Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Samenvatting

Subcellulaire patch-clamp opnames bieden de mogelijkheid om de functionele eigenschappen van dendrieten te onderzoeken. Deze fijne structuren zijn echter niet gemakkelijk toegankelijk vanwege hun kleine diameter. Het hier beschreven protocol is bedoeld om het verzamelen van stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopamine neuronen in slicen in vitro te vergemakkelijken.

Samenvatting

Dendrieten van dopaminerge neuronen te ontvangen en over te brengen synaptische input, ondersteuning actiepotentiaal back-vermeerdering en neurotransmitter release. Inzicht in deze fundamentele functies zal licht werpen op de uitwisseling van informatie in deze neuronen. Dendritische patch-clamp opnamen bieden de mogelijkheid om de elektrische eigenschappen van dendrieten en de onderliggende voltage-gated ionkanalen direct te onderzoeken. Echter, deze fijne structuren zijn moeilijk toegankelijk voor patch pipetten vanwege hun kleine diameter. Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap procedure voor stabiele en betrouwbare opnames van de dendrieten van dopaminerge neuronen in acute plakjes verzamelen. Elektrofysiologische metingen worden gecombineerd met post hoc herstel van de morfologie van de cel. Succesvolle experimenten afhankelijk betere voorbereiding van segmenten, oplossingen en pipetten, adequate aanpassing van de optica en stabiliteit van de pipet in contact met de structuur opgenomen. Standard beginselen van de somatic patch-clamp-opname worden toegepast op dendrieten, maar met een zachtere aanpak van de pipet. Deze veelzijdige technieken kunnen worden toegepast op verschillende vragen over de prikkelbaar eigenschappen van dendrieten aan te pakken.

Inleiding

Neuronen ontvangen synaptische informatie voornamelijk op hun dendrieten. Prikkelende en remmende synaptische signalen verspreiden van hun plaats van generatie op de integratie plaats waar actiepotentialen (AP) worden opgeroepen als het uitgangssignaal. Onderweg wordt synaptische potentialen zowel door de structuur van dendrieten en de interactie tussen passieve en actieve membraaneigenschappen. De combinatie van deze zeer variabele parameters verbreedt de rekenkracht van neuronen ^1,2. De kleine diameter van dendrieten belemmert echter de studie van hun elektrische eigenschappen. De voortdurende ontwikkeling van de patch-clamp techniek ^3, hebben de optiek ⁴ en verfijning van methoden voor slice voorbereiding ⁵ gedurende de laatste decennia opnames nodig van heel dun (0,7-3 um Ø) dendrieten ^6,7. Deze methoden waren en zijn nog steeds voornamelijk gebruikt om de prikkelbaarheid van dendrieten onderzoeken verschillende of neuronen ^8. Direct dendritische opnamen zijn essentieel voor de distributie ^9-19 en verschillen in de functionele eigenschappen van ^20-22 ionkanalen in neuronale afzonderlijke compartimenten bepalen. Deze gegevens zijn de noodzakelijke aanvulling van ionkanaal distributies gedetecteerd met immunohistochemie gecombineerd om licht en elektronenmicroscopie ^23,24. Dual somatodendritisch opnamen zijn genomen om de verspreiding van actiepotentialen ^{9,13-15,21,22,25-27} en het verspreiden van synaptische potentials ^13,16,18 langs de somatodendritische domein van neuronen te verkennen, het verkrijgen van gedetailleerde passieve kabel modellen ^{28- 30} en onderzoek naar de temporele resolutie van neuronale integratie ^31.

