Methodenartikel

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54586

⸱

17 september 2016

 , 
1Institute for Molecular Plant Sciences, University of Edinburgh

In dit artikel

Samenvatting

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Samenvatting

De circadiane klok van planten maakt het mogelijk om dagelijkse veranderingen in de omgeving te anticiperen. Deze anticipatie helpt bij de reacties op tijdelijk voorspelbare biotische en abiotische stress. Omgekeerd leidt verstoring van circadiane tijdmeting ernstig tot een aantasting van de gezondheid van planten en vermindert de opbrengsten van landbouwgewassen. Het is daarom van cruciaal belang dat we de complexe regulatie van circadiane ritmen bij planten begrijpen, inclusief de factoren die van invloed zijn op de beweging van de transcriptionele klok zelf.

Het testen van circadiane defecten in de modelplant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) omvat traditioneel het kruisen van specifieke mutante lijnen met een lijn die ritmisch vuurvlieg-luciferase uitdrukt vanuit een promotor van een circadiane klokgen. Deze aanpak is arbeidsintensief, tijdrovend en kan vruchteloos zijn als een mutant geen circadiane fenotype heeft. De hier gepresenteerde methodologie maakt een snelle initiële beoordeling van circadiane fenotypes mogelijk. Protoplasten afgeleid van mutante en wild-type Arabidopsis worden geïsoleerd, getransfecteerd met een ritmisch uitgedrukte luminescente reporter en gedurende 5 dagen onder constante lichtcondities geïmaged. De luminescente sporen zullen direct laten zien of de vrijlopende periode van mutante planten anders is dan die van wild-type planten. Het voordeel van de methode is dat elke Arabidopsis-lijn efficiënt kan worden gescreend, zonder de noodzaak om een stabiel transgeen luminescente klok-markerlijn in die mutante achtergrond te genereren.

Inleiding

De meeste levende organismen hebben een endogene tijdwaarnemer efficiënte onderhandelingen over de dagelijkse veranderingen in de omgeving te helpen. Dit tijdwaarnemer, de circadiane klok, reguleert vele aspecten van het metabolisme en fysiologie van een organisme voorspelbare veranderingen in de externe omgeving te anticiperen. In planten bijvoorbeeld, vooruitlopend op tijdelijk voorspelbare pathogeen of herbivoor aanvallen vermindert sterk de algehele gevoeligheid 1-4. Zetmeel metabolisme wordt strak gereguleerd door de circadiane klok van vorig ervoor te zorgen dat zetmeel reserves tot het ochtendgloren of geteeld op lange of korte dag omstandigheden 5. Inderdaad, planten met circadiane klok die overeenkomen met de 24 hr milieu tonen verhoogde groeipercentages, koolstofbevestiging tarieven en overleving in vergelijking met planten runnen van een klok van mismatched periode van 6. De uitgebreide invloed van circadiane ritmes in al deze processen ontstaat grotendeels uit de ritmische regeling tot een derdevan de totale transcriptoom in Arabidopsis 7. Deze ritmische genproducten zijn betrokken bij een breed scala aan cellulaire processen waaronder metabole pathways, hormoon signalering en stressreacties 7. Op de top van dat, is de directe circadiane regulatie van eiwitfunctie vastgesteld bij circadiane regulatie van fosforylering 8 en waarschijnlijk andere post-translationele modificaties (PTMs).

