Methodenartikel

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor fenotypische en kwantitatieve analyse van de aldaar gevestigde macrofagen van rat nieren door middel van flowcytometrie. De resulterende gekleurde cellen kunnen ook worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals celsortering, genexpressie analyse of functionele studies, aldus verkregen in het experimentele modelinformatie verhogen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn steeds meer aanwijzingen die wijzen op de belangrijke rol van ontsteking en, daardoor, macrofagen in de ontwikkeling en progressie van nierziekten. Macrofagen zijn heterogene cellen die betrokken zijn geweest bij nierbeschadiging. Macrofagen kunnen worden ingedeeld in twee verschillende fenotypes: klassiek geactiveerde macrofagen (M1-macrofagen), die pro-inflammatoire cytokinen afgeven en fibrose bevorderen; en alternatief geactiveerde macrofagen (M2-macrofagen) die geassocieerd zijn met immunoregulerende en weefsel-remodelleringsfuncties. Deze macrofagenfenotypes moeten worden onderscheiden en geanalyseerd om hun bijdrage aan nierbeschadiging te bepalen. Er zijn echter schaarse studies die consistente fenotypische en functionele informatie rapporteren over macrofagensubtypen in inflammatoire nierziektemodellen, vooral bij ratten. Dit feit kan verband houden met de beperkte macrofagenmarkers die bij ratten worden gebruikt, in tegenstelling tot muizen. Daarom zijn nieuwe strategieën noodzakelijk om de nierinhoud van deze infiltrerende cellen op een betrouwbare manier te kwantificeren en te karakteriseren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor nierdigestie en verdere fenotypische en kwantitatieve analyse van macrofagen uit rattennieren door middel van flowcytometrie. In het kort werden nieren geïncubeerd met collagenase en totale macrofagen werden geïdentificeerd op basis van de dubbele aanwezigheid van CD45 (leukocyten gemeenschappelijk antigeen) en CD68 (PAN-macrofaagmarker) in levende cellen. Dit werd gevolgd door oppervlaktekleuring van CD86 (M1-marker) en CD163 (M2-marker). Peritoneale macrofagen van ratten werden gebruikt als positieve controle voor macrofaagmarkerdetectie door middel van flowcytometrie. Ons protocol resulteerde in een lage cellulaire mortaliteit en maakte karakterisering van verschillende intracellulaire en oppervlakte-eiwitmarkers mogelijk, waardoor het verlies van cellulaire integriteit dat in andere protocollen werd waargenomen, werd beperkt. Bovendien maakt deze procedure het gebruik van macrofagen mogelijk voor verdere technieken, waaronder celsortering en mRNA- of eiwitexpressiestudies, onder andere.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieraandoening is een wereldwijd gezondheidsprobleem, met een verhoogde prevalentie, en geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit1. Een van de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij de progressie en ontwikkeling van nierbeschadiging is ontsteking, voornamelijk veroorzaakt door macrofagen. Macrofagen spelen een cruciale rol in veel ontstekingsziekten, inclusief nierziekten2. Zo is een verhoogde aanwezigheid van infiltrerende macrofagen gemeld in biopsieën van patiënten met acute nierbeschadiging (AKI) of chronische nierziekte (CKD)3,4. Recente studies suggereren dat het langetermijnresultaat van nierziekte kan worden gecontroleerd door macrofagen5,6. In reactie op de lokale micro-omgeving kunnen macrofagen differentiëren in verschillende fenotypes die diverse biologische functies spelen7. Twee goed gedifferentieerde macrofagenfenotypes zijn vastgesteld: klassiek geactiveerde macrofagen (M1 macrofagen) en alternatief geactiveerde macrofagen (M2)8. M1 macrofagen bevorderen ontsteking, terwijl M2 macrofagen een ontstekingsremmende rol hebben en betrokken zijn bij weefselreparatie9. Daarom is een betere kennis van macrofagenheterogeniteit noodzakelijk om hun regulatie en bijdrage aan nierpathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen.

