Methodenartikel

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

DOI:

10.3791/54587

⸱

23 oktober 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten worden veel gebruikt gereedschap voor het bestuderen van eiwit lokalisatie en dynamiek van evenementen zoals het cytoskelet remodeling en vesiculair transport in levende cellen. Kwantitatieve methoden gebruikt chimeer GFP-fusies zijn ontwikkeld voor vele toepassingen; echter GFP enigszins resistent tegen proteolyse, waardoor de fluorescentie blijft in het lysosoom / vacuole, die kwantificering van vracht handel kan belemmeren de endocytische route. Een alternatieve werkwijze voor het kwantificeren endocytose en post-endocytische handel gebeurtenissen maakt gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP dat wordt geblust in zure milieus. Chimère fusie van pHluorin aan de cytoplasmatische staart van transmembraan lading eiwitten leidt tot een demping van fluorescentie bij de oprichting van de lading in multivesiculaire lichamen (MVBs) en levering aan het lysosoom / vacuole lumen. Zo, het doven van vacuolaire fluorescentie vergemakkelijkt kwantificeringcatie van endocytose en het begin van de gebeurtenissen in de endocytische route. Dit artikel beschrijft methoden waarbij pHluorin gemerkte ladingen voor het kwantificeren van endocytose via fluorescentiemicroscopie en populatie gebaseerde assays met flowcytometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesiculair transport speelt een belangrijke rol bij het handhaven organel identiteit en functie in eukaryotische cellen, en is een belangrijk mechanisme voor het reguleren van eiwit en membraan samenstelling van individuele cellulaire compartimenten. Op het plasmamembraan, fusie van vesicles exocytose levert nieuwe eiwitten en membranen aan het oppervlak van de cel, terwijl vesicles gegenereerd door middel van endocytose membraan en eiwitten te verwijderen van het oppervlak voor daaropvolgende recycling of richten naar het lysosoom. Aldus endocytose is belangrijk voor nutriënten en reacties op de extracellulaire omgeving. Exocytose en endocytose zijn evenwicht te plasmamembraan oppervlakte te reguleren, en de omzet van de beschadigde eiwitten mogelijk te maken.

Studies in gist en zoogdiercellen zijn een groot aantal eiwitten die betrokken zijn endocytose, evenals meerdere endocytotische wegen die internalisatie specifieke ladingen bevorderen of die handeling vastgesteld in reactie op verschillende environmental omstandigheden. De best bestudeerde pathway is clathrine gemedieerde endocytose (CME), waarin clathrine en cytosolische additionele eiwitten assembleren tot een laag structuur de ontluikende endocytische vesicles stabiliseren. Experimenten in de gist Saccharomyces cerevisiae hebben belangrijke inzichten in de dynamiek en de volgorde van de werving voor vele endocytische eiwitten 1-3 opleverde. Met name wordt de CME machine sterk geconserveerd door evolutie zodanig dat de meeste CME-gerelateerde eiwitten in gist hebben humane orthologen; dus, gist is een belangrijk instrument voor het begrip van de mechanismen van endocytose die zijn geconserveerd in hogere eukaryoten geweest. Bijvoorbeeld, studies met behulp van gist vastgesteld dat de vorming en rijping van CME structuren (als corticale actine vlekken in gist genoemd) omvat de sequentiële rekrutering van veel eiwitten, te beginnen met clathrine en-cargo bindende adapter eiwitten, gevolgd door de aanwerving van extra endocytische accessoire eiwitten,activering van Arp2 / 3-gemedieerde actine polymerisatie, en werving van eiwitten die betrokken zijn bij blaasje splitsing 1,2. Aanwerving van CME machines eiwitten aan actine pleisters corticale is een sterk geordende en stereotiepe proces, en de precieze volgorde van de werving voor veel eiwitten is vastgesteld met betrekking tot andere onderdelen van de CME machines. Belangrijk is, hebben recente studies een vergelijkbare orde van werving voor CME eiwitten op-clathrine gecoate pits in zoogdiercellen 4 bevestigd.