De substantia nigra (SN) is een regio gelegen in het betrokken bij verschillende functies, zoals de controle van de beweging, de codering van beloning en gewone gedrag middenhersenen. De afname van dopamine als gevolg van de specifiekeverlies van dopaminerge (DA) neuronen in de SN is gekoppeld aan de motorische stoornissen waargenomen bij patiënten met de ziekte ³² van Parkinson. De nigrale circuit bestaat uit twee celtypes: dopaminerge en GABA-erge neuronen. Interessant is dat deze neuronen aantal specifieke kenmerken die hen onderscheiden van andere neuronen. Het axon van een groot deel van DA neuronen en sommige GABA neuronen afkomstig van een dendritische plaats aangeeft dat de dendritische as heterogeen (axon-dragende en axon ontbreekt dendrieten) ^25,26,33. De morfologie van deze neuronen contrast dan de typische organisatie van neuronen waarbij de informatieoverdracht volgt de wet van dynamische polarisatie uitgezonden door Cajal: vanaf dendrieten, tot soma en uiteindelijk Axon ^34. DA neuronen is ook bekend dat dopamine ontheffen van hun dendrieten ^35, genereren barsten activiteit ³⁶ en NMDA-receptor ³⁷ plasticiteit. de dissectie van deze verschijnselen is ongrijpbaar zonder direct opnamen van de plaats waar ze worden geïnitieerd. Om inzicht te krijgen in de relatie tussen de precieze locatie en functionele eigenschappen van ionkanalen en hun rol in de dendritische prikkelbaarheid en informatie-overdracht in nigrale neuronen, directe dendritische opnames zijn de methode van keuze.

Dit rapport beschrijft een gedetailleerde procedure die kan worden gebruikt voor enkele en dubbele patch-clamp van dendrieten van nigrale neuronen en de overeenkomstige post hoc biocytine labeling verkrijgen. De uitgangspunten voor het patchen van de somatische en de dendritische membraan zijn zeer vergelijkbaar. Praktisch echter opnamen van dendritische plaatsen vereisen specifieke optimalisatie in relatie tot somatische opnamen. Succesvolle dendritische opnames afhankelijk van de kwaliteit van de plakjes, optimale instelling van de optica, zwakke benadering van de patch pipet en stabiliteit van de opnames.

Protocol

Alle hier beschreven experimentele procedures te volgen institutionele en nationale richtlijnen, EU-richtlijnen voor de Bescherming van Dieren en de richtsnoeren van de Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Bereiding van de oplossingen

1. Standaard kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF; Tabel 1)
   1. Gebruik een hoge zuiverheidsgraad zouten ³⁸ en schone glazen bekers eerder gespoeld met tweemaal gedestilleerd water om een verse oplossing te bereiden. Gebruik van hoge kwaliteit dubbel-gedestilleerd water voor de voorbereiding van alle extra- en intracellulaire oplossingen.
   2. Neem een 2 L beker te _NaHCO3 lossen in 500 ml water en andere voor de andere zouten op te lossen teneinde precipitatie van tweewaardige ionen ³⁹ volgens tabel 1 voorkomen. Reinig de spatel systematisch met tweemaal gedestilleerd water en drogen alvorens een zout . Gebruik een magnetische roerder homogeniseren dissolution. Voeg de oplossingen van beide bekers tot een geschikte volumetrische kolf en brengen het juiste volume.
   3. Zorg ervoor dat de uiteindelijke extracellulaire oplossing is volledig transparant en zonder enig spoor van neerslag.
   4. Breng een gasmengsel bestaande uit 95% _O2 en 5% CO ₂ (carbogen gas) met een glazen microfilter kaars (Ø 13 mm) 20 - 30 min vóór perfuseren de plakjes ^38,40. controleren zorgvuldig de osmolariteit (2-3 opeenvolgende metingen) van de ACSF met een osmometer (optimaal bereik: 314-325 mOsmol / L). Bewaar de overblijvende oplossing na bereiding bij 4 ° C en gebruik het binnen 3 dagen.
2. Snijoplossing (sucrose-ACSF; Tabel 2) ^5,13
   1. Bereid 3 liter verse oplossing. Met 1 L tot hersenschijfjes bereiden uit één dier. Bewaar de resterende oplossing bij 4 ° C en gebruik het binnen 3 dagen.
      LET OP: Hoge Mg ²⁺ en lage Ca ²⁺ concentraties worden gebruikt om daling synaptische transmissie en de vervanging van sommige NaCl met sucrose het weefsel ^5,40 bewaren.
3. intracellulaire oplossingen
   1. Bereiden op voorhand 100 ml oplossing voor dual whole-cell opnames (tabel 3).
   2. Omvatten methylsulfaat ^13,15,21 om een goede herstel van de morfologie van de cel te krijgen. biocytine zetten (0,1-0,4%) vervolgens onderzoeken van de morfologie van het neuron. Zoals een fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, Alexa 594 of 101 Sulforhodamine ⁴¹⁾ om de uitbreiding van dendrieten tijdens de opname (optioneel) volgen.
   3. Bereid vooraf elektrode 100 ml oplossing voor cel verbonden opnamen (Tabel 4). In dit geval is de inwendige oplossing een hoge K ⁺ oplossing die de macroscopische Hyperpolarization kation (I _h) isoleren en bevat blokkers voor andere spanningsafhankelijke ionkanalen.
   4. Store intracellulaire oplossingen in 2 ml porties bij -20 ° C. Gebruik een nieuwe portie voor elke nieuwe opname sessie. Controleer de osmolariteit van elke ontdooid monster zorgvuldig af met een osmometer. Neem een ​​nieuwe hoeveelheid als de osmolariteit niet overeenkomt met de beginwaarde.
   5. Breng de oplossing van het monster in een 3 ml spuit op de bovenzijde waarvan een 0,22 urn steriel filter injectiespuit is geplaatst. Houd de spuit op het ijs tijdens de opnamesessie om afbraak van de verbindingen (ATP, GTP of phosphocreatine) te beperken.