In het centrum van de circadiane klok die deze dagelijkse transcriptie herprogrammering drijft ligt een netwerk van transcriptionele / translationele feedback loops (TTFLs), met inbegrip van de ochtend uitgedrukte genen circadiane klok ASSOCIATED 1 (CCA1) en LATE VERLENGDE hypocotyl (LHY), die de expressie onderdrukken van de avond genen TIMING vAN CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) en de leden van de avond complex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), vroegbloeiende 3 (ELF3) en ELF4 9-11. samen with de pseudo REACTIE REGELAAR-genen (PRR3, 5, 7 en 9), TOC1 onderdrukt CCA1 / LHY expressie, terwijl de EG fungeert als een positieve regulator 12-14. Extra naar terugkoppelingsmechanismen, post-transcriptionele en post-translationele regulering van de TTFL netwerkcomponenten speelt een belangrijke rol bij het afstemmen circadiane ritmes. Tot op heden de meest voorkomende PTM geïdentificeerd op circadiane klok eiwitten fosforylatie 15. De fosforylatie van CCA1 door Caseïne kinase 2 (CK2) beïnvloedt de binding aan promoters 16 gericht en is belangrijk voor temperatuurcompensatie van de circadiane klok 17. De PRR eiwitten worden gefosforyleerd differentieel over de circadiane cyclus, en fosforylering van TOC1 invloed op de interactie met zijn negatieve regulator, de avond gefaseerde klok component Zeitlupe (ZTL) 18. Deze voorbeelden illustreren hoe PTMs en eiwit-eiwit interacties tunen van de TTFL netwerk in een 24-uurstranscriptionele oscillator. Voor een nadere kennismaking met de transcriptie klok netwerk en de regulering, uitstekende recente beoordelingen beschikbaar zijn (bv referentie 15).

Wat echter nog minder duidelijk is welke mate ritmisch gereguleerde processen en andere aspecten van cellulair metabolisme feedback voor de tijdwaarneming mechanisme zelf. Uitgebreide screening van Arabidopsis mutanten klok defecten kan verder begrip van welke mechanismen of signaal transductie in de generatie van 24 uur ritmes kunnen worden betrokken uit een TTFL netwerk. Daartoe Kim en Somers eerder gepubliceerde een doorbraak werkwijze voor de efficiënte en snelle analyse van klokfunctie enkele Arabidopsis lijn 19. Gebaseerd op het gebruik van tijdelijke expressie in protoplasten, overtreft deze methode de behoefte aan stabiele transgene lijnen of kruist luminescerende klok marker lijnen. Hier, visualiseren we een hoge opbrengst protoplast isolation methode 20 in combinatie met een geoptimaliseerd protocol circadiane gebreken door luminescerende beeldvorming van transiënt tot expressie klok markers screenen in een 96-well plaatlezer.

We zullen vergelijken wild-type Samen- 0 Arabidopsis om goed gekarakteriseerd klok mutanten aan de hier beschreven met succes detecteert veranderde circadiaanse ritmes methodologie te bevestigen. Protoplasten afgeleid van deze lijnen worden getransfecteerd met een reporter construct dat vuurvliegluciferase van de circadiane CCA1 promotor uitdrukt; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyseert de meerstaps reactie waarbij luciferine wordt omgezet in elektronische geëxciteerde oxyluciferin dat licht uitzendt 21, die is afgebeeld in de tijd om de periode, amplitude en fase van transcriptionele ritmes in deze protoplasten beoordelen.

Het protocol bestaat uit drie grote delen; isoleren van de protoplasten, transfecteren van de protoplasten met het reporterplasmide, en luminescerend imveroudering. Deze drie onderdelen moeten altijd worden uitgevoerd op een enkele dag, met vers bereide buffers en reagentia. Plantengroei en zuivering van voldoende hoeveelheden reporterplasmide moet worden uitgevoerd op voorhand en zijn niet zichtbaar in dit protocol.

Protocol

LET OP: In dit protocol worden reagentia en volumes beschreven uitgedrukt per Arabidopsis lijn die wordt getest, en zal resulteren in zes repliceren putten voor die genotype. Vermenigvuldig het materiaal met het aantal regels te analyseren bij het analyseren van meerdere regels. In de video, zal wildtype Arabidopsis worden vergeleken met de circadiane klok mutantlijn ZTL (hoewel representatieve resultaten van andere lijnen later worden verstrekt).

enzymoplossing
cellulase 0,5% (w / v)
pectinase R10 0,25% (w / v)
D-mannitol 400 mM
CaCl2 10 mM
KCl 20 mM
Runderserumalbumine 0,1% (w / v)
MES, pH 5,7 20 mM
W5-oplossing
NaCl 150 mM
CaCl2 125 mM
KCl 5 mM
MES, pH 5,7 2 mM
Glucose 5 mM
MMG oplossing
MES, pH 5,7 4 mM
D-mannitol 400 mM
MgCl2 15 mM
PEG-oplossing
PEG4000 40% (w / v)
D-mannitol 200 mM
CaCl2 100 mM
Imaging oplossing
W5-oplossing eindvolume
Foetaal runderserum 5% (v / v)
luciferine 1,2 mM
ampicilline 50 mg / ml

Tabel 1: Lijst van oplossingen.

