Methodenartikel

De Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

DOI:

10.3791/54585

⸱

6 oktober 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster is opgekomen als een krachtig experimenteel systeem voor functionele en mechanistische studies van tumorontwikkeling en -progressie in de context van een heel organisme. Geavanceerde technieken om genetische mozaïeken te genereren, vergemakkelijken de inductie van visueel gemarkeerde, genetisch gedefinieerde klonen, omgeven door normaal weefsel. De klonen kunnen worden geanalyseerd door middel van diverse moleculaire, cellulaire en omics benaderingen. Deze studie beschrijft hoe fluorescent gelabelde clonale tumoren van variërende maligniteit in de oog/antennale imaginaire schijven (EAD) van Drosophila-larven kunnen worden gegenereerd met behulp van de Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) techniek. Het beschrijft procedures om de mozaïek EAD en hersenen uit de larven te herstellen en hoe deze te verwerken voor gelijktijdige beeldvorming van fluorescente transgene reporters en antilichaamkleuring. Om moleculaire karakterisering van het mozaïekweefsel te vergemakkelijken, beschrijven we een protocol voor isolatie van totaal RNA uit de EAD. De dissectieprocedure is geschikt om EAD en hersenen van elk larvestadium te herstellen. Het fixatie- en kleuringsprotocol voor imaginaire schijven werkt met een aantal transgene reporters en antilichamen die Drosophila-eiwitten herkennen. Het protocol voor RNA-isolatie kan worden toegepast op verschillende larvale organen, hele larven en volwassen vliegen. Totaal RNA kan worden gebruikt voor profilering van genexpressieveranderingen met behulp van kandidaat of genoombrede benaderingen. Ten slotte beschrijven we een methode voor het kwantificeren van de invasiviteit van de clonale tumoren. Hoewel deze methode beperkt van toepassing is, is het onderliggende concept breed toepasbaar op andere kwantitatieve studies waarbij cognitieve bias moet worden vermeden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanker is een van de meest genetisch heterogene groep van ziekten, waarvan de incidentie en sterfte neemt drastisch toe, vooral onder ouderen wereldwijd. Cancer afkomstig klonaal uit een tumor-initiërende cel die inherent tumor suppressor mechanismen ontsnapt en verdeelt uit de hand. De geleidelijke toename van de genetische laesies die gezamenlijk het stimuleren van groei, proliferatie en de beweeglijkheid, terwijl het remmen van de dood en differentiatie transformeert de eerste goedaardige begroeiing in een zeer kwaadaardige, metastatische en dodelijke tumor. Gebleken is dat naast genetische veranderingen, tumorprogressie veranderingen nodig in de omliggende stroma en overspraak tussen tumortypes en verschillende celtypes (bijvoorbeeld fibroblasten, immuun- en endotheelcellen) in de micro-omgeving. Het begrijpen van de moleculaire principes die ten grondslag liggen kwaadaardige transformatie, inclusief de tumor-stroma interacties is van groot belang voor de ontwikkeling van Preventie en vroege screeningsstrategieën, alsmede nieuwe en effectieve behandelingen voor kanker en metastase geneesmiddelresistentie bestrijden.