Naast CME vele celtypen bezitten één of meer clathrine afhankelijke endocytose (CIE) pathways die afhankelijk zijn van alternatieve mechanismen vorming vesikel en internalisatie van het plasmamembraan 5-7 promoten. In gist, hebben we onlangs geïdentificeerd een CIE traject dat de kleine GTPase Rho1 en het activeren van guanine nucleotide exchange factor (GEF), ROM1 8,9 gebruikt. Rho1 activeert de formin Bni1 om actine polymerisatie 1 te bevorderen0,11, die nodig is voor deze vorm van clathrine afhankelijke endocytose in gist 12. Bovendien, de α-arrestine eiwitfamilie rekruteren ubiquitine ligase Rsp5 om lading ubiquitinatie en daaropvolgende internalisering bevorderen door CME 13-17, en ook bevorderen lading internalisatie via de CIE route, mogelijk door directe interactie met eiwitten die betrokken zijn CIE 18. Verschillende CIE trajecten bestaan ook in zoogdiercellen, waaronder clathrine-onafhankelijke en fagocytische paden die afhankelijk zijn van de Rho1 ortholoog, RhoA 9,19. De rol van RhoA in zoogdiercellen CIE is slecht begrepen; dus, kunnen studies in gist extra mechanistische inzichten die van toepassing zijn op zoogdieren CIE zijn te verstrekken.

Nauwkeurige kwantificering van endocytische gebeurtenissen kunnen belangrijke informatie over de rol van specifieke eiwitten bij het reguleren van endocytose te bieden, en kunnen de effecten van mutaties op de lading internalisatie of progressio onthullenn door de endocytische route. Hiertoe kan biochemische methoden worden toegepast om ligand opname controleren of snelheden van afbraak van eiwitten endocytische lading te meten. In levende cellen, fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) en de varianten om ladingen van belang maakt directe visualisatie van vrachtvervoer. Echter, GFP ladingen hebben een beperkt nut voor het kwantificeren van endocytose omdat GFP is resistent tegen afbraak in het lysosoom (of vacuole in gist). Bovendien GFP fluorescentie slechts gedeeltelijk gevoelig voor veranderingen in pH en nog waarneembaar in de vacuole lumen 20,21. Derhalve fluorescentie van het GFP-tag blijft in de vacuole lang nadat de rest van de lading is afgebroken en whole-cell kwantificering lading intensiteit onnauwkeurig zijn als gevolg van langdurige GFP fluorescentie in de vacuole.

Om de nadelen van vacuolaire GFP fluorescentie overwinnen we eerder gebruikt superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige variant van GFP die helder fluoresceert bij neutrale pH, maar verliest fluorescentie in zure omgevingen zoals het lumen van de vacuole / lysosoom 20,22,23. Het plaatsen van een pHluorin tag op de cytoplasmatische staart van endocytische ladingen maakt visualisatie van de ladingen op het plasmamembraan en op de vroege endosomen, waar de pHluorin tag blijft blootgesteld aan het cytoplasma (Figuur 1A). Al in endosomen rijpen, de endosomale sorteren complex die nodig is voor het vervoer (ESCRT) machines pakketten-oppervlak gelokaliseerde ladingen in blaasjes die knop in het lumen van de endosoom, het genereren van multivesiculaire lichamen (MVBs) 24. Voor ladingen die in de interne MVB blaasjes hebben opgenomen, de pHluorin tag kijkt in de richting van het blaasje lumen. Interne MVB blaasjes worden aangezuurd; dus pHluorin-gelabeld lading verliezen fluorescentie op de vroege endosomen als ze volwassen worden in MVBs 20. Daaropvolgende fusie van het MVB de vacuole levert de inhoud MVB luminalevoor de afbraak, blijven en pHluorin labels geblust in het zure milieu van de vacuole lumen.