1. Voorbereiding van Materialen en Buffers

  1. Plant Materialen
    1. Houd Arabidopsis Col -0 zaden in water in een 1,5 ml buis bij 4 ° C in het donker gedurende vier dagen. Pipetteer de zaden op aarde in een pot overgebracht, staan ​​omstandigheden (16 uur licht 8 uur donker) bij 21 ° C gedurende 7 dagen. Laat een deksel op de pot voor de eerste drie dagen hoge vochtigheidsgraad waarborgen. Transplant zes zaailingen in nieuw 8 cm x 13 cm x 5 cm pot en verder groeien van de planten onder dezelfde voorwaarden another 21 dagen. Zorg ervoor dat de bodem is vochtig overal.
  2. Reporter Plasmid
    1. Zuiver het CCA1pro: LUC reporterplasmide 19 van bacteriekweek vooraf, met behulp van een DNA isolatie kit volgens instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: 20 ug reporterplasmide vereist (10 gl bij 2 ug / ul in dH 2 O) voor transfectie.
  3. Oplossingen
    OPMERKING: Hiervoor protocol vijf oplossingen nodig: enzymoplossing, Wash oplossing 5 (W5) oplossing, Mannitol-Magnesium (MMG), polyethyleenglycol (PEG) oplossing en imaging oplossing (Tabel 1). Bereid deze voordat u doorgaat naar de protoplastisolatie stap.
    1. Bereid 10 ml enzymoplossing volgens Tabel 1, het toevoegen van de enzymen laatste en filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter.
    2. Bereid de resterende oplossingen in de volgende volumes: 15 ml W5-oplossing, 10 ml MMG sPLOSSING, 1 ml PEG-oplossing en 1,5 ml weergaveoplossing volgens tabel 1.
      Opmerking: Het is belangrijk dat de PEG-oplossing niet minder bereid dan een uur voor de transfectie zodat de PEG volledig is opgelost. Filter steriliseren de imaging oplossing door een 0,22 pm spuitfilter.

figure-protocol-1

Figuur 1:. Protoplastisolatie De bladeren van volwassen Arabidopsis planten (A) zijn bevestigd op autoclaventape met de lagere epidermale lagen naar boven (B). (C) Magic tape voorzichtig op de onderste epidermale laag met de punt van een 15 ml conische buis gedrukt. (D) De magic tape wordt verwijderd om de mesofylcellen (E) bloot. (F) Stroken autoclaaf tape met verlofs bevestigd worden geïntroduceerd op enzymoplossing die cellulase en pectinase, vrijgeven protoplasten in de oplossing. (G) De bladskeletten blijven autoclaventape na enzymdigestie worden verwijderd, waardoor de protoplasten enzymoplossing (H). (I) Final resulteert bladmoes protoplasten (Schaal bar = 50 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. protoplastisola-

  1. Label een petrischaaltje en voeg 10 ml-filter gesteriliseerd Enzyme oplossing.
  2. Fix vier stroken autoclaventape met de klevende zijde naar boven op een schone laboratorium oppervlak en merk van de grootte van de petrischaal op de stroken.
  3. Snijd de bladeren van 4 weken oude planten (figuur 1a), en druk op de bovenste epidermis op de autoclaaf tape (dwz de ondergrens huidoppervlak naar boven ( Figuur 1b)).
  4. Druk voorzichtig op strips van magie tape op het onderste epidermale oppervlak met behulp van een 15 ml conische buis. Zorg ervoor dat u het blad weefsel (figuur 1c) verpletteren. Trek de magie tape af naar de onderste epidermis strip (figuur 1d) en bloot de bladmoes cellen (Figuur 1e).
  5. Snijd de autoclaaf tape om de petrischaal te passen, gebruik een pincet om de band te verplaatsen naar de petrischaal en drijven op het enzym-oplossing (figuur 1f), laat naar beneden. Draaien met 60 rpm op een platform schudmachine gedurende 60 minuten, waarbij de protoplasten wordt vrijgemaakt in de oplossing.
  6. Met een pincet aan de oplossing bevattende de protoplasten (figuur 1H) in een 50 ml conische buis Verwijder de stroken autoclaventape (figuur 1G) en pipet. Gebruik een breed-boring pipetpunt (zoals een P5000 tip of een P1000 tip met het einde afgesneden).
  7. Centrifugeer de protoplasten bij 100 xg gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los.
  8. Voeg 10 ml W5 oplossing voor de protoplasten en resuspendeer onder voorzichtig schudden de buis.
  9. Rest de protoplasten op ijs gedurende 30-60 min. Tijdens deze stap beoordeelt opbrengst van protoplasten te tellen in een hemocytometer (Figuur 1i).
  10. Verzamel de protoplasten door centrifugatie bij 100 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Wees voorzichtig, omdat de pellet is erg los.
  11. Resuspendeer de protoplasten tot een concentratie van 5 x 10 5 protoplasten / ml in MMG oplossing.

3. Protoplast Transfectie

  1. Voeg 10 ul reporterplasmide (2 ug / ul) in een 15 ml conische buis.
  2. Voeg 400 ul protoplasten aan de buis.
  3. Voeg een volume (410 pl) PEG-oplossing en meng door het buisje voorzichtig 12 keer tot de protoplasten transfecteren.
  4. Na 8-15 min incubation bij kamertemperatuur, de protoplast-DNA-PEG mengsel met vier volumina (1640 ui) W5-oplossing en meng door voorzichtig zes keer.
  5. Verzamel de getransfecteerde protoplasten door centrifugatie bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Nogmaals, zorg, zoals de pellet is erg los.
  6. Resuspendeer de protoplasten in 1250 pl weergaveoplossing.
  7. Aliquot 200 ul in zes repliceren putjes van een 96-well plaat, vul alle lege putten met W5-oplossing, en sluit de plaat met een kleefmiddel duidelijke deksel geschikt voor lichtgevende beeldvorming.

4. Imaging

  1. Breng de plaat aan een lichtgevende beeldvorming setup geschikt voor installatie beeldvorming. Verander het kleefmiddel deksels op de platen 10-15 min na overdracht naar condensatie en drukverschillen tussen de putjes te voorkomen, start beeldvorming. Lees de plaat elk ~ 45 min (3 sec per putje) gedurende vijf dagen bij kamertemperatuur.
    Merk opfrequentie van de plaat leest en de leestijd per goed zou kunnen variëren afhankelijk van de beeldvorming setup.

5. Data Analysis

  1. Analyseer de luminescentie resultaten met behulp van een analysesoftware (bijvoorbeeld biologische ritmes Analysis Software System (messing) 22). Vergelijk de mutant lijn naar wild-type controles om circadiane gebreken onthullen.

Resultaten

Protoplasten van wild-type Arabidopsis werden vergeleken met de bekende klok mutanten cca1 / Lhy (korte periode mutant 2), ZTL (lange periode mutant 23), en de overexpressie lijn CCA1 -Ox (aritmische 24). Allen werden tijdelijk met de CCA1pro: LUC reporter en afgebeeld in constant licht op een bord lezer over 5 dagen.

Hier laten we zien dat in de cca1 / Lhy mutant, de free-running periode van circadiane-gecontroleerde genexpressie wordt verkort (figuur 2a), in lijn met de gepubliceerde periode van stabiele transgene expressie van lichtgevende klok markers 2,9 geanalyseerd. De periode van circadiane oscillaties in protoplasten van de ZTL mutant langer dan in wildtype (figuur 2b), in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten van zaailingen, celsuspensie cultures en protoplasten 19,23,25.