De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een aantrekkelijk systeem voor kankeronderzoek 1-4 dankzij zijn snelle generatie tijd geworden, opmerkelijke behoud van de signalering knooppunten tussen vliegen en de mens, beperkte genetische redundantie en de rijkdom van geavanceerde genetische tools die manipulatie van bijna elk gen in te vergemakkelijken een tijdelijk en ruimtelijk beperkte wijze. Genetische gedefinieerde tumoren van verschillende maligniteit kan reproduceerbaar worden gemanipuleerd in Drosophila door de invoering gain en verlies-van-functie mutaties in een subset van voorlopercellen in een overigens wildtype weefsel met behulp van de techniek MARCM 5. De MARCM gereedschap combineert FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Erkenning Target) gemedieerde mitotische recombinatie 6 met FLP-out 7 en Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) 8 doelwit genexpressiesystemen 9. Met deze werkwijze expressie van een-UAS gebaseerde transgene, waaronder oncogeen of fluorescerend eiwit cDNA's of geïnverteerde DNA repeats voor dsRNA-geïnduceerde genuitschakeling, wordt beperkt tot een kloon van cellen die een specifieke genetische locus en een Gal4 repressor door recombinatie verloren (Figuur 1A). Klonen plekken gemarkeerd met green fluorescent (GFP) of rood fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, RFP, DsRed, mCherry) kan eenvoudig worden gevolgd tijdens de ontwikkeling, geïsoleerd en geanalyseerd. Belangrijker is dat hun gedrag rechtstreeks vergeleken met de aangrenzende wildtype weefsel. Zo vragen relevant zijn voor de cel autonome als niet-autonome effecten van genetische laesies kunnen gemakkelijk worden bestudeerd. Soortgelijke zoogdieren, alleen klonen waarin meerdere oncogene laesies combined maligne Drosophila worden en herhalen belangrijkste kenmerken van kankercellen van een zoogdier. Ze overproliferate, ontwijken apoptose, induceren ontsteking, onsterfelijk en Invasive uiteindelijk het doden van de gastheer 10-17.

Hier beschrijven we een protocol om genetisch bepaald klonale tumoren in het oog / antennaal en hersenweefsel van Drosophila larven te genereren met behulp van de MARCM techniek. De werkwijze berust op een MARCM tester materieel dat de gist FLP recombinase onder de controle van de enhancer ogenloze (eyFLP) 18,19 uitdrukt. Op deze wijze worden gemerkt GFP klonen gegenereerd in zowel peripodial en cilindrisch epitheel van de EAD en neuro-epitheel van de hersenen tijdens de embryonale en larvale stadia (Figuur 1A, B en referentie 20). Klonen kunnen eenvoudig worden gevolgd tot volwassenheid als EAD zich ontwikkelt tot de volwassen oog, antenne en het hoofd capsule, terwijl de neuroepithelium aanleiding geeft tot neuroblasts dat gedifferentieerde optische kwab neuronen produceren.

Uitgebreide moleculaire, functionele en fenotypische karakterisering van het mozaïek weefsel, we de te vergemakkelijkenschrijver een protocol voor dissectie van de EAD en hersenen van de derde instar larven en een beschrijving te verwerken voor drie verschillende toepassingen: (i) het opsporen van transgene fluorescente reporters en immunokleuring, (ii) kwantificering van tumor invasiviteit en (iii) analyse van genexpressie verandert met een kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) of high-throughput sequentiebepaling mRNA (mRNA-seq) (Figuur 1C).

De immunokleuring protocol kan worden gebruikt om een ​​eiwit van belang te visualiseren met een specifiek antilichaam. Transgene fluorescerende transcriptionele reporters bieden handige en nauwkeurige tijdruimtelijke gegevens over de activiteit van een bepaalde signaleringsroute. Cel-afstammingslijn specifieke reporters, anderzijds, tijdens kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in celpopulaties binnen de mozaïek weefsel en bij tumoren van verschillende genotypes. Kwantificering van invasieve gedrag maakt de vergelijking van tumor maligniteit tussen genotypes. Ten slotte is het protocol beschrijft inzameling en verwerking van mozaïek EAD voor RNA-isolatie is geschikt voor zowel kleine als grote schaal downstream-toepassingen zoals reverse transcriptie gevolgd door qRT-PCR en genoom-brede mRNA-seq, respectievelijk. De kwalitatieve en kwantitatieve gegevens verkregen uit deze testen leveren nieuwe inzichten in het sociale gedrag van klonale tumoren. Bovendien produceren ze een solide basis voor functionele studies over de rol van individuele genen, genetische netwerken en tumor micro-omgeving in verschillende stadia en aspecten van tumorigenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Dit werk maakt gebruik van de eyFLP1; handeling> y +> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, bad-GAL80 MARCM 82B Green tester lijn 11. De oversteek van de MARCM 82B Green tester maagden om mannetjes van stammen zoals w; UAS-a; UAS-RNAi b, c FRT82B mut genotype zal nageslacht waarin mitotische recombinatie zal optreden tussen de rechter armen van de 3 e homologe chromosomen opleveren. Zo zal klonen homozygoot mutant gen c distaal aan de FRT82B plaats binnen de hersenen EAD en neuro-epitheel worden gegenereerd. Deze klonen zullen GFP, transgene en een dsRNA voor gen-b (Figuur 1A) uit te drukken. Diverse eyFLP-MARCM tester lijnen voor recombinatie op de X, 2L, 2R, 3L en 3R zijn vastgesteld en beschikbaar zijn binnen de vlieg gemeenschap.

