In dit werk werden poly(melkzuur)/polyethyleenglycol (PLA/PEG) scaffolds bereid door gebruik te maken van een combinatie van smeltmengen en selectieve uitloging. De hier besproken methode maakte het mogelijk om drie-laags scaffolds te ontwikkelen door zowel de porositeit als de poriëngrootte nauwkeurig te beheersen. De mechanische eigenschappen werden ook geëvalueerd in een fysiologische omgeving.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Facile en Eco-vriendelijke Route naar Poly (melkzuur) Steigers met Graded Pore Size Fabriceer
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De afgelopen jaren hebben functioneel gegradeerde scaffolds (FGS) een cruciale rol gekregen bij de productie van apparaten voor weefsel engineering. De belangrijkheid van dit nieuwe veld van biomaterialenonderzoek komt door de noodzaak om implantaten te ontwikkelen die de complexe functionaliteit van de verschillende weefsels kunnen nabootsen, inclusief een continue verandering van de ene structuur of samenstelling naar een andere. In dit laatste verband is een belangrijk onderwerp het ontwerp van geschikte scaffolds voor weefsel van de bot-kraakbeeninterface. In deze studie werden drie-gelaagde scaffolds met een gegradueerde poriëngrootte bereikt door poly(melkzuur) (PLA), natriumchloride (NaCl) en polyethyleenglycol (PEG) te smelten en te mengen. De poriëngrootteverdelingen werden gecontroleerd door NaCl-granulometrie en PEG-solvatie. Scaffolds werden gekarakteriseerd vanuit een morfologisch en mechanisch oogpunt. Er werd een correlatie gevonden tussen de bereidingsmethode, de poriearchitectuur en het mechanische gedrag onder compressie. De hechtingssterkte van de interface werd kwantitatief geëvalueerd door middel van een op maat gemaakte interfaalsterkteverslag. Verder werden, om de menselijke fysiologie na te bootsen, mechanische tests ook uitgevoerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 °C. De hier gepresenteerde methode biedt een hoge controle over porositeit, poriëngrootteverdeling en mechanische prestaties, en biedt dus de mogelijkheid om drie-gelaagde scaffolds met aangepaste eigenschappen te fabriceren door een eenvoudige en milieuvriendelijke route te volgen.
Inleiding
De belangstelling voor biologisch afbreekbare polymeren is de afgelopen jaren steeds belangrijker geworden, zowel in de academische wereld als in de industrie, vanwege de groeiende zorgen over plastic afval en de vermindering van het gebruik van niet-hernieuwbare bronnen1-7. In het bijzonder zijn biocompatibele en biologisch afbreekbare synthetische polymeren wijdverbreid in verschillende biomedische toepassingsgebieden, zoals gecontroleerde geneesmiddelafgifte8,9, absorberbare hechtdraden8,10, bioprocesintensificatie11 en weefselengineering12.
Weefselengineering richt zich op de ontwikkeling van apparaten die in staat zijn om normale functies in zieke of gewonde weefsels te herstellen en te behouden. De meeste inheemse weefsels bestaan uit verschillende soorten cellen en extracellulaire matrixsen (ECM's) in specifieke ruimtelijke hiërarchieën. Bijvoorbeeld, gewrichtskraakbeen (AC) bestaat uit verschillende zones met verschillende soorten en oriëntaties van collageenvezels en collageenbindende eiwitten. Bovendien vertonen kraakbeen en bot significant verschillende hiërarchische structuren. In deze context zou de bereiding van meerlaagse scaffolds met geëngineerde eigenschappen in elke laag het mogelijk maken om heterogene weefsels te vervangen door rekening te houden met alle lokale micro-omgevingen van deze complexe systemen13,14.