Overexpressie van CCA1 sloten de klok in de ochtend-fase en mondiale transcriptie wordt aritmische 24. Consequent, zagen we geen oscillaties in CCA1pro: LUC expressie in CCA1 -Ox protoplasten (figuur 2c).

figure-results-1
Figuur 2: Protoplast circadiaanse ritmes Protoplasten van Samen- 0, cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werden tijdelijk getransformeerd met de CCA1pro: LUC construct en circadiane ritmen bij luminescentie werden afgebeeld over 5 dagen (A - C). (D) circadiane periode schattingen op basis van luminescentie sporen in Col -0, cca1 / Lhy en ZTL (A - B). Meeen ± SEM, n = 3-5, t-test p-waarde zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genotype Periode (protoplasten) Periode (transgene) Aangegeven door: Referenties
collega 0 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC in Col -0 (2)
cca1 / Lhy 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC in Col -0 (2)
~ 18 RNA in L ER achtergrond (9)
ZTL 25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC in C24 ecotype (22)
CCA1 -Ox aritmische aritmische pCCA1: LUC (LD alleen gegevens) (2)
aritmische RNA en eiwit in Col -0 achtergrond (23)

Tabel 2: circadiane ritmes in protoplasten vergelijking met Transgene Zaailingen de circadiane periode pCCA1. LUC expressie in protoplasten opzichte van de periodelengten eerst gemeld voor de mutatie en, indien beschikbaar, met pCCA1: LUC expressie in Col -0.

Discussie

Hier presenteren we een snelle bepaling om circadiane periode gebreken in Arabidopsis-lijnen, zoals protoplastisolatie, transfectie en luminecent afbeeldscherm. De circadiane periode in de wild-type Arabidopsis en de klok mutanten cca1 / Lhy, ZTL en CCA1 -Ox werd berekend uit metingen van luminescentie uit een CCA1pro: LUC reporter en vond in overeenstemming met gepubliceerde gegevens gegenereerd op basis van hele planten met behulp van meer tijd- te zijn consumeren transgene benaderingen (tabel 2). Met behulp van deze test om Arabidopsis mutanten screenen vermijdt de eerste vereiste om transgene lijnen luminescerende genereren, wat tijdrovend en kan alleen bekend dat er een bepaalde mutant vertoont wildtype ritmes. Een duidelijk voordeel van dit protocol is dat elke Arabidopsis lijn kan worden gescreend in korte tijd veranderde circadiane transcriptie ritmes, die de identificatie van meer genen die van invloed tijdwaarneming in planten zal helpen.

Isolatie van protoplasten kan omslachtig zijn, vooral als de mutant regel geeft een verkleinde fenotype. Eerder gemeld methoden voor het genereren van protoplasten betrekken snijden bladeren of zaailingen in dunne reepjes en vacuüm infiltreren in de strips met enzymoplossing zodat de enzymen om de celwanden 26,27 bereiken. De daaropvolgende digestie vereist ten minste 3 uur incubatie in het donker naar de protoplasten introductie in de enzymoplossing. Wanneer vacuüm infiltratie niet wordt toegepast, wordt incubatietijd tot 18 uur geadviseerd. In de hier gepresenteerde protocol, vacuüm infiltratie niet nodig omdat de epidermale cellaag ondoordringbaar voor de enzymen wordt verwijderd door de tape. Bij het genereren van protoplasten door snijden plantaardig materiaal moet worden gescheiden van protoplasten celwand puin na digestie; Dit wordt meestal gedaan door het filteren van de oplossing of het zuiveren van het op een helling suiker 27,26. Hier vindt elke onverteerd weefsel op de autoclaaf tape na blijvenspijsvertering, zodat filtratie en suiker gradiënt zuivering van de protoplasten kan worden weggelaten. Er is een kans dat de stress als gevolg van langdurige protoplasting procedures beïnvloedt levensvatbaarheid van de cellen en de circadiane klok. De tape-gebaseerde protoplasting methode 20 hier gevisualiseerd levert een groot aantal protoplasten; en gezien de levensvatbaarheid van cellen over een circadiane tijdreeks en de bijbehorende periodelengten protoplasten en gehele zaailingen (tabel 2), is de hier beschreven werkwijze de voorkeur boven andere methoden om protoplasten te genereren.

De transfectie stap van het protocol is een cruciale stap dat de gevolgen voor de levensvatbaarheid van de protoplasten. De PEG-oplossing maakt het DNA te leveren in de cel, en beide incubatietijd in deze oplossing (stap 3,4) en het percentage van PEG moet empirisch worden bepaald. De standaardconcentratie is 20%, met lagere concentraties verminderen de transformatie-efficiëntie en hogereconcentraties verlagen de levensvatbaarheid 28. Incubatietijd zo kort vijf minuut efficiënte transfectie van de protoplasten 27 werd verkregen.