1. Fly Handling, Kruisen en Staging

  1. Vouw de juiste MARCM tester voorraad bij kamertemperatuur door bevolken meerdere bottles tegelijkertijd. Flip de volwassenen in de frisse flessen om de 2-3 dagen, zodat genoeg maagden kan worden verzameld voor de volgende kruisingen.
    LET OP: Bij het verzamelen van maagden, voorkomen dat er een langdurige blootstelling aan CO 2, omdat dit afbreuk doet vrouwelijke vruchtbaarheid.
  2. Afhankelijk van de omvang van het experiment opgezet vlieg kruisen in flesjes gebruikmaking van ten minste 10 MARCM tester maagden en 4 mannen (bijvoorbeeld voor beeldvorming van fluorescente reporters en immunokleuring) of flessen met tenminste 30 maagden en 10 mannen (bijvoorbeeld voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit).
  3. Raise nakomelingen bij 25 ° C onder een lange dag 16 uur / 8 uur licht-donker cyclus. Flip ouders in nieuwe flesjes / flessen elke 24 uur tot reproduceerbare enscenering van larven te vergemakkelijken en overbevolking te voorkomen.
    LET OP: Vanaf dag 6 na de eileg (AEL), de late derde instar controle larven stop voeden, beginnen dwalen en voer verpopping. In contrast, kan het begin van de larvale-popstadium overgang worden degelegd of non-existent in larven EAD richting hyperplastische of kwaadaardige tumoren klonale.

2. Verzamelen Derde Instar Larven

  1. Voor immunokleuring, laat ongeveer 20 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een tang om voorzichtig plukken larven uit het flesje of blikje en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
    1. Voor RNA isolatie en kwantificering van invasiviteit, laat tenminste 80 late derde instar larven (zwerven aan de wand en die van een vergelijkbare lichaamsgrootte van de voeding). Gebruik een spuit fles PBS spuiten in een fles vlieg met larven totdat het oppervlak is bedekt.
    2. Verzachten de bovenste lagen van voedsel met een spatel en giet het eten mash met larven in een petrischaal. Met behulp van een tang voorzichtig plukken larven en breng ze in een embryo glazen schaaltje gevuld met PBS.
  2. Was larven met PBS until alle overgebleven voedsel wordt verwijderd. Inspecteer de larven onder fluorescerende stereomicroscoop met 8 tot 16x vergroting voor alle "luipaard larven" die willekeurige GFP-positieve plekjes in het larvale lichaam (Figuur 2A, 2B en zie discussiedeel) dragen ontdoen.
    Opmerking: Voor RNA-isolatie, zoals een na laatste wasstap in 70% EtOH gedurende 1 min.
  3. Plaats het schaaltje met geselecteerde larven in PBS op ijs tot dissectie. Proces larven binnen 30 minuten om de negatieve gevolgen van koude en honger te voorkomen.