2. Fabricage en vullen van Patch Pipette

1. trekken
   1. Gebruik een horizontale elektrode trekker en dikwandige borosilicaatglas buizen. Voor whole-cel en cel bevestigd opnamen, gebruik dan een 2 mm buitendiameter / 1 mm binnendiameter. Zorg ervoor dat de glazen buizen is absoluut schoon ^38.
   2. Indien dit niet het geval is, dompel glazen capillairen in een organisch oplosmiddel (bijvoorbeeld ethanol) En daarna in dubbel gedestilleerd water. In het kort verwarmen capillair eindes met een bunsenbrander. Als alternatief, orde glazen buizen gewassen en rechtstreeks van de fabrikant verwarmd (zie Materials lijst).
   3. Voor dubbele somatodendritische opnames voor dat de somatische pipet weerstand tussen 6 en 10 MQ ^6,11 en tussen 8 en 19 MQ voor dendritische pipetten gevuld met intracellulaire oplossing (Tabel 3). Standaardiseren pipet weerstand voor-cel bevestigd opnamen naar een weerstand van 10 MQ tot vergelijkbare resultaten langs de somatodendritische domein van het neuron ^16,18,42,43 bereiken.
   4. Bereid verse pipetten voor elke opnamesessie (elke dag) of onmiddellijk voor het patchen en gebruik ze 5-8 uur na hun fabricage ^39. Store pipetten in een overdekte glazen container om ze te beschermen tegen stof en obstructie van de tip.
2. polijsten
   1. Inspecteren en heat-polish elke pipetpunt met een microforge beter zeehonden met het membraan te verkrijgen. Voordat u de microforge Smelt een klein stukje glas op de platina verwarming gloeidraad. Vervang dit glas coating op de platina filament dagelijks standvastigheid (Peter Jonas, persoonlijke communicatie).
      LET OP: wordt gebruikt voor cel bevestigd opnames pipetten kunnen worden bekleed voor de warmte-polijsten stap om achtergrondgeluid te verminderen. Coating kan worden bereikt met een isolerende stof zoals gesmolten dentale was ^22,44 of een silicone elastomeer ^39.

3. Voorbereiding van Brain Slices

1. Gebruik gezonde Wistar ratten tussen de leeftijd van 16 - 19 dagen oud. Gebruik geen ongezonde dieren of dieren die lijden aan onderkoeling of uitdroging. Alvorens de bereiding van segmenten blijven de dieren op een veilige en stille plaats. Vermijd elk ander dier in de kamer, terwijl de voorbereiding van een dier. Manipuleren dieren voorzichtig.
2. Pour sucrose-ACSF in twee 400mL polypropyleen (PP) bekers en plaats deze in de -80 ° C vriezer gedurende 45 minuten. Meng de oplossing om een ​​homogene ijskoud vloeistof / bevroren oplossing te krijgen en zet de maatcilinders op ijs. Leveren de sucrose-ACSF oplossing carbogen gas met behulp van een microfilter kaars (Ø 13 mm) in elk PP beker.
3. Bereid de snijmachine en de reserve kamer
   1. Gebruik een hoogwaardig tissue slicer met extreem lage verticale trillingen ^5,38 tot beschadiging van de oppervlakkige lagen van segmenten zoveel mogelijk te beperken. Bevestig een frisse en hele scheermesje op de snijmachine.
   2. Gebruik een nieuw scheermesje voor elke maaibeurt. Vermijd het buigen van het scheermesje. Verwijder niet de vette film aan het oppervlak van het scheermesje (Josef Bischofberger, persoonlijke communicatie).
   3. Indien beschikbaar, controleer dan de verticale trillingen met een vibroprobe die door de fabrikant. U kunt ook gebruik maken van een op maat gemaakte vibroprobe ^5. Verminder de verticale trillingen van het blad so, zo dicht mogelijk bij 0 urn.
   4. Bereid een 150 ml reserve kamer ^45,46 voor plakjes zoals afgebeeld op p. 201 in Ref. ^39. Giet standaard ACSF in de reserve kamer en plaats deze in een waterbad. Leveren de reserve kamer oplossing carbogen gebruik van een microfilter kaars (Ø 6 mm). Zorg ervoor dat de carbogen belletjes zijn zo klein mogelijk te maken.
      LET OP: Bouw een nieuwe reserve kamer elke 2 - 3 maanden om de slice kwaliteit constant te houden.
4. Cut plakken
   1. In een stille ruimte waarin de onderzoeker niet wordt verstoord of gespannen, onthoofden het dier met chirurgische schaar (lengte 150 mm) ter hoogte van de cervicale medulla.
   2. Snijd de huid op de bovenkant van het hoofd van het dier in de neus naar caudaal met een scalpel en verwijder lateraal. Snijd de bovenkant van de schedel van de caudaal van de nasale deel van de kop met fijne schaar en verwijder beide delen van de schedel lateraal. Verwijder de bregen met een dunne spatel en zet het voorzichtig in een PP beker die ijskoude (0-4 ° C) sucrose-ACSF in evenwicht gebracht met carbogen ^38.
      Opmerking: Deze serie stappen moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, maar ook zorgvuldig (<< 1 min, ongeveer 40 s).
   3. Houd de hersenen in de oplossing van de PP beker voor ~ 2-5 min. Stel de carbogen druk om bewegingen van de hersenen voorkomen. Vervang het microfilter kaars als de carbogen belletjes te groot door een nieuwe.
   4. Plaats de hersenen op een 9 cm Petrischaal waarbij de binnenzijde van de bodem is bedekt met een 0,5 cm dikke ~ Sylgard laag ^38. Bereid deze petrischaal op voorhand.
   5. Omringen de hersenen met ijskoude sucrose-ACSF. Zorg ervoor dat sommige vloeibare fase van ACSF-sucrose-oplossing dompelt de hersenen. Voor coronale plakjes afgesneden het voorste gedeelte van de hersenen in het coronale vlak met een scalpel of een scheermesje. Verwijder de kleine hersenen met een coronale snede.
   6. Solliciteer cyaanacrylaat lijm op de specimen tray (stippellijn ~ 1 cm ^2). Plak de hersenen blok zodanig dat het voorste gedeelte wordt geconfronteerd met het snijden podium. Zorgvuldig druppelen sucrose-ACSF bovenop de geplakte hersenen via de grote opening van een glazen Pasteur pipet en vervolgens langzaam onderdompelen snijkamer van de snijmachine. Manoeuvre de specimen tray, zodat het snijvlak (dat wil zeggen, de eerste weefsel om het blad te raken) is het ventrale oppervlak van de hersenen ^40.
   7. Solliciteer carbogen met een gebogen glazen microfilter kaars (Ø 6 mm) naar de snij-kamer (optioneel).
   8. Stel het scheermesblad een hoek van ~ 15 ° met betrekking tot het horizontale vlak ^5. Snijd coronale hersenen plakjes van ~ 500 urn in de caudaal van nasale richting vóór het bereiken van de substantia nigra. Verlaag de dikte 300 snijden - 350 urn dikke plakken die het gebied van belang.
   9. Afzonderlijke segmenten van het weefsel blok met een zeer dunne perfusie naald bevestigd aaneen spuit evenwijdig aan de rand van het scheermesblad. Buig de naald teneinde een hoek van 90 ° tussen de naald en de injectiespuit hebben. Zorgen dat geen druk wordt uitgeoefend op het scheermesblad tijdens het verwijderen van het deel van het weefsel blok.
5. Store plakjes
   1. Breng de plakjes met behulp van de grootste opening van een glas Pasteur pipet (gekoppeld aan een gloeilamp) in de reserve kamer. Zodra alle segmenten zijn overgebracht naar de reserve kamer (Christoph Schmidt-Hieber, persoonlijke communicatie) breng de temperatuur van het waterbad van 34 ° C gedurende 0,5-1 uur.
   2. Na deze periode uit te schakelen het waterbad en houd de plakjes op kamertemperatuur. Stel de carbogen druk om bewegingen van de segmenten in de reserve kamer te vermijden. Houd de plakjes nog 10 tot 20 minuten voordat opnames.
   3. Maak de apparatuur en de microfilter kaarsen nog zorgvuldig grondig met tweemaal gedestilleerd water aan het einde van de slicing procedure.

4. Dual Somatische en Somatodendric Recordings in nigral Neuronen en biocytine Filing

1. Volg de beschrijvingen voor de montage van een patch-clamp setup voor plakjes gegeven in The Axon Guide en in Refs. ^39,40,47. Informatie met betrekking tot meer fundamentele aspecten van patching in Ref. ^48.
2. Bereid opname kamer
   1. Plaats 1-2 mL dubbel gedestilleerd water in de opname kamer. Controleer dat het niet lek. Plaats de opname kamer op de verschuivende xy tafel.
   2. Feed standaard ACSF door middel van een zuurstof-ondoordringbare perfusieslang systeem (polytetrafluorethyleen) naar de opname kamer. Stabiliseren van de perfusie stroming in de kamer met een snelheid van 4-5 ml min ^-1. Houd de lengte van de buis verbinden van de beker met ACSF en de opname kamer zo kort mogelijk (1 m).
   3. Selecteer een brein slice uit de reserve kamer en breng het inde opname kamer met de grootste opening van een glazen Pasteur pipet. Bedek het segment met een platina ring te verankeren aan de bodem van de opname geplaatst zoals afgebeeld op p. 201 in Ref. ^39. Gebruik een platte platina ring (Ø 1,5 cm) en lijm parallelle nylon draden (afstand> 2 mm) op.
3. Aanpassen en optimaliseren van de optica
   1. Visualiseer de plakjes met behulp van infrarood (IR) video microscopie ^4,47,49,50. Pas de Köhlerverlichting ⁵¹ en optimaliseren van differentieel interferentie contrast (DIC) ⁵¹ optiek of de schuine verlichting (Dodt Gradient contrast - DGC) ^52,53. Meer details over deze procedure worden gegeven in Refs. ^40,49.
   2. Controleer de kwaliteit van de snee. Alleen houden plakjes met gladde en zelfs oppervlakken die niet al te sterk contrast en hebben slechts kleine, verspreide kraters.
   3. Vul 2 verse en ongebruikte patch pipetten met intracellulaire oplossing ( Tabel 3). Gebruik een 0,5 ml buis met het pipet oplossing voor de punt van de pipet te vullen door capillaire werking. Aan het uiteinde vullen van pipetten zonder filament versnellen toepassing negatieve druk op het uiteinde van de pipet via slang bevestigd aan een injectiespuit.
4. Plaats de pipetten boven het oppervlak van het deel
   1. Controleer de aanwezigheid van chloride coating op de zilveren draden (bad referentie-elektrode en patch elektrode, voor meer informatie, zie De Axon Guide en Refs ^39,54.).
   2. Plaats de pipetten achtereenvolgens in de pipet houder en breng overdruk (~ 70 mbar) via een leidingsysteem verbindt de pipet houder, een driewegkraan en een manometer ^40. Laat de pipet in het bad van de opname kamer.
   3. Controleer of de drukwaarde op de manometer constant voor ~ 1-2 min. Als de druk afneemt, controleer dan de slang of de afdichtende O-ringen in de pipet houder.
   4. Plaats de pipetpunt in het midden van het beeldscherm en zodat deze niet wordt belemmerd. Zorg ervoor dat de pipetpunt niet beweegt wanneer het aanbrengen of druk vrijgeven van de pipet.
   5. Controleer op drift en trillingen van pipetpunt door het tekenen van een kruisje in het midden van het scherm precies ter plaatse van de pipetpunt en observeren 5 min mogelijke bewegingen van de tip.
   6. Toepassen van een spanning stap (5 mV) aan de pipet weerstand op een oscilloscoop controleren. Stel de holding potentieel van de patch-clamp versterker op 0 mV. Annuleren pipet offset potentieel, zodanig dat de DC pipet huidige leest nul op de versterker meter ^39,51.
   7. Verplaats de pipetten tot aan de slice en onderhouden van hen boven het oppervlak.
5. Selecteer en patch een neuron met lange dendrieten
   1. In de substantia nigra selecteer een gezonde neuron met lange dendrieten die over een grote afstand kan worden gevolgd ongeveer dezelfde plane (Figuur 1A en 1B) met behulp van IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Kies een gladde en homogene cel lichaam. Vermijd de twee sterk contrast cellen op het oppervlak van het deel (figuur 1C en 1D), omdat het moeilijk te breken en stabiele opnameomstandigheden tijd (stable serieweerstand) behouden. Selecteer neuronen die hun soma 10 hebben - 30 urn onder het stukje oppervlak.
   2. Verplaats de somatische elektrode nabij de soma (40 - 50 urn afstand) en de dendritische elektrode nabij de dendriet op dezelfde afstand. Gebruik een 2X vergroting (viervoudig wisselaar) te selecteren en te patchen een gedeelte van een dendriet. Verkrijgen op de monitor een absolute vergroting van 2,100X zonder vergroting (1X) en 5,500X met een 2x vergroting.
   3. Iets de druk van de somatische pipet vrijgeven 10 mbar. Eventueel reguleren dendritische en somatische pipet druk om verplaatsing van de c voorkomenell structuur (soma en dendrieten) binnen het segment.
   4. Plaats de dendritische pipet nabij het membraan om een ​​kleine kuiltjes zien. Laat de druk op de pipetpunt en de patch dendriet tijdens het regelen van de pipet weerstand. Onder ideale omstandigheden, slechts een zeer geringe onderdruk voldoende om een ​​goede afdichting te verkrijgen.
   5. Houd de dendritische pipet in de cel verbonden modus. Verplaats de somatische pipet dicht bij de somatische membraan en patchen van de somatische membraan. Zorg ervoor dat een hoge afdichting weerstand wordt verkregen voordat scheuren de celmembraan (> 1 GQ) ^39. Enigszins trekken beide pipetten van het membraan door een paar urn tot vervorming van het cellichaam en dendrieten voorkomen.
   6. Voor beide pipetten verminderen zoveel mogelijk de amplitude van de pipet capaciteit transiënten bovenop de huidige stap met een spanningspuls met hoge versterking en filtering weinig ⁵¹ en de oscilloscoop. Treed binnen in de whole-cell-modus wiTh de dendritische pipet en vervolgens met de somatische pipet.
   7. Elimineer de whole-cell capaciteit transiënten en compenseren serie weerstand. Op en documenteert de toegang weerstand aan het begin van en regelmatig tijdens het experiment. Als serieweerstand te hoog (> 50 MQ), proberen een andere pipet.
   8. Verzamel IR-DGC foto's (figuur 1A en 1B) met een video grafische printer ^25, een framegrabber of een digitale camera met een hoge en lage vergrotingen.
      LET OP: zwelling van neuronen tijdens de opname (figuur 1E en 1F) wordt sporadisch waargenomen, maar zelden wanneer de osmolariteit en de pH van de oplossingen is correct afgesteld ^39.
   9. Het verkrijgen van dubbele somatische whole-cell opnames (soma - soma) met dezelfde procedure (Figuur 2A).
6. Solliciteer lang (enkele honderden ms) het verhogen depolariserende huidige stappen sequentieelde somatische en dendritische pipet AP (Figuren 2B, 3C en 3D) oproepen. Het hieruit resulterende potentiaal op de dendritische en somatische pipet tegelijkertijd.
7. Onderzoek de voortplanting van kunstmatige prikkelende postsynaptische potentