomatiseerde plaatlezer een beeldacquisitie / analyse-eenheid (bijvoorbeeld een automatische scanner of handmatig via een dissectie microscoop).
    OPMERKING: De platen kunnen worden bij kamertemperatuur in het donker bewaard en later geanalyseerd.

Resultaten

PBMC werden ontdaan van erytrocyten en hechtende cellen (stappen 1,2-1,7). Een monster (2 x 10 ⁶⁾ cellen werden onderworpen aan een flowcytometrische analyse om de populaties van naïeve B-cellen, B-geheugencel, en PBS / pc's in perifeer bloed (figuur 1) tonen. In PBMC van deze donor, ongeveer 10% van de lymfocyten waren CD19 ⁺ B-cellen. In de B-cel compartiment, het percentage van CD19 ⁺ CD27 ^- naïeve B-cellen was ongeveer ...

Discussie

Isolatie en zuivering van de humane perifere bloed B-cellen

Normaal gesproken kan RBC efficiënt worden verbroken en gewist door lysisbuffer (stap 1.2). Het is belangrijk om PBMC's met de RBC lysisbuffer langer dan 5 min incuberen, zoals levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed door het ammoniumchloride. Als alternatief kunnen RBC en bloedplaatjes gelijktijdig worden verwijderd door het volgende protocol.

Meng vers volbloed met zuur-citraat-dextrose (...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL tube
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoxin-vrij
Trypan blue 0.5% oplossing	Biological Industries	03-102-1B
IMag Human B lymfocyt verrijkingsset	BD Biosciences	558007
Biotinyleerd CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Streptavidine magnetische microbeads	BD Biosciences	9000810
15 mL Falcon tubes	BD Falcon	352196
Blauwe nylon mesh cell strainer, 40 μm	BD Falcon	352340
Anti-human CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-human CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-human CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-human CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-human CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-human CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	clone LT19
Anti-human CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinyleerd anti-human CD27	Biolegend	302804	clone O323
biotinyleerd anti-human CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomycine D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	type B CpG
Recombinant human IL-2	PeproTech	200-02
Recombinant human IL-10	PeproTech	200-10
Recombinant human IL-21	PeproTech	200-21
Recombinant human sCD40L	PeproTech	310-02
Protein A van S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogeen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filterplaten, 0.45 µm poriegrootte	Merck Millipore	MSIPS4510	steriele, heldere 96-well filterplaat met hydrofobe PVDF-membraan
BCIP/NBT oplossing	Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT enkele reagens, alkalische fosfatase substraat	Merck Millipore	ES006
Human IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
Human IgG, Fc fragment	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragment van geiten anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Geiten anti-human IgG-alkaline fosfatase, Fcγ fragment specifiek	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Geiten anti-human IgM-alkaline fosfatase, Fcµ fragment specifiek	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
Geiten anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specifiek	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Geiten anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specifiek	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substraatkit	BD Biosciences	551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzerg	C.T.L.