3. Dissectie van Larven

  1. De EAD ontleden onder een stereomicroscoop Gebruik een pincet om voorzichtig op het midden van de larven tegen de glazen schaal bodem. Met de tweede tang, pak de larvale mond haken en trek ze uit de buurt van het lichaam (figuur 2C).
    LET OP: De trekkracht is vaak voldoende om de optische stengels aansluiten van de EAD pai brekenr naar de hersenen lobben. Als de hersenen of onderdelen aangesloten blijven EAD en hun aanwezigheid niet gewenst voor verdere toepassingen, stuurde de optiek stengels met behulp van de twee paar pincetten. Voor invasieve tumoren (bv ras V12 Scrib 1) wordt de verbinding tussen EAD en de hersenen lobben steeds verduisterd met de tijd door de begroeiing en het migreren van klonale cellen.
    1. Om de EAD / brein complex met een intacte ventrale zenuw kabel (VNC) (Figuur 2D) voor te bereiden, een tang om een larve te snijden in het midden van het lichaam. Gooi de achterste helft.
    2. Houd de voorste helft van het larvale lichaam tussen de uiteinden van een tang, draai de larve binnenstebuiten door de knop in de mond haken met de punt van de tweede tang en het rollen van de cuticula over het met de tang eerste paar.
  2. Met behulp van een tang verwijder zorgvuldig alle vreemde weefsels (bv speekselklieren, vet lichaam, en darm), terwijl de EAD pair ofde EAD / hersenen complex aangesloten op de mond haken. Ontwarren de mond haken van de bovenliggende opperhuid. Bevrijd de VNC door het doorsnijden van de axonale uitsteeksels aan het lichaam spieren en epidermis (figuren 1B, 2C, 2D).
    LET OP: De mond haken zorgen voor een veilige manipulatie van het weefsel met een pincet en efficiënter zinken en gemakkelijke herkenning van het weefsel tijdens het wassen te vergemakkelijken. Ontleed EAD verandering morfologie relatief snel bij bewaring niet vastgelegde in PBS. Beperk de dissectie tijd om 20-30 min.
  3. Om het weefsel over te dragen, jas een P20 micropipet tip door pipetteren de resterende lichaam karkassen een paar keer op en neer. Om de grotere EAD / brain complexen over te dragen, snijd de P20 micropipet tip met een schaar.
    OPMERKING: De bekledingswerkwijze is kritisch om plakken en verlies van ontleed weefsel tijdens overdracht te voorkomen. Gebruik van een micropipet P20 minimaliseert de overdracht PBS in fixeeroplossing, ongewenste beperkende verdunning.
    1. Voor immunokleuring, overdragende EAD ontleed in een 0,5 ml buis gevuld met 400 ui 4% paraformaldehyde (PFA) fixeermiddel. Gebruik 1,5 ml buis met 1 ml PFA voor groter EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve.
      LET OP: PFA is zeer giftig. Draag beschermende handschoenen en kleding. contact met de huid, ogen of slijmvliezen.
    2. Voor RNA-isolatie overdragen ontleed EAD in een nieuwe glazen schaal gevuld met koude PBS. Gebruik een tang om schoon te maken EAD uit de ring en de lymfeklieren, om te proeven verontreinigingen te minimaliseren.
    3. Maak de EAD uit de mond haken door het doorsnijden van de verbinding tussen de antenne-schijven en de mond haken behulp van een tang (figuur 2E). RNA degradatie en genexpressie artefacten te voorkomen, beperken de dissectie tijd 30 min. Ga verder met stap 7.
      LET OP: Een ervaren onderzoeker kan ongeveer 60 larven ontleden in 30 min met uitzondering van de tijd die nodig is voor larven verzamelen en wassen. Totaal RNA opbrengsten zijn afhankelijk van de EAD grootte die variëren tussen genotypen en developmentÃl fasen. Dissectie van 80-100 controle EAD pairs uit de late derde instar larven moeten 5-8 ug totaal RNA opleveren.