Zowel muis- als rattenmodellen zijn veel gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij nierbeschadiging te begrijpen10. Er zijn echter aanzienlijke verschillen in de verschillende markers die worden gebruikt om macrofagenfenotypes te identificeren tussen deze knaagdieren. Daarom worden verschillende muismarkers, zoals F4/80 of Ly6C, niet gebruikt bij ratten, waardoor de extrapolatie van bevindingen tussen deze soorten wordt beperkt. Bovendien is er een beperkt aantal markers dat macrofagenfenotypes bij ratten beschrijft, wat verklaart waarom er weinig studies zijn die macrofagenheterogeniteit bij deze dieren analyseren in vergelijking met muizen. Daarom zijn nieuwe strategieën voor de karakterisering van macrofagensubsets noodzakelijk om de rol van macrofagen in nierziektemodellen bij ratten te begrijpen.

Dit manuscript beschrijft een protocol voor de fenotypische en kwantitatieve analyse van macrofagen uit rattennieren door middel van flowcytometrie. Deze techniek kan verder worden gevolgd door verschillende assays, inclusief celsortering en mRNA of eiwitexpressiestudies om een diepgaande karakterisering van de rol van macrofagen bij nierziekte mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd goedgekeurd door de lokale Institutional Animal Care en gebruik commissies naar aanleiding van de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement en de National Guideline 53/2013.

1. Voorbereiding van de reagentia en oplossingen

  1. Bereid alle reagentia en oplossingen onder steriele omstandigheden en gebruiken onder een laminaire stroming kap. Een oplossing bij 4 ° C.
  2. Bereid vlekken buffer (2% foetaal runderserum (FBS) in 1 x Dulbecco's PBS).
  3. Bereid collagenase door toevoeging van 0,5 mg collagenase elk ml zoutoplossing.
  4. Bereid anesthesie oplossing van ketamine / xylazine (2: 1 v / v).

2. Nier Perfusie en Extraction

  1. Verdoven ratten door intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg gewicht). knijpen voorzichtig een kleine huidplooi, om te controleren of het dier voldoende is verdoofd. Vervolgens bedekken ogen dierenarts zalf tot droog voorkomen terwijl onder verdoving. Let op: 4-month oude Wistar ratten werden gebruikt in deze test.
  2. Zodra de rat volledig verdoofd, leg het op een chirurgische tafel in een liggende positie.
  3. Toepassen 70% ethanol aan de buik.
  4. Maak een centrale incisie door de buikhuid en het buikvlies, van het schaambeen aan de ribbenkast, aan de pleura en de buikholte bloot te leggen.
  5. Injecteer zoutoplossing (0,9%) in de abdominale aorta nieren via perfusie systeem totdat al het bloed uit de nieren wordt verwijderd perfuseren. Snijd de aorta in de buik niveau te helpen het bloed vrij te geven.
  6. Verwijder beide nieren van de rat door het snijden van de renale hilus (renale ader, slagader en urineleider). Om de nier decapsulate, drukt u op de rand van de nier met de vingers voorzichtig scheiden van de capsule 11.
  7. Plaats de nier in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing.

3. Nier Spijsvertering en Cell Suspension

  1. Snijd de helft van een nier met een schaar in kleine stukjes en zet destukjes in een 1,5 ml buis.
    Opmerking: Alle volgende concentraties worden berekend voor 1 monster (nier 1/2 rat).
  2. Voeg 1 ml van de collagenase-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Meng door inversie om de 5 minuten om ervoor te zorgen dat de collagenase oplossing toegang tot de hele weefsel.
  3. Verzamel de oplossing en doorgeven door een zeef (40 um) met behulp van een plunjer en resuspendeer in 10 ml vlekken buffer.
  4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 15 min.
  5. Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK (ammonium-chloride-Kalium) lysisbuffer. Na 1 min 30 sec bij kamertemperatuur, voeg 10 ml vlekken buffer om de reactie te stoppen.
  6. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
  7. Resuspendeer de pellet in een toereikend volume kleuring buffer (1 ml) en filtreer de celsuspensie met behulp van een zeef (30 um).
  8. Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw exclusie op een hemocytometer en voeg 2 miljoen cellen een 1,5 ml buis staining.

4. cel kleuring en Flowcytometrieanalyse

  1. Centrifugeer cellen bij 100 xg gedurende 5 minuten.
  2. Resuspendeer de pellet in 100 ul rattenserum (verdund 1: 100) gedurende 10 min bij 4 ° C aan Fc-receptoren te blokkeren.
  3. Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer 100 xg gedurende 5 minuten.
  4. Meng de antilichamen voor celoppervlak kleuring in 100 pl buffer kleuring voor elke conditie: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) en oplossingen voor levende cellen (: 1000 3) detecteren.
  5. Resuspendeer de celpellet in het antilichaam mix gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
  6. Wassen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap.
  7. Voeg 600 ul van fixatie / permeabilisatie oplossing gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
  8. Was 2 maal met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten.
  9. Voeg de CD68 FITC antilichaam (35: 1000) voor Intracellaire kleuring met 100 gl permeabilisatie / Wash buffer voor elke conditie.
  10. Resuspendeer de pellet in de CD68-antilichaamoplossing en incubeer 50 minuten bij 4 ° C in het donker.
  11. Wassen met 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 170 xg gedurende 5 minuten.
  12. Resuspendeer de pellet in 100 pl permeabilisatie / Wash buffer, voeg CD86PE antilichaam (35: 1000) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
  13. Wassen door toevoeging van 1 ml permeabilisatie / Wash buffer en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
  14. Resuspendeer de pellet in 100 ui van Permeabilisatie / Wash buffer en door te geven aan een flowcytometrie buis.
  15. Analyseer monsters door middel van flowcytometrie. Bepaal CD45 kleuring in levende cellen gated in-Side verstrooide licht / forward-verstrooid licht (/ FSC SSC) venster. In een tweede stap, analyseren CD86 en CD163 expressie in CD68 + cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We analyseerden macrofaag heterogeniteit in een experimenteel model van inflammatoire nierschade geassocieerd met verhoogde aanwezigheid van infiltrerende macrofagen in de nier. In dit model, werd nierschade geïnduceerd door toediening van aldosteron (1 mg kg -1 -1 dag) plus zout (NaCl 1%) in drinkwater gedurende 3 weken in Wistar ratten, zoals eerder vermeld 12.

Het schema van onze experimente...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen heterogene cellen die een belangrijke rol spelen in verschillende ontstekingsziekten, waaronder renale stoornissen. Er is steeds meer belangstelling voor het karakteriseren van macrofagen subsets bij nierziekte omdat elke subpopulatie macrofaag draagt op een andere manier om de ontwikkeling van nierschade, zoals in glomerulonefritis, diabetische nefropathie en nierkanker 14-16. In de vroege stadia van acute nierschade, is een overwicht van M1 macrofagen waargenomen, bevordering tubulaire necrose en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 en PI14/00883), de Spaanse Vereniging voor Atherosclerose, de Spaanse Vereniging voor Nefrologie en Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) aan Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER fondsen PI14/00386 en Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica aan Jesús Egido. Fundación Conchita Rabago aan Melania Guerrero Hue. Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) aan Alfonso Rubio Navarro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Laminar flow hoodFasterOf gelijkwaardige apparatuur
CentrifugeHettichOf gelijkwaardige apparatuur
Flow cytometer (FACSAria)BD Biosciences
Fetaal bovien serumBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
CollageenaseSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
Flow cytometry strainersBD Biosciences340626
Falcon cell strainersThermo Fisher Scientific352340
Flow cytometry tubesFalcon3520525 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubesCorning centristar430791
Water bathMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 °C
Fixatie/Permeabilisatie oplossing of Permeabilisatie/Was BufferBD Biosciences554714
Rompum (Xylazine)BayerOf gelijkwaardige
Ketalar (Ketamine)PfizerOf gelijkwaardige
Hanks’ balanced salt solutionSigma-AldrichH8264-500ML
Saline solutionBraun622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Verdund 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITCBio-RADMCA341FVerdund 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PEBiolegend200307Verdund 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RVerdund 4:100
Live/dead stain Molecular ProbesL34955Verdund 3:1,000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Macrofage fenotyperingnierdigestieCD45 CD68 kleuringCD86 CD163 markersratnieren macrofagenM1 M2 classificatieceloppervlakkleuringperitoneale macrofaagcontrolerenale ontstekingsanalyse

Gerelateerde artikelen