Dit document bevat gedetailleerde beschrijvingen van de kwantitatieve endocytische assays met behulp van ladingen met cytoplasmatische pHluorin labels in gist. Stammen die pHluorin-tag ladingen kunnen worden gebruikt in kinetische en / of eindpunt assays, afhankelijk van de eigenschappen en handel gedrag van de specifieke lading. Bovendien hebben sommige pHluorin-tag ladingen zijn vatbaar voor high-throughput analysemethoden, waaronder flowcytometrie. Belangrijk is dat de pHluorin tag is een veelzijdig instrument voor het bestuderen van endocytische gebeurtenissen in levende cellen, waardoor kwantificering van endocytose en vergelijking van endocytotische functie in het wild-type en mutante stammen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oplossingen en Media

  1. Bereid de volgende bestanden, media en platen:
    1. 10x YNB bereiden, los 67 g gist basis van stikstof ontbreekt aminozuren in 1 liter water. Steriliseer door filtratie door een 0,22 urn nitrocellulosefilter.
    2. Bereid YNB medium met behulp van 1x YNB (van 10x voorraad) met 2% dextrose (van een steriele 50% w / v voorraad) en 1x aminozuur / nutriënt mengsel (van 100x voorraad, zie stap 1.1.4). Voor plasmideselectie, weglaten afzonderlijke aminozuren of nutriënten nodig. Voor inductie van expressie Mup1 bovendien weglaten methionine uit het aminozuur / nutriëntmengsel.
    3. Bereid YNB-platen gebruikt 1x YNB (van 10x voorraad), 2% glucose (uit een steriele 50% w / v stock), 0,7 g / l aminozuur / voedingsmengsel (zie stap 1.1.5) en 2,5% agar. Bereid plaatmedium autoclaaf 25 g agar en 0,7 g aminozuur / voedingsmengsel per 860 ml water. Laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, voeg vervolgens 100 ml van 10 x YNB en 40 ml of 50% glucose. Gietplaten (ongeveer 30 ml medium per 10 cm schaal), zodat het medium gestold bij kamertemperatuur, en opslag platen bij 4 ° C.
    4. Bereid 100x aminozuur / voedingsoplossing voorraadoplossing (voor vloeibare medium) door oplossen van de volgende in 100 ml gedeïoniseerd water: 0,1 g L-methionine, 0,3 g elk van L-leucine en L-lysine en 0,2 g per L-histidine , L-tryptofaan, adenine en uracil (andere aminozuren en voedingsstoffen kunnen worden opgenomen als nodig is voor specifieke stammen). Gebruik zacht vuurtje als dat nodig is om op te lossen, en steriliseer door een 0,45 micrometer nitrocellulose filter. Bewaar bij kamertemperatuur met bescherming tegen licht. Voor plasmide selectie, voor te bereiden stock oplossingen ontbreekt specifieke onderdelen als dat nodig is.
    5. Bereid aminozuur / voedingsmengsel (voor platen) door het volgende te combineren: 0,5 g adenine, 4 g L-leucine en 2 g per stuk L-histidine, L-lysine, L-methionine, L-tryptofaan, L- tyrosine en uracil. Maal met een mortier en een stamper, en op te slaan met een probescherming tegen licht. Voor plasmide selectie, voor te bereiden mengsels ontbreekt specifieke onderdelen als nodig is, en het gebruik van 0,7 g aminozuur mengsel per liter van de plaat medium (zie stap 1.1.3).
  2. Bereid 8-well kamer objectglaasjes voor microscopie door het bekleden van het oppervlak van de dia met concanavaline A (ConA). Aan elk putje van de kamer schuif, voeg 25 ul van 2 mg / ml ConA opgelost in water. Met behulp van een pipet, spreid het ConA over het bodemoppervlak van de put, dan laat de schuif aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4-8 uur. Gebruik bij voorkeur kamer dia's binnen 24 uur van ConA coating.
  3. Genereer giststammen met in-frame fusies van GFP of pHluorin deze endocytotische lading plaats via de polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde integratie werkwijze Longtine et al. en Goldstein en McCusker 25,26.
    LET OP: Plasmiden die pHluorin tagging cassettes met resistentiegenen voor kanamycine (KANMX6) en nourseothricin ( NATMX4) werden eerder 20 beschreven.
    1. Amplificeren GFP of pHluorin cassettes met selecteerbare markers met primers bevatten additionele sequenties specifiek voor de plaats van genomische integratie 20,25.
    2. Transformeer de resulterende PCR product in de gewenste giststam met de lithiumacetaat werkwijze 27.
    3. Selecteren voor integratie van de cassette door groeiende cellen op YPD platen die het geschikte geneesmiddel. Platen, autoclaaf 10 g gistextract, 20 g pepton, 0,1 g tryptofaan en 25 g agar in 960 ml water bereiden. Voor het storten platen, laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, voeg 40 ml 50% glucose en ofwel G418 tot een uiteindelijke concentratie van 200 ug / ml voor KANMX6 selectie of nourseothricin tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml voor NATMX4 selectie.
    4. Bevestigen integratie van het GFP of pHluorin tag in individuele kolonies door PCR en / of Western blotting met behulp van anti-GFP antilichamen,en door detectie van het gemerkte eiwit door fluorescentiemicroscopie 20.
      OPMERKING: Specifieke giststammen en plasmiden die in deze studie zijn weergegeven in de tabellen 1 en 2, respectievelijk.