4. Fixing, Immunokleuring en Montage

  1. Fix monsters PFA fixatief 25 minuten onder Tuimelschijfmeter bij kamertemperatuur. De fixatietijd kan worden verlengd tot 60 minuten zonder dat weefselmorfologie en de antigeniciteit van eiwitten.
  2. Verwijder het fixeermiddel en spoelmonsters met PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) drie keer gedurende 10 minuten met een nutator. Gebruik voldoende volume PBST voor elke wasstap (400 ul / 0,5 ml buisje).
    OPMERKING: Vaste EAD / brain complexen bedoeld voor het scoren van invasieve niet immunokleuring niet nodig. GFP signaal blijft goed zichtbaar na fixatie. Ga verder met stap 4.4 voor de finale dissectie.
    1. Voor immunokleuring, blok weefsel in 200 ui van een blokkeeroplossing (PBST met 0,3% BSA) gedurende 20 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
      1. Incubate met primary antilichamen verdund in 100 ul van een blokkerende oplossing overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. Raadpleeg primair antilichaam datasheet of gepubliceerde literatuur voor de aanbevolen antilichaam verdunning.
        LET OP: De primaire antilichaam verdunning zou moeten worden geoptimaliseerd.
      2. Na vijf 10 minuten wassen in PBST, vlek weefsel met fluorescerende secundaire antilichamen verdund in blokkeeroplossing onder zacht schudden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in het donker.
      3. Spoelmonsters driemaal 10 min in PBST.
  3. Vervang PBST met 500 ui DAPI-kleuroplossing. F-actine label, voeg phalloidin geconjugeerd aan een fluorescente kleurstof DAPI-kleuroplossing. Na 15 min nutatie in het donker, weefsel eenmaal wassen gedurende 10 minuten met PBST.
    LET OP: F-actine labeling kan onafhankelijk van DAPI kleuring worden uitgevoerd.
  4. Voor de laatste stap dissectie, transfer weefsel terug in een PBS-gevulde glazen schaal met een 1 ml piPette. Met behulp van de twee paar tang clip uit de mond haken.
    1. Scheid de hersenen die worden gebruikt voor het kwantificeren van invasiviteit van de EAD door het snijden van de optische stengel zo overwoekerd EAD kan de analyse belemmeren.
  5. Een druppel van de montage medium (15 gl van een 22 mm x 22 mm dekglaasje) op een objectieve dia. Met behulp van forceps tips, verdelen het medium in een dunne laag. Transfer EAD, hersenen of de EAD / brein complexen in de montage medium met een P20 micropipet.
  6. Gebruik de tang tips of een wolframstaaf om weefsel te verspreiden en strek de VNC op de dia.
  7. Om de vorming van bellen tijdens het monteren, eerste aanraking een rand van een dekglaasje aan het fixeermiddel en vervolgens langzaam op het fixeermiddel met behulp van forceps voorkomen. Gebruik kleine stukjes filtreerpapier of tissue veeg om overtollige fixeermiddel absorberen rond dekglaasje randen.
    LET OP: DABCO / Poly (vinyl alcohol) 4-88 montage medium verhardtbij 4 ° C binnen een uur. Dia's kunnen worden bewaard maanden bij 4 ° C.

5. Confocale Imaging

  1. Verwerven enkele confocale secties en stapels met behulp van een confocale microscoop met 20X, 40X en 60X olie doelstellingen.
  2. Voorkom pixel verzadiging. Gebruik hetzelfde beeld acquisitie parameters zoals beeldresolutie, laser input power, gain, offset, kader middeling, een stap grootte in een z-serie en deze instellingen voor alle genotypes te voeren, zodat voor vergelijkingen van pixel intensiteiten tussen verschillende genotypen 21,22.
    LET OP: Voor de visualisatie van EAD / hersenen complex, het genereren van maximale projecties en steek respectieve, naburige beelden. Voor de uiteindelijke beeld voorbereiding, gebruiken na de beeldverwerking software voor paneel montage en om de helderheid en het contrast aan te passen.

6. Kwantificering van Tumor Invasiviteit

  1. Definieer een scoresysteem dat de verschillende tumor invasivenes zal kenmerkendis gezien het ruimtelijk patroon van invasie en het aantal GFP-positieve cellen zich naar de hersenen en VNC. Bereid evaluatie platen voor documentatie (figuur 3A).
  2. Mount tenminste 80 vaste intacte hersenen voor elk genotype op een dia via 40 gl van het fixeermiddel per 24 mm x 50 mm dekglaasje.
    1. Om onpartijdige scoring mogelijk te maken, vraag dan een neutrale partij bij de dia's anonimiseren, zodat de scoring procedure is onpartijdige. Evalueer geanonimiseerde dia's door twee lab leden onafhankelijk van elkaar. Openbaren genotypes pas na de telling is voltooid.
  3. Evalueer de mate van maligniteit door een blinde scoring van gemonteerde hersenen onder een tl-stereomicroscoop uitgerust met een GFP filter set. Gebruik een marker om de hersenen die al zijn bekeken om dubbeltellingen (Figuur 3B) te vermijden labelen.
  4. Bereken het percentage van de hersenen die in elk van de gedefinieerde invasieve categorieën per genotype. Bepaal de statistische significance met behulp van een chi-kwadraattoets (figuur 3C).

7. RNA isolatie, DNase behandeling en Kwaliteitscontrole

Opmerking: Alle reagentia (oplossingen, plasticware) van de volgende stappen moeten vrij van RNase activiteit. Draag altijd handschoenen en gebruik maken van een chemische kap voor het werken met organische oplosmiddelen.

