Methodenartikel

Een polyaniline gebaseerde sensor van nucleïnezuren

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 november 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleinzuren zijn gebruikelijke analyten voor het beoordelen van biologische systemen; echter kan vooringenomenheid door enzymatische manipulatie zorgwekkend zijn. Hier wordt een methode beschreven voor label-vrije detectie van nucleic zuren met behulp van polyaniline. Deze gevoelige, kosteneffectieve sensortechnologie kan enkelvoudige nucleotidenverschillen tussen moleculen onderscheiden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De detectie van nucleïnezuren staat centraal in diagnostische technologieën die worden gebruikt in onderzoek en de kliniek. Standaard benaderingen die in deze technologieën worden gebruikt, zijn gebaseerd op enzymatische modificatie die vooringenomenheid en artefacten kunnen introduceren. Een cruciaal element van detectieplatforms van de volgende generatie zal directe moleculaire detectie zijn, waardoor een behoefte aan amplificatie of labels wordt vermeden. Geavanceerde nanomaterialen kunnen de geschikte chemische modaliteiten bieden om labelvrije sensoren te realiseren. Geconjugeerde polymeren zijn ideaal voor biologische detectie, bezitten eigenschappen die compatibel zijn met biomoleculen en vertonen een hoge gevoeligheid voor gelokaliseerde veranderingen in de omgeving. In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het detecteren van nucleïnezuren met behulp van het elektrogeleidende polymeer polyaniline. Eenvoudige DNA 'probe' oligonucleotiden die complementair zijn aan doelnucleïnezuren worden elektrostatisch aan het polymeer bevestigd, waardoor een sensorsysteem ontstaat dat enkele nucleotidenverschillen in doelmoleculen kan onderscheiden. Buiten de specifieke en onbevooroordeelde aard van deze technologie is deze zeer kosteneffectief.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geconjugeerde polymeren bieden veel opties voor moleculaire sensoren. Dit omvat fluorescentie, elektronische en colorimetrische reacties1. Er zijn veel inspanningen geweest om geconjugeerde polymeren in nucleïnezuursensoren te integreren. De meeste systemen vereisen echter secundaire detectie, wat de sensoropties beperkt2. Onlangs rapporteerden we een op geconjugeerde polymeren gebaseerde sensorplatform gebouwd op polyaniline (PANI) dat de eigenschappen van dit polymeer benut en een label-vrij systeem creëert3. PANI is een uitgebreid geconjugeerd elektro-actief polymeer met eigenschappen zoals fluorescentie en weerstand die geschikt zijn voor het meten van biologische systemen4. De excitonen binnen de structuur zijn niet gelokaliseerd, wat leidt tot mobiliteit van de positieve lading tussen monomere subeenheden. Dit biedt een flexibel skelet van positieve ladingen die kunnen interageren met de negatief geladen ruggengraat van DNA5,6. Belangrijk is dat elektrostatisch gehechte DNA zo is georiënteerd dat stikstofbasen kunnen deelnemen aan basenparing. Associatie met DNA verandert de elektronische eigenschappen van PANI, een effect dat kan worden versterkt door UV-bestraling (Figuur 1)3. Met behulp van dit systeem kunnen oligonucleotiden die complementair zijn aan doelnucleïnezuren worden geïmmobiliseerd op PANI. Meerdere studies hebben aangetoond dat bij hybridisatie elektrostatisch geadsorbeerde oligonucleotiden zich dissociëren van PANI of andere kationische matrices als gevolg van conformationele veranderingen veroorzaakt door de overgang naar een dubbelstrengs DNA-structuur3,5,7.

In een sensorsysteem waarbij sondevestiging geconjugeerde polymeereigenschappen moduleert, kunnen hybridisatie-evenementen worden omgezet zonder labels of enzymatische modificatie van sondes of doelnucleïnezuren. Geconjugeerde polymeren bieden grote flexibiliteit in detectiemethoden, waaronder fluorescentie. Door PANI-fluorescentie te monitoren, kunnen concentraties van doelnucleïnezuren zo laag als 10-11 M (10 pM) worden gedetecteerd3. De detectie is snel, binnen 15 minuten na hybridisatie, en specifiek waarbij een enkele mismatch in een doelmolecuul kan worden gedifferentieerd3.

Fabricage van PANI-sensoren is eenvoudig. Hoog moleculair gewicht PANI kan worden gegenereerd dat goed gedispergeerd is in water met behulp van standaard syntheseprocedures die anilinemonomeer, oppervlakteactieve stof en gecontroleerde toevoeging van een oxidator omvatten. Het rendement kan erg hoog zijn en ongereacteerde oxidator kan worden verwijderd door te wassen met water, waardoor geen verdere PANI-groei plaatsvindt. PANI-probe associatie vindt spontaan plaats bij menging, en complexvorming wordt verbeterd door milde UV-blootstelling. Hybridisatie kan onmiddellijk worden uitgevoerd en de veranderingen in PANI-fluorescentie worden geanalyseerd na een korte incubatie. De eenvoud van deze technologie maakt het zeer toegankelijk voor veel laboratoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. verwerkbaar PANI Synthesis

  1. Oplossen aniline (1 ml, 11 mmol) volledig in 60 ml chloroform in een 250 ml rondbodemkolf. Roeren bij 600 rpm gedurende 5 minuten en koel af tot 0-5 ° C met ijs. Dit duurt meestal 15-20 min (Figuur 2A).
  2. Voeg natriumdodecylbenzeensulfonaat (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) aan de aniline oplossing in een rondbodemkolf onder roeren bij 600 rpm.
  3. Ontbinden ammoniumpersulfaat (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) in 20 ml water en voeg dit alles druppelsgewijs gedurende 30 min om te voorkomen dat oververhitting van de reactie.
  4. Het uitvoeren van de reactie bij 0-5 ° C gedurende 24 uur, en laat het op kamertemperatuur komen voor nog eens 24 uur.
  5. Observeer het reactiemengsel aanvankelijk melkwit worden na 15 min, vervolgens donkerbruin na 2 uur, en uiteindelijk tot donkergroen na 24 uur (Figuur 2B-F).
  6. Filter de PANI-NaDBS oplossing met een Buchner trechter. Meng met 80 ml chloroform en 120 ml water in alseparation trechter (figuur 2G).
  7. Incubeer de oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur en laat het donkergroene PANI de scheitrechter, waardoor ongereageerd NaDBS en APS in het waterige supernatant.

2. PANI-probe Mengen en UV-straling

  1. PANI verdunde oplossing 10x met chloroform-water (1: 3 v / v) en meng 200 pl verdund PANI met 6,4 pmol probe-DNA-oligonucleotiden door zachte schommelen gedurende 15 min in een microfugebuis.
  2. Bestraal het PANI-DNA-oplossing met 1200 uJ / cm2 UV in een crosslinker gedurende 2 min. Het is essentieel dat UV-blootstelling is beperkt tot de aangegeven hoeveelheid. Langdurige blootstelling aan UV compromissen de fluorescentieverandering van PANI waarschijnlijk door covalente verknoping van PANI en DNA.
  3. Pellet complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min, en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pellet opnieuw, en opnieuw te schorten in PBS.

3. Hybridization van PANI-probe

  1. Voeg 8 pi van 100 pM complementaire DNA-oligonucleotiden of doelnucleïnezuren aan 200 gl PANI-probe-complexen.
  2. Uitvoeren hybridisatie door tuimelen oplossing mengsel gedurende 15 minuten bij 40 ° C.
  3. Pellet de PANI complexen door centrifugatie bij 17.000 xg gedurende 6 min. Was met PBS en resuspendeer in water.