2. Endpoint Assay voor steady-state fluorescentie constitutief geïnternaliseerd Endocytische Cargo

  1. Inoculeren cellen (~ 3 kleine kolonies) in 5 ml YNB medium zonder aminozuren en voedingsstoffen zoals vereist voor plasmide onderhoud (indien van toepassing). Kweek cellen gedurende 16-24 uur in een orbitale schudden incubator bij 30 ° C met 250 rpm schudden. Alternatief strook een ~ 1-2 mm kolonie van cellen op een YNB-plaat die aminozuren en voedingsstoffen voor plasmideselectie en groeien de cellen overnacht bij 30 ° C.
  2. Meet de densiteit (OD 600) van elke overnacht kweek met een spectrofotometer. Bereid een 5 ml verdunning 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB medium zonder aminozuren en voedingsstoffen voor plaSmid onderhoud en groeien gedurende ongeveer 3 uur bij 30 ° C onder schudden. Bij gebruik van cellen uitgestreken op een plaat, deze stap overslaan en doorgaan met stap 2.4 (zie hieronder).
  3. Meet de densiteit (OD 600) cellen, die nu moet tussen 0,6-1,0 OD 600 / ml. Transfer 1,5 ml van cultuur aan een microfugebuis en pellet cellen bij 8000 rpm (6800 xg) gedurende 2 minuten. Verwijder 1475 pl supernatant.
  4. Breng cellen een fluorescentiemicroscoop. Vóór afbeelden elk monster, een dia door resuspenderen van de cellen in de resterende medium en zet 3 pl celsuspensie onder een dekglaasje. Als alternatief voor te bereiden 8-well kamer dia's zoals hieronder beschreven in protocol 3, met behulp van YNB medium als geschikt voor plasmide selectie. Idealiter afbeelding cellen met een 100X, 1.4 of hoger numerieke lensopening (NA) olie-immersie objectief, een 12- of 16-bits camera, en excitatie / emissie filters geoptimaliseerd voor GFP fluorescentie.
    NB: Bij gebruik van cellen gekweekt door uitstrijken ona plaat, de voorbereiding van de glijbaan door het plaatsen van 3 ul van verse YNB medium op een cover slip. Met behulp van een pipet tip, laat een kleine kolonie van cellen van de plaat, verspreiden de cellen in de YNB medium, en zet de verkregen suspensie op een glasplaatje onmiddellijk voor beeldvorming.
  5. Afbeelding 4-6 willekeurige velden van cellen voor elke conditie, met dezelfde opnameparameters (dwz filtersets en belichtingstijd) voor alle beelden binnen een experiment.
    LET OP: Het verzamelen van het DIC een helderveld of voor elk veld kan nuttig zijn voor cellen, waar het pHluorin signaal wordt gedoofd in MVB en vacuolaire compartimenten.
  6. Kwantificeren van fluorescentie-intensiteit van ten minste 30-50 cellen voor elke omstandigheid (zie protocol 5).

3. Kinetic Assay voor het kwantificeren van de Humor van Koopvaardij die Gereglementeerde Endocytosis ondergaan

  1. Enten 2-3 kolonies van gistcellen (ongeveer 2 mm diameter per kolonie) in 5 ml YNB medium zonder methionine en voegnele aminozuren en voedingsstoffen voor het onderhouden plasmideselectie. Groeien kweken gedurende 16-24 uur bij 30 ° C onder schudden.
    OPMERKING: In dit artikel zal protocollen voor het bestuderen van gereguleerde endocytische lading eiwitten gebruik van de methionine permease, Mup1 maken. Andere ladingen die gereguleerde endocytose ondergaan zijn ook geschikt voor tagging met pHluorin (bijvoorbeeld de uracil permease Fur4, dat zich ophoopt in het plasmamembraan in afwezigheid van uracil en internaliseert in reactie op extern aangelegde uracil); Voor deze ladingen, moeten media voorwaarden worden aangepast aan de specifieke expressie, inductie en internalisatie voorwaarden voor die lading te geven.
  2. Meet de densiteit (OD 600) van elke overnacht kweek ongeveer 3 uur voor beeldvorming. Bereid een verdunning 5 ml van 0,35-0,4 OD 600 / ml in YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmide onderhoud en groeien bij 30 ° C onder schudden.
  3. Pre-evenwicht van de microgaan de klimaatkamer of verwarmde stadium (indien beschikbaar) tot 30 ° C gedurende de 3 uur incubatie van stap 3.2.
  4. Breng 1 ml celkweek een microfugebuis en pellet cellen bij 8000 rpm (6800 x g) gedurende 2 min. Verwijder 975 pl supernatant.
  5. Bereid een ConA behandelde, 8-goed-glazen bodem kamer glijbaan voor imaging (protocol 1.2).
  6. Voeg 200 ul YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmideselectie aan elk putje. Resuspendeer de celpellet uit stap 3.4 in de resterende supernatant en neerzetten 2,5 pl celsuspensie in het midden van elk putje. Disperse cellen over het oppervlak van de put door en neer te pipetteren, en laat cellen bezinken gedurende 5-10 minuten.
  7. Plaats de kamer dia op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop geëquilibreerd tot 30 ° C (zie stap 3,3). Zoek een gebied van de cellen met behulp van helderveld verlichting.
  8. Voeg 50 pl YNB medium dat 100 ug / ml methionine(Voorverwarmd tot 30 ° C) aan de 200 ul medium in de put tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml te verkrijgen. Te verstoren het medium in de put om te voorkomen dat de cellen drijven van de bodem.
  9. Laat de cellen equilibreren gedurende 2 minuten voor het begin van de beeldvorming. Onmiddellijk voorafgaand aan het vastleggen van het eerste beeld, pas de microscoop om de gewenste focal plane (meestal een equatoriale focal plane werkt het beste).
  10. Verwerven GFP en helderveld (of DIC) beelden op 5 min intervallen gedurende 45-60 min, waarbij dezelfde opnameparameters voor alle afbeeldingen in een tijdreeks (bijvoorbeeld 100 x 1,4 NA olie-immersie objectief en 500 msec acquisitietijd gebruiken GFP filter, 100 msec overname tijd met behulp van DIC filter).
    OPMERKING: als stadium van de microscoop en imaging software niet automatisch kunnen corrigeren focal plane drift, kan het nodig zijn om de focus voor elke beeldvorming tijdstip handmatig bijstellen. Bovendien overname tijden zullenmicroscopen variëren als gevolg van verschillen in verlichting en filters, en optimale omstandigheden worden bepaald met de hand voor het begin van het experiment. Als een endocytische vracht dan Mup1 wordt gebruikt, kan het nodig zijn om de acquisitietijd en beeldvorming intervallen, alsmede de duur van het experiment te wijzigen, om de internalisatie kinetiek van deze vracht weerspiegelen.
  11. Kwantificeren fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen op elk tijdstip (zie protocol 5) en een automatische waarden als percentage van de initiële intensiteit van het eerste beeld.

4. Endpoint Assay voor het kwantificeren van Endocytische Koopvaardij die Gereglementeerde Endocytosis ondergaan

  1. Bereid je cellen voor beeldvorming zoals beschreven in protocol 3 (stappen 3.1 tot 3.6).
  2. Afbeelding 4-5 willekeurige velden van cellen voor elke conditie onmiddellijk vóór het toevoegen methionine, gebruik helderveld en GFP filtersets.
  3. Voeg 50 pl YNB medium dat 100 ug / ml methionine (pre-warmed tot 30 ° C) aan de 200 ul medium in de put tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml te verkrijgen. Te verstoren het medium in de put om te voorkomen dat de cellen drijven van de bodem.
  4. Afbeelding 4-5 willekeurige velden van cellen 30 minuten na toevoeging van methionine, met dezelfde verwervingsparameters als de 0 min tijdstip (stap 4,2).
  5. Kwantificeren fluorescentie-intensiteit van ten minste 30-50 cellen voor elk tijdspunt (zie protocol 5). Express waarden in procenten Mup1-pHluorin geïnternaliseerd na 30 min met de formule: [gemiddelde intensiteit bij 0 min - gemiddelde intensiteit 30 min] / [gemiddelde intensiteit bij 0 min] x 100%.
    Opmerking. Het is mogelijk om gelijktijdig uitvoeren tot acht eindpunten assays door spreiding van de starttijd van elke test Tabel 3 een voorbeeldworkflow acht gelijktijdige testen.

5. Post-acquisitie Analyse

  1. beelden Export van acquisitie software als een 16-bit tag-bestandsformaat (.tif of .tiff formaat).
    LET OP: Andere bestandsformaten kunnen ook geschikt zijn, en idealiter gebruiken lossless compressie algoritmen. 8-bits beelden zijn doorgaans niet geschikt voor kwantificatie doeleinden.
  2. Open bestanden met behulp van ImageJ software (vrij beschikbaar naar keuze van 'Open' in het menu 'Bestand'. Met imago van de fluorescentie voor kwantificering en de helderveld beeld / DIC als een verwijzing naar de locatie te identificeren van de cellen en dode cellen uit te sluiten (indien aanwezig ), die donkerder dan levende cellen wanneer bekeken door DIC en worden autofluorescente wanneer bekeken met GFP excitatie / emissie filters verschijnen.
  3. Voer een achtergrond aftrekken imago van de fluorescentie op. Voor beelden met een oneffen achtergrond signaal, gebruik maken van de 'achtergrond aftrek' algoritme in het 'menu Proces'. Gebruik de standaardinstelling (rollende bal straal van 50 pixels), die in het algemeen voldoende voor kwantificering doeleinden.
    LET OP: Een alternatief background aftrekken methode om beelden met egale achtergrond wordt beschreven in stap 5.3.1.-5.3.2; De bovenstaande methode werkt ook voor egale achtergrond.
    1. Voor beelden met egale achtergrond (dwz achtergrondintensiteit bij benadering constant in alle randen en in het midden van het beeld), een handmatige achtergrond aftrek. Klik op de knop 'de vrije hand selecties' gevonden in de belangrijkste ImageJ venster, en selecteer 3-5 willekeurige regio's in het beeld dat geen cellen bevatten.
    2. Open de functie 'Set Metingen' in het menu 'Analyseren', selecteert u de 'Mean Gray Value' parameter, en het meten van de intensiteit waarden met behulp van de functie 'Measure' (ook te vinden in het menu 'Analyseren'). Bereken de gemiddelde waarde van de 3-5 gemeten regio's, en aftrekken van alle volgende metingen in dat beeld.
  4. Voor kwantificering van kinetische assays (protocol 3), het genereren van single, beeld gestapeld voor de time-serie. Open de fluorescentie beelden van elk tijdstip in chronologische volgorde, en het genereren van een stapel met behulp van de 'Images te stapelen' functie (in het menu 'Beeld', onder de Stacks submenu).
  5. Schetsen een cel met behulp van de vrije hand selectie-instrument, en zorg ervoor dat de gehele cel, maar zo weinig in de buurt is buiten de cel mogelijk te maken.
  6. Meet de volgende parameters: "Ruimte, Integrated Density 'en' Mean Gray Value '. Selecteer parameters met behulp van de 'Set Metingen' functie, gelegen in het 'Analyze' menu.
    OPMERKING: Geïntegreerde dichtheid overeenstemt met de som van alle pixelintensiteiten binnen het geselecteerde gebied, en gemiddelde grijswaarde correspondeert met [Integrated Densiteit / Area], die intensiteitswaarden corrigeert celgrootte.
  7. Open de 'ROI Manager' in het menu 'Analyseren', onder sub-menu 'Extra'. In het venster ROI Manager, klik op de knop 'Toevoegen' om de gemarkeerde regio in te voerenn als een nieuwe regio van belang (ROI).
  8. Herhaal stap 5,4 tot 5,6 voor de overige cellen in de afbeelding. Exclusief eventuele dode cellen zoals vastgesteld door helderveld / DIC en fluorescentie (dode cellen donkerder in DIC afbeeldingen en hebben autofluorescente cytoplasma signaal wanneer bekeken met GFP excitatie / emissie; zie figuur 2F) en alle cellen die de rand van het beeld aan te raken. Sla de geselecteerde ROI als een zip-bestand door te klikken op de knop 'Meer' in het venster 'ROI Manager', en exporteren alle metingen naar een spreadsheet of statistische analyse software.
  9. Voor kwantificering van kinetische assays (protocol 3), schetsen en het meten van een cel van het oorspronkelijke tijdstip zoals beschreven in stap 5.4 en 5.5. Gebruik dezelfde ROI voor het meten van alle volgende tijdstippen tijdens het experiment.
  10. Voor eindpunt assays (protocollen 2 en 4), meet minste 30-50 cellen per conditie. Voer kwantificering voor ten minste 2-3 afbeeldingen en omvatten alle cellen in elkafbeelding die voldoen aan de in stap 5.8 in de analyse criteria.
  11. Beoordelen van statistische significantie tussen de monsters met behulp van one-way ANOVA, gevolgd door meerdere vergelijkingstest Tukey voor post hoc analyse.

6. Bevolking Analyse van Mup1-pHluorin Endocytosis door flowcytometrie

  1. Enten 2-3 kolonies van gistcellen (ongeveer 2 mm diameter per kolonie) in 0,5 ml YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren en voedingsstoffen voor het onderhouden plasmideselectie. Groeien cellen in 5 ml ronde bodem buizen gedurende 16-24 uur bij 30 ° C op een roller trommel.
  2. Voeg 1,5 ml YNB medium zonder methionine en additionele aminozuren of nutriënten voor plasmide onderhoud en groeien bij 30 ° C gedurende nog 3 uur op een roller trommel.
  3. Breng 1 ml cellen in elk van twee 5 ml rondbodem buizen. Voeg 0,25 ml YNB medium -Met de eerste buis (-Met toestand) en 0,25 ml YNB medium dat 100 ug/ Ml methionine aan de tweede buis tot een uiteindelijke concentratie van methionine 20 ug / ml (+ Met conditie) werd verkregen. Incubeer cellen bij 30 ° C gedurende 45 minuten op een roller trommel.
  4. Analyseer cellen door flowcytometrie, selecteren voorwaartse verstrooiing (FS) als maat voor celgrootte en Mup1-pHluorin fluorescentie-intensiteit van een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) filter als een maat voor de lading internalisatie.
  5. Met de schuif toetsen om de spanning van de FS en FITC kanalen aan te passen om detectie te optimaliseren voor de orde van grootte en fluorescentie-intensiteit van de gistcellen worden gebruikt (deze experimenten gebruikte instellingen waren 50 V voor FS en 400 V FITC).
    OPMERKING: Spanning voor beide kanalen hangt af van de flowcytometer gebruikt. Deze stap dient voor of tijdens de 45 minuten behandeling met methionine (stap 6,3).
  6. Meet FS en fluorescentie-intensiteit voor 10.000 cellen van elke staat, met behulp van de hoge stroomsnelheid setting. Genereer een scatter plot van FS tegen fluocerend intensiteit: klik "add grafiek 'selecteert FITC (x-as) en FS (y-as), en de grafiek 1000 punten (de software waarden voor 1000 cellen, terwijl 10.000 cellen gemeten).
    OPMERKING: Voor maximale consistentie, analyseren cellen 45-50 min na toevoeging van methionine; Voor experimenten waarbij grote aantallen monsters, wankelen toevoegen van methionine aan de tijd die flowcytometrieanalyse tegemoet.
  7. -Met Omvatten en + Met voorwaarden voor wildtype (WT) cellen als controle. Met de poort functie toewijzen verticale poort met de WT + Met voorwaarde, zodat bij benadering 5% van de helderste cellen vallen rechts van de poort. Gebruik deze venstertijd voor alle andere voorwaarden aan het experiment.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steady-state lokalisatie en kwantificering van de constitutief geïnternaliseerde endocytische cargo eiwit Ste3

Aantonen dat pHluorin gemerkte ladingen kan worden gebruikt voor het kwantificeren van endocytose in levende cellen, lokalisatie van chimeer GFP en pHluorin fusies met het C-eindstandige cytoplasmatische staart van Ste3, het a-factor feromoon receptor in gist, werden vergeleken. Ste3 is een G-eiwit ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toepassingen van pHluorin voor het kwantificeren van endocytotische gebeurtenissen in gistcellen maakt gebruik van transmembraan ladingen waarin de fluorescente tag gefuseerd met de cytoplasmische staart van het eiwit (Figuur 1A). Voor de hier beschreven assays, ladingen zijn fel tl wanneer de pHluorin tag wordt blootgesteld aan neutrale omgevingen, maar worden gedoofd toen de pHluorin tag tegenkomt zure omstandigheden. Aldus wordt een pHluorin gemerkte endocytische lading gemakkelijk gedetecteerd bij h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Gero Miesenböck en Tim Ryan bedanken voor het delen van pHluorin cDNA dat werd gebruikt om reagentia te genereren in deze studie, Nathan Wright, Joanna Poprawski en Lydia Nyasae voor uitstekende technische assistentie, leden van het Wendland-lab voor nuttige discussies, en Michael McCaffery en Erin Pryce in het Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) voor advies en assistentie met microscopie en flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (aan B.W., GM60979) en de National Science Foundation (aan B.W., MCB 1024818). K.W. werd gedeeltelijk ondersteund door een opleidingssubsidie van de National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. werd ondersteund door ontwikkelingsfondsen van het Department of Biological Sciences aan Duquesne University en een National Science Foundation CAREER-subsidie 553143.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AdenineSigmaA8626-25GGebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
Bacto-agarFisherBP1423-2Gebruik voor bereiding van plaatmedia
BD Difco Yeast Nitrogen Base (zonder aminozuren)BD291920Gebruik voor bereiding van vloeibare en plaatmedia
Concanavalin ASigmaC5275-5MGGebruik voor coating van kamerglazen
DextroseFisherBP350-1Gebruik voor bereiding van vloeibare en plaatmedia
L-HistidineFisherBP382-100Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
L-LeucineAcros125121000Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
L-LysineFisherBP386-100Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
L-MethionineFisherBP388-100Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
L-TryptophanFisherBP395-100Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
L-TyrosineAcros140641000Gebruik voor bereiding van aminozuurmengsel
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)Thermo Scientific155411Gebruik voor kinetische en endpoint assays van Mup1-pHluorin internalisatie
UracilSigmaU0750-100GGebruik voor bereiding van aminozuurmengsel en voorraadoplossing
Axiovert 200 omgekeerd microscoopCarl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Olie Immersie ObjectieflensCarl ZeissObjectief moet 100X, 1.4NA of hoger zijn
SensicamCooke CorporationCamera moet een dynamisch bereik van 12-bit of hoger hebben
X-Cite 120PC Q VerlichtingsbronExcelitas Technologies
Slidebook 5 softwareIntelligent Imaging Innovations
ImageJ softwareNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

Gerelateerde artikelen