  1. Breng de schone EAD met een gecoate P20 micropipet tip in 1,5 ml buis.
  2. Laat weefsel zinken naar de bodem van de buis, verwijder PBS en vervangen door 100 ul RNA lysisreagens (voldoende voor 140 EAD).
  3. Lyse weefsel door vortexen. Op dit punt kunnen de monsters bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C of direct verwerkt met het standaard RNA-isolatie-protocol.
    LET OP: Monsters van gelijke genotypen uit meerdere dissectie rondes kan één keer worden samengevoegd in RNA-lysis reagens.
  4. Vul het monstervolume tot 0,9 ml met RNA lysis reagens. Voeg 0,2 ml chloroform en meng monsters vigorously gedurende 15-20 sec.
  5. Na 2-3 minuten incubatie bij kamertemperatuur gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  6. Transfer kleurloze bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis zonder interfase verstoren. Blijf weg van de tussenfase als het proteïnen en genoom DNA bevat.
    Opmerking: Het teruggewonnen volume moet ongeveer 60% van het volume van RNA lysis reagens gebruikt voor homogenisatie zijn.
  7. Precipiteren het RNA door toevoeging van 0,5 ml isopropylalcohol. Vortex en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  8. Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  9. Verwijder het supernatant en was de RNA pellet eenmaal met 600 ui 75% ethanol. Na een korte vortex en centrifugatie (10.000 x g gedurende 7 minuten bij 4 ° C) leggen alle ethanol en laat de RNA pellet drogen gedurende 5-10 min plaatsen van de open buis op een schone tissue afvegen.
    LET OP: Het RNA pellet kan zichtbaar als een klein ondoorzichtig / wit st zijnrijp op de bodem van de buis of onzichtbaar. De resterende ethanol druppels kunnen voorzichtig worden verwijderd met P10 micropipet tip.
  10. Ontbinden RNA in 50 ul van DEPC-behandeld water door vortexen of het doorgeven oplossing een paar keer door middel van een pipet tip.
  11. Om contaminatie met genomisch DNA minimaliseren, behandel totaal RNA met DNase door toevoeging van 50 pl van een mengsel dat 1 ul DNase (2 U / pl) en 10 pl 10X DNase buffer in DEPC-behandeld water. Vortex en spin down.
  12. Incubeer monsters bij 37 ° C in een waterbad of verwarmingsblok gedurende 30 tot 40 minuten. Na incubatie, voeg 100 pl DEPC-behandeld water in elk monster.
  13. De enzymatische activiteit en schone RNA inactiveren van DNase, voeg 200 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) oplossing, vortex gedurende 1 min en gecentrifugeerd monsters bij 10.000 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
  14. Breng voorzichtig de bovenste waterige fase die RNA in een nieuwe buis. Voeg gelijk volume (200 pl)chloroform, mix en herhaal het centrifugeren stap van boven.
  15. Verzamel zorgvuldig de bovenste fase en RNA te precipiteren door toevoeging van 1/10 volume 3 M natriumacetaat, pH 5,2 bereid in DEPC H2O en 2,5 volumina 100% ethanol. Meng goed door vortexen.
    Opmerking: Het toevoegen 0,5 ui glycogeen (20 ug / ul) een precipitatie mengsel helpt om de RNA pellet visualiseren. RNA te minimaliseren, gebruiken gesiliconiseerd, low-bindende 1,5 ml microcentrifugebuizen.
  16. Precipiteren RNA bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    LET OP: De incubatie kan worden uitgevoerd 's nachts uitgevoerd. Monsters bij -80 ° C geplaatst ook.
  17. Pellet RNA door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Was en droog pellet volgens de beschrijving in 7.9.
  18. Ontbinden RNA in 10-15 pi DEPC-behandeld water. RNA opslag bij -80 ° C.
  19. Bepaal hoeveelheid en zuiverheid van RNA door het meten van OD bij 230 nm, 260 nm en 280 nm met een spectrofotometer. Bereken RNA concentration door toepassing van de conventie die 1 OD bij 260 nm gelijk aan 40 ug / ml RNA.
    OPMERKING: De A 260/280-verhouding van "zuivere" RNA gelijk aan 2,0, terwijl A 260/230-verhouding dient in het traject van 2,0-2,2. RNA-monsters met een A 260/280 verhouding tussen 1,7 en 2,0 zijn geschikt voor verdere toepassingen zoals cDNA-synthese. Voor de bereiding van mRNA-bibliotheken seq de kwaliteit en kwantiteit van RNA gecontroleerd worden door middel van een geautomatiseerd elektroforesesysteem. De 28S / 18S verhouding moet hoger zijn dan 1,8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het potentieel van de eyFLP-MARCM techniek om GFP gemerkt stukken gedefinieerde genotypen in Drosophila EAD genereren demonstreren, werden drie klonen geïnduceerd: (1) controle expressie alleen GFP, (2) maligne tumoren tot expressie een oncogene vorm van de kleine G-proteïne Ras (Ras V12) in een achtergrond van homozygote verlies van een tumorsuppressorgen scribble (Scrib 1) en (3) begroeiing maar niet-invasieve ras V12 S...