4. Emissie Steady State Fluorescence Measurement

  1. Voeg PANI van verschillende behandelingen in een 96 well microplaat en meet emissie fluorescentie in het 270-850 nm door excitatie bij 250 nm. Een emissie piek voor PANI moet worden opgemerkt ongeveer 500 nm.

5. fluorescentiemicroscopie Meting gehybridiseerde Duplex

  1. Drop laag PANI op een borosilicaat glazen dekglaasje en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur.
  2. Sonde (8 pi van 100 pM) toe te voegen op een gedroogde PANI film en bestralen met UV-licht (1200 uJ / cm2 ) gedurende 2 min.
  3. Was de PANI-probe film met PBS en droog bij 40 ° C gedurende 48 uur.
  4. Voeren hybridisatie gedurende 15 minuten door toevoeging van doelnucleïnezuren. Dit kan een biologisch monster of controle beoogd oligonucleotide (8 ui 100 uM) zijn. Volg met een PBS wassen.
  5. Het verkrijgen van de fluorescerende beelden met 40x vergroting, met een 500 nm lange pass filter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2A vangt de reactie opstart bij aanvang van de polymerisatie, dat wil zeggen, voor APS toevoeging. Micelvorming is de eerste stap in het reactieproces PANI-synthese optreedt bij micellaire interface. Figuur 2B toont een melkachtige oplossing na 5 min. 30 min na APS toegevoegd het reactiemengsel wordt een licht bruine kleur. Figuur 2C toont de kleurverandering geassocieerd met de vorming van oligomeren. Figuur 2D

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een PANI-gebaseerde sensor van nucleïnezuren vereist solubilisatie van het polymeer in water om te interageren met DNA en RNA. De dispersie van PANI in water wordt uitgevoerd onder toepassing van surfactanten micellen vormen zoals eerder gemeld 8. Naast de hier gebruikte NaDBS andere anionogene oppervlakteactieve stoffen als dodecyl ester van 4-sulfoftaalzuur, kunnen ionische surfactanten zoals nonylfenolethoxylaat of kationische surfactanten zoals cetyltrimethylammoniumbromide ook worden gebruikt voor de syn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd ondersteund door de University of Southern Mississippi College of Science and Technology en Mississippi College of Science and Technology en het Mississippi INBRE-programma (Award Nummer P204M103476 van het National Institute of General Medical Science).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aniline Fisher Scientific A7401-500 ACS, liquid, gekoeld
Ammonium peroxydisulfaatFisher Scientific A682-500 ACS, kristallijn
NatriumdodecylbenzeensulfonaatPfaltz & Bauer D56340 95% vast
ChloroformFisher Scientific MCX 10601 Vloeibaar
DNA-primersMWG operonn/aaangepaste DNA-sequentie ~20 bps
Microplaat USA Scientific 1402-9800 96 wellen, polypropyleen omdat het niet reageert op chloroform
Microplaat Adhesive FilmUSA Scientific 2920-0000 Vermindert verontreiniging van put tot put, monsterlekkage en verdamping
MicroscoopdekglasFisher Scientific 12-544-D PANI-gecoat op UV-bestraald dekglas
UV-crosslinker UVP HL-2000 Energie: X100 μJ/cm2; Tijd: 2 min
HybridisatieovenVWR01014705 TTemperatuur: 400 °C; met schommelen gedurende 15 min
Glasapparatuur Fisher ScientificDriehalsige ronde bodemfles voor reactie; druppeltrechter, stoppen, condensor, scheidingslepel
MicroscoopLeica Microsystems Leica IMC S80Vergroting 20X; Pseudokleur 536 nm; Blootstelling 86 msec; Versterking 1,0x; Gamma 1,6
MicroplaatlezerMolecular Devices 89429-536

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Polyaniline sensordetectie van nucle nezurenlabelvrije biosensorhybridisatie van DNA sondenfluorescentiemetingUV crosslinkingpolymeersynthesehybridisatie van nucle nezurenfluorescentiemicroscopiecentrifugatiewasbeurt

Gerelateerde artikelen