De protoplasten kan worden afgebeeld op een luminescerend imaging platform. In deze video, hebben we een luminescentie plaatlezer uitgerust met externe verlichting gebruikt (rode en blauwe LED's 630 en 470 nm, respectievelijk, op een gecombineerde intensiteit van ~ 20 uE), die zorgt voor hoge doorvoer screening en frequente metingen. Andere beeldapparatuur die luminescentie gedetecteerd, zoals alternatieve plaatlezers of opstellingen rond een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera, zou evengoed worden toegepast zolang verlichting beschikbaar is voor de fotosynthese. Het voordeel van een CCD camera gemonteerd op een bestuurbare kast wordt licht en temperatuur kunnen worden geprogrammeerd. Een nadeel is de langere opnametijdstip invoering langdurige duisternis die stress kan veroorzaken aan de protoplasten naast verstorening endogene tijdwaarneming. Ongeacht welke experimenteel platform wordt gekozen, aanpassing van instellingen waarschijnlijk noodzakelijk zijn in vergelijking met instellingen voor zaailingen of volgroeide planten. In onze ervaring, het verhogen van de concentraties van reporterplasmide tijdens transfectie en / of luciferine in de beeldvorming buffer kan eventuele onregelmatig of snel dempende ritmes die zich kunnen voordoen in de eerste experimenten op te lossen.

In toekomstige experimenten, kan de hier beschreven methode worden toegepast om de circadiaanse fenotype van elke mutant Arabidopsis lijn bestuderen. Met kleine aanpassingen, kan het effect van bijvoorbeeld verschillende geneesmiddelen op tijdwaarneming worden bestudeerd in deze opstelling. Bovendien kan de transfectie worden gewijzigd om kunstmatige microRNA voor gen-silencing 19 omvatten verder uitbreiden van de veelzijdigheid van dit protocol. Protocollen bij rijstprotoplasten genereren zijn gerenommeerde 29 en de imaging protocol hier gepresenteerde kan evengoed worden toegepast op onze u verdernderstanding van de klok in economisch belangrijke monocotyle gewasplanten.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Prof. David Somers en Dr. Jeongsik Kim bedanken voor de luciferase reporter plasmide en de initiële methodeontwikkeling. Prof. Karen Halliday verstrekte vriendelijk alle circadiane mutante lijnen die in dit onderzoek werden gebruikt. Dit onderzoek werd ondersteund door Royal Society onderzoekssubsidies RS120372 en RS140275. GvO is een Royal Society University Research Fellow (UF110173).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride Merck Millipore219466
Pectinase R10Sigma AldrichP2401
D-mannitolSigma AldrichM4125 
CaCl2Sigma AldrichC4901
KClSigma AldrichP3911
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA4503
MESAcros Organics327765000
NaClAcros Organics327300010
GlucoseFischer ScientificG/0500/60
MgCl2Sigma AldrichM2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000Acros Organics434630010
Fetal Bovine Serum Sigma AldrichF4135
D-Luciferin, FireflyBiosynth AGL-8200Los op luciferinepoeder in 0,1 M trisfosfaatbuffer pH 8,0 tot een concentratie van 50 mM
AmpicillinSigma AldrichA9618
Comply Steam Indicator Tape3M1222
Magic Tape3M819-1460
Petri DishesScientific Laboratory SuppliesSLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, whiteGreiner Bio-One655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well platesPerkin Elmer6050195
Syringe, 10 ml, w/o needleBD Plastipak302188
Syringe filter 0.22 µmMerck MilliporeSLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)Gratis te downloaden op amillar.org
QIAfilter Maxiprep KitQiagen12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cellHawksleyAC6000
Bright field microscopeOptika MicroscopesB-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence moduleBerthold Technologies Ltd57947/57948

Referenties

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968(2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130(2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16(2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30(2011).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Analyse van circadiane periodeisolatie van protoplastenluminescente reportertransfectie van protoplastenscreening van circadiane fenotypesluminescentie imagingfree running periodeconstante lichtomstandighedenanalyse van biologische ritmes
Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.