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De technieken voor het genereren van genetische mozaïeken in Drosophila behoren tot de meest verfijnde hulpmiddelen voor het analyseren en manipuleren genfunctie 33. De eyFLP-MARCM systeem heeft bewezen krachtig en robuust als het laat de inductie van visueel gemarkeerd, genetisch bepaald klonen in een ruimtelijk beperkte wijze, dat wil zeggen, in de weefsels waar de eyeless enhancer actief is 9,18. Dit is vooral belangrijk wanneer meerdere genetische laesies worden gecom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Brückner en Istvan Ando voor vliegensoorten en antilichamen. We danken Marek Jindra en Colin Donohoe voor hun opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Sofja Kovalevskaja Award aan M.U. van de Alexander von Humboldt Foundation en DFG project UH243/1-1 aan M.U. van de German Research Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarGewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany00262-0500Fly food recept: Bereid 20 L vliegvoer met 160 g agar, 360 g gist, 200 g sojameel, 1,6 kg gele maïsmeel, 1,2 L moutextract, 300 ml maïsstroop, 130 ml propionzuur en 200 ml 15% nipagin. Vliegvoer moet gedurende 1 uur worden gekookt op 85 °C.
Corn syrupGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany01939
Propionic acidCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6026.1
CornmealReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany4010155063948
Malt extractCSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany728985
Soy flourStockmeier Food GmbH, Herford, Germany1000246441010
YeastWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany210099K
Methyl-4-benzoate/ NipaginSigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyH5501Maak een 15% stamoplossing met 70% EtOH
Drosophila fly food vialsKisker Biotech, Steinfurt, Germany789008
Vial plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002
Drosophila fly food bottlesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany960177
Bottle plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany81381Montagemedium recept: Los 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 op in 39 ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) en 12,5 ml glycerol. Roer een nacht bij 50 °C en centrifugeer 20 min bij 5.000 rpm. Voeg DABCO toe aan het supernatant om een uiteindelijke concentratie van 2,5% te verkrijgen. Bewaar aliquots bij -20 °C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany9002-93-1
Phosphate-buffered saline/ PBS137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 in Millipore H2O
PBST0,1% Triton X-100 in PBS
Paraformaldehyde/ PFASigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany1581274% PFA fixeermiddelrecept: Los 4 g PFA op in 80 ml Millipore H2O op een magnetische roerplaat verwarmd tot 55 °C. Voeg druppelsgewijs 1 M NaOH toe totdat alle PFA-deeltjes zijn opgelost. Voeg 10 ml 10x PBS toe en pas de pH aan tot 7,4 met 1 M HCl. Meng 100 µl Triton X-100 en vul aan met Millipore H2O tot 100 ml. Bewaar aliquots bij -20 °C. Vermijd herhaald ontdooien. (VOORZICHTIG: PFA is zeer giftig. Bereid het PFA-fixeermiddel in een afzuigpunt voor. Draag een zelfstandige ademhalingstoestel, handschoenen en kleding. Vermijd contact met huid, ogen of slijmvliezen.)
Bovine Serum Albumin/ BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyA3059Blokkaroplossing recept: Los 0,3% BSA op in PBST
Fluorescently labeled phalloidinInvitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular ProbesA12379, A22283, A22284Phalloidin stamoplossing: Los poeder (300 U) op in 1,5 ml Methanol. Bewaar bij -20 °C. Gebruik voor kleuring in verdunning 1:250 (A12379, A22283) en 1:100 (A22284) in PBST.
4’,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPICarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6335DAPI-kleuringsoplossing: Bereid een stamoplossing van 5 mg/ml in Millipore H2O en bewaar aliquots bij 4 °C. Gebruikt in verdunning 1:1.000 in PBST.
Mouse anti-H2 antibodyKurucz et al., 2003Gebruikt in verdunning 1:500 in blokkaroplossing
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK715-175-151Gebruikt in verdunning 1:500 in blokkaroplossing
Dumont #5 forcepsFine Science Tools, Heidelberg, Germany11295-10
Glass embryo dish (30 mm)Thermo Scientific, Schwerte, GermanyE90
Tungsten needlesFine Science Tools, Heidelberg, Germany10130-20
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools, Heidelberg, Germany26018-17
Microscope slidesVWR, Darmstadt, Germany631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)VWR, Darmstadt, Germany631-1336
Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16 mm)Thermo Scientific, Schwerte, Germany1076371
Kimtech Science Precision WipesThermo Scientific, Schwerte, Germany06-677-70
Dissecting stereomicroscopeOlympus, Hamburg, GermanySZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
Fluorescent stereomicroscopeOlympus, Hamburg, GermanySZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) met

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila Imaginal DiscGenetic MosaicsMARCM TechniqueFluorescent MicroscopyConfocal ImagingRNA IsolationTumor InvasivenessJNK SignalingHemocyte InfiltrationMMP1 Expression

Gerelateerde artikelen