Op basis van de cellulaire/biologische en/of fysisch-chemische kenmerken van de scaffolds, kunnen de belangrijkste strategieën die worden toegepast in de weefselengineering worden onderverdeeld in monofasisch, bifasisch en trifasisch. Bifasische en trifasische benaderingen (BTA) gebruiken twee of drie verschillende poriënarchitecturen, materialen of vulstoffen om meerlagige functionele apparaten te bereiden. Bovendien kan een enkel materiaal worden gebruikt om bifase of trifasische apparaten te bereiken, zolang het mogelijk is om een gradiënt in zijn fysische eigenschappen te creëren12.
Celmigratie speelt een sleutelrol in de morfogenese, ontsteking, wondgenezing en tumormetastase. Celbeweging wordt aangemoedigd door de aanwezigheid van een gradiënt van chemisch-fysische eigenschappen van het oppervlak tot het kern van het apparaat. Daarom kunnen biomaterialen die voldoen aan de hierboven besproken vereisten nuttig zijn bij het bestuderen van celmigratie. Naast chemische gradiënten die celmigratie activeren (chemotaxis), kunnen ook mechanische eigenschappen van het celcultuursubaat leiden tot celbeweging (mechanotaxis)15.
De meerlaagse structuur kan ook zorgen voor de instelbare afgifte van specifieke geneesmiddelen die in de polymeermatrix zijn opgenomen, door de specifieke oppervlakte van de laag of de hoeveelheid geladen geneesmiddelen te veranderen.
In de afgelopen tien jaar zijn er, om scaffolds met een discreet of continu gradiënt van morfologische eigenschappen, zoals porositeit of poriegrootte, te ontwikkelen, verschillende benaderingen gepresenteerd16-31. De meest recente artikelen richtten zich op de bereiding van BTA door gebruik te maken van: deeltjesuitloging 12,28,32, gasschuimtechniek16, elektrospinnen17-19, laag-voor-laag giettechniek20, rapid prototyping21,22, thermisch geïnduceerde fasescheiding (TIPS)22, centrifugatie en vriesdrogen24,25, drievoudig periodieke minimale oppervlakken (TPMS)26, vriesgieten27-30.
In het kader van dit werk presenteren we een snelle en eenvoudige route om PLA-gebaseerde drie-laagse poreuze scaffolds (TLS) te bereiken, door smeltmenging, compressievorming en zoutleging te combineren. Anders dan de meeste technologieën die gewoonlijk worden gebruikt voor scaffoldproductie, kan de hierin geadopteerde strategie als volledig milieuvriendelijk worden beschouwd, aangezien het geen giftige oplosmiddelen vereist die mogelijk gevaarlijk zijn voor het milieu en voor levende cellen en weefsels32. De basisverwerking-structuur-eigenschapsrelaties die in deze studie zijn vastgesteld door zowel morfologische kenmerken als mechanische gedrag van de vervaardigde apparaten te analyseren, bieden richtlijnen voor toekomstige vooruitgang bij het ontwerpen van multifunctionele gegradeerde scaffolds met specifieke doeleigenschappen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. steiger Fabrication
- Maal NaCl in een laboratorium menger gedurende 20 minuten en droog het op een verwarmingsplaat bij 100 ° C.
- Zet de gedroogde NaCl (45 g op tijdstip) in een zeefmachine gedurende 30 minuten op de hoogste beschikbare frequentie zonder zich in resonantie. Verzamel zout zes fracties, gaande van 500 urn tot 1000 urn (M 500); van 300 urn tot 500 urn (M 300); van 100 urn tot 200 urn (M 100); van 90 urn tot 100 (M 90); van 45 urn tot 65 urn (45 M) en tenslotte 10 M zout deeltjes kleiner dan 45 urn zoals schematisch in figuur 1.
- Vacuüm drogen 's nachts alle materialen om hydrolytische splitsing tijdens de verwerking te voorkomen. Voor elk materiaal, selecteert de temperatuur teneinde de mate van drogen te maximaliseren zonder het overwinnen - in het geval van polymeren - de glasovergang. Kies daarom T = 90 ° C voor PLA en T = 25 ° C gedurende PEG, T = 105 ° C NaCl.
- VoedenPLA, PEG en NaCl, respectievelijk een gewichtspercentage samenstelling van 20/5/75, een batchmenger operating bij T = 190 ° C en n = 60 rpm en vervolgens verwerken tot het bereiken van een constante waarde van het koppel, meestal na ongeveer 10 minuten. Daarna snel verzamel het resulterende materiaal.
- Bereid de mono-lagen met een klinisch pers werkt bij 210 ° C, zet de mengsels in geschikte cilindrische vormen met een diameter van 10 mm en een hoogte van 3 mm en bewaar ze voor 60 sec bij omgevingsdruk en 3 minuten bij 180 bar . Daarna koelen van de mengsels bij kamertemperatuur voeren bij een druk van 180 bar.
- Assemblage van drie-lagen via persvormen
- Bereid een enkele laag op dezelfde wijze als in (1.5) beschreven, maar met verschillende vormen, bijvoorbeeld met een diameter van 10 mm en een hoogte van 1 mm. Tenslotte krijgen 6 schijven met een diameter van 10 mm en een hoogte van 1 mm, met zes verschillende deeltjesgroottes: M 500, M 300, M 100,
- for assembleren drielaagse scaffold A (TLS A), stapelen M 500, M 300 en M 100 in de cilindrische vorm en compressie-vormen ze in een laboratoriumpers werkend bij 210 ° C gedurende 60 sec bij omgevingsdruk en 3 minuten bij 180 bar en vervolgens gekoeld tot kamertemperatuur voeren bij een druk van 180 bar.
NB: Bereid de TSL B door stapelen op elkaar M 90, M 45 en M 10 in dezelfde mallen en leidt de compressie vormbewerking door dezelfde werkwijze als die toegepast voor TLS A.
- Verwijder de schijven uit de cilindrische vormen en zet ze in een kokend gedemineraliseerd water bad, zonder te roeren. 3 uur na, verwijder de resulterende poreuze structuren uit het bad en laat ze drogen gedurende 12 uur bij kamertemperatuur in een chemische kap.
2. morfologische analyse
- Evalueer de morfologie van de steigers door scanning elektronenmicroscopie.
- Breek de monsters onder vloeibare stikstof en bevestig demonsters op een aluminium stub via een klevende tape koolstof. Tot slot, sputteren bekl met goud voor 90 s onder argon atmosfeer voor de beeldvorming om elektrostatische ontlading tijdens de test te vermijden.
3. Steiger Pore Size
- Uitwerking van de verkregen beelden met SEM analyse met beeldverwerkingssoftware kunnen de porie- grootteverdeling van de steiger herkennen.
LET OP: In dit werk de poriegrootteverdeling analyse werd uitgevoerd met behulp van een MATLAB-gebaseerde software eerder beschreven 33
4. porositeit
- Weeg de monsters voor uitlogen en de theoretische porositeit volgens de volgende uitdrukking uit:
LET OP: M NaCl, m PEG en m PLA, zijn respectievelijk de theoretische massa van NaCl, PEG en PLA, door aan te nemen homogene blends. THij dichtheden (ρ) NaCl, PEG en PLA respectievelijk 2,16 g / cm3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3. - Weeg de monsters door uit- en drogen teneinde de schijnbare dichtheid van de monsters (ρ scaffold) beoordelen en evalueren van de echte porositeit als de reciproke van de verhouding tussen de schijnbare dichtheid van de steiger en de dichtheid van niet-poreuze PLA door middels uitdrukking (2).
Opmerking: Het drukt de verhouding tussen het lege volume van de steiger en de volledige omvang van de steiger (leeg + vol).
5. Mechanische eigenschappen
- Test de monsters onder samendrukkende modus met een trekbank uitgerust met een 1 kN belastingscel. Stel een constante reksnelheid van 1 mm min -1.
- Om de mechanische eigenschappen van de monsters in fysiologische omgeving onderzoeken, rust de dynamometer met een bad dat (PBS) (pH = 7,4) bij 37 ° C en voer de test met de zelfde opstelling als die beschreven in punt 5.1.
- Vóór elke meting in natte omgeving, genieten van de monsters met PBS in een vacuüm kolf gedurende 5 minuten om te laten PBS vullen alle poriën. Daarna kan de steigers in PBS gedurende 15 min blijven op 37 ° C om de gewenste temperatuur te bereiken.
- Bepaal het grensvlak hechtingssterkte (IAS) tussen de lagen TL A en B TL met een speciaal ontworpen grensvlak sterkte testapparatuur, verbonden met een mechanische testmachine wordt volgens een in de literatuur beschreven 32,34.
- Bevestig het schavot op het tuig en zorgen voor de juiste afstemming met load cell en de basis plaat van de machine. Bevestig het schavot monsters aluminium testen stubs met behulp van een hoge viscositeit lijm en plaats ze in de apparatuur voor het testen.
- Voor de natte toestand test, hydrateren de monsters in PBS gedurende 1 uur priof getest. Gebruik een 1 kN belastingscel, onder trekbelasting aangebracht bij een vervormingssnelheid van 1 mm min -1.
OPMERKING: Hou rekening storing kan zich voordoen bij de treksterkte van een van de lagen of door delaminatie op de raakvlakken. Evalueer de IAS als de maximale sterkte van de spanning-rek curve.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De invloed van NaCl deeltjesgrootte op de porie architectuur van de steigers werd kwalitatief en kwantitatief geëvalueerd door het onderzoeken van de morfologie van de monsters en het berekenen van de poriëngrootteverdeling door beeldanalyse respectievelijk Figuur 2a -. F toont SEM microfoto van mono-gelaagde scaffolds verkregen van zout-uitloging van materialen die verschillende NaCl deeltjesgrootte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De eerste belangrijke stap is het optimaliseren van zeven efficiency. De hoge beheersing van de NaCl deeltjesgrootte fundamenteel voorbereidende steiger met gewenste poriegrootteverdeling. Een andere belangrijke stap is het vermijden van de breuk van de dunne PLA monolagen tijdens het monster extractie uit de mal. De beeldverwerking analyse mogelijk niet representatief voor het gehele apparaat.
Tijdens trekproeven, kan het monster uit de buurt van de apparatuur scheuren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door INSTM.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Poly(melkzuur) | NatureWorks | PLA 2002D | |
| Poly(ethyleenglycol) | Sigma | 83797-1KG-F | |
| Natriumchloride | Sigma | 793566-5KG-D | |
| Fosfaatbufferoplossing | Sigma | P5368-10PAK | |
| Laboratoriummixer | Brabender | PLE 330 - Plasticorder | |
| Laboratoriumpers | Carver | ||
| Scannende elektronenmicroscopie | Phenom-world | ProX | |
| Universele testmachine | Instron | 3365 (UK) | |
| BioPuls-bad | Instron, Norwood | ||
| Zeefmachine | Endecotts | E.V.F.1. | |
| Vacuumoven | ISCO | NSV9035 | |
| Precisiebalans | Sartorius | AX224 |
Referenties
- Scaffaro, R., Morreale, M., Lo Re, G., Mantia, F. P. La Degradation of Mater-Bi®/wood flour biocomposites in active sewage sludge. Polymer Degradation and Stability. 94 (8), 1220-1229 (2009).
- Scaffaro, R., Botta, L., Passaglia, E., Oberhauser, W., Frediani, M., Di Landro, L. Comparison of different processing methods to prepare poly(lactid acid)-hydrotalcite composites. Polymer Engineering & Science. 54 (8), 1804-1810 (2014).
- Thakur, V. K., Thakur, M. K. Recent advances in graft copolymerization and applications of chitosan: A review. ACS Sustainable Chemistry and Engineering. 2 (12), 2637-2652 (2014).
- Thakur, V. K., Thakur, M. K. Recent advances in green hydrogels from lignin: A review. International Journal of Biological Macromolecules. 72, 834-847 (2015).
- Thakur, V. K., Kessler, M. R. Self-healing polymer nanocomposite materials: A review. Polymer. 69, 369-383 (2015).
- Thakur, V. K., Thakur, M. K. Recent trends in hydrogels based on psyllium polysaccharide: a review. Journal of Cleaner Production. 82, 1-15 (2014).
- Voicu, S. I., Condruz, R. M., et al. Sericin Covalent Immobilization onto Cellulose Acetate Membrane for Biomedical Applications. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 4 (3), 1765-1774 (2016).
- Scaffaro, R., Botta, L., Sanfilippo, M., Gallo, G., Palazzolo, G., Puglia, A. M. Combining in the melt physical and biological properties of poly(caprolactone) and chlorhexidine to obtain antimicrobial surgical monofilaments. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (1), 99-109 (2013).
- Scaffaro, R., Maio, A., et al. Synthesis and self-assembly of a PEGylated-graphene aerogel. Composites Science and Technology. 128, 193-200 (2016).
- Scaffaro, R., Botta, L., Gallo, G., Puglia, A. M. Influence of Drawing on the Antimicrobial and Physical Properties of Chlorhexidine-Compounded Poly(caprolactone) Monofilaments. Macromolecular Materials and Engineering. 12 (300), 1268-1277 (2015).
- Scaffaro, R., Lopresti, F., et al. Effect of PCL/PEG-Based Membranes on Actinorhodin Production in Streptomyces coelicolor Cultivations. Macromolecular bioscience. 16 (5), 686-693 (2016).
- Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Rigogliuso, S., Ghersi, G. Melt Processed PCL/PEG Scaffold With Discrete Pore Size Gradient for Selective Cellular Infiltration. Macromolecular Materials and Engineering. 301 (2), 182-190 (2016).
- Yousefi, A. -M., Hoque, M. E., Prasad, R. G. S. V., Uth, N. Current strategies in multiphasic scaffold design for osteochondral tissue engineering: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (7), 2460-2481 (2015).
- Gillette, B. M., Rossen, N. S., et al. Engineering extracellular matrix structure in 3D multiphase tissues. Biomaterials. 32 (32), 8067-8076 (2011).
- Seidi, A., Ramalingam, M., Elloumi-Hannachi, I., Ostrovidov, S., Khademhosseini, A. Gradient biomaterials for soft-to-hard interface tissue engineering. Acta Biomaterialia. 7 (4), 1441-1451 (2011).
- Son, J. S., Kim, S. G., et al. Hydroxyapatite/polylactide biphasic combination scaffold loaded with dexamethasone for bone regeneration. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 99 (4), 638-647 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12 (6), 2344-2350 (2011).
- Zou, B., Liu, Y., Luo, X., Chen, F., Guo, X., Li, X. Electrospun fibrous scaffolds with continuous gradations in mineral contents and biological cues for manipulating cellular behaviors. Acta biomaterialia. 8 (4), 1576-1585 (2012).
- Nedjari, S., Schlatter, G., Hébraud, A. Thick electrospun honeycomb scaffolds with controlled pore size. Materials Letters. 142, 180-183 (2015).
- Yusong, P., Qianqian, S., Chengling, P., Jing, W. Prediction of mechanical properties of multilayer gradient hydroxyapatite reinforced poly(vinyl alcohol) gel biomaterial. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (5), 729-735 (2013).
- Kim, Y. B., Kim, G. Functionally graded PCL/β-TCP biocomposites in a multilayered structure for bone tissue regeneration. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 108 (4), 949-959 (2012).
- Sudarmadji, N., Tan, J. Y., Leong, K. F., Chua, C. K., Loh, Y. T. Investigation of the mechanical properties and porosity relationships in selective laser-sintered polyhedral for functionally graded scaffolds. Acta biomaterialia. 7 (2), 530-537 (2011).
- Molladavoodi, S., Gorbet, M., Medley, J., Kwon, H. J. Investigation of microstructure, mechanical properties and cellular viability of poly(L-lactic acid) tissue engineering scaffolds prepared by different thermally induced phase separation protocols. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 17, 186-197 (2013).
- Oh, S. H., Kim, T. H., Il Im, G., Lee, J. H. Investigation of pore size effect on chondrogenic differentiation of adipose stem cells using a pore size gradient scaffold. Biomacromolecules. 11 (8), 1948-1955 (2010).
- Lin, L., Gao, H., Dong, Y. Bone regeneration using a freeze-dried 3D gradient-structured scaffold incorporating OIC-A006-loaded PLGA microspheres based on β-TCP/PLGA. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (1), 3(2015).
- Yoo, D. Heterogeneous minimal surface porous scaffold design using the distance field and radial basis functions. Medical engineering & physics. 34 (5), 625-639 (2012).
- Soon, Y. -M., Shin, K. -H., Koh, Y. -H., Lee, J. -H., Choi, W. -Y., Kim, H. -E. Fabrication and compressive strength of porous hydroxyapatite scaffolds with a functionally graded core/shell structure. Journal of the European Ceramic Society. 31 (1-2), 13-18 (2011).
- Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Maio, A. Mechanical behavior of Polylactic acid/Polycaprolactone porous layered functional composites. Composites Part B: Engineering. 98, 70-77 (2016).
- Halili, A. N., Hasirci, N., Hasirci, V. A multilayer tissue engineered meniscus substitute. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 25 (4), 1195-1209 (2014).
- Bai, H., Wang, D., et al. Biomimetic gradient scaffold from ice-templating for self-seeding of cells with capillary effect. Acta Biomaterialia. 20, 113-119 (2015).
- Algul, D., Sipahi, H., Aydin, A., Kelleci, F., Ozdatli, S., Yener, F. G. Biocompatibility of biomimetic multilayered alginate-chitosan/β-TCP scaffold for osteochondral tissue. International Journal of Biological Macromolecules. 79, 363-369 (2015).
- Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Rigogliuso, S., Ghersi, G. Preparation of three-layered porous PLA/PEG scaffold relationship between morphology , mechanical behavior and cell permeability. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 54, 8-20 (2016).
- Lo Re, G., Lopresti, F., Petrucci, G., Scaffaro, R. A facile method to determine pore size distribution in porous scaffold by using image processing. Micron. 76, 37-45 (2015).
- Levingstone, T. J., Matsiko, A., Dickson, G. R., O'Brien, F. J., Gleeson, J. P. A biomimetic multi-layered collagen-based scaffold for osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1996-2004 (2014).
- Scaffaro, R., Botta, L., Maio, A., Mistretta, M. C., La Mantia, F. P. Effect of Graphene Nanoplatelets on the Physical and Antimicrobial Properties of Biopolymer-Based Nanocomposites. Materials. 9 (5), 351(2016).
- Maio, A., Fucarino, R., Khatibi, R., Rosselli, S., Bruno, M., Scaffaro, R. A novel approach to prevent graphene oxide re-aggregation during the melt compounding with polymers. Composites Science and Technology. 119, 131-137 (2015).
- Maio, A., Agnello, S., et al. A rapid and eco-friendly route to synthesize graphene-doped silica nanohybrids. Journal of Alloys and Compounds. 664, 428-438 (2015).
- Maio, A., Giallombardo, D., Scaffaro, R., Piccionello, A. P., Pibiri, I. Synthesis of a fluorinated graphene oxide-silica nanohybrid: improving oxygen affinity. RSC Advances. 6 (52), 46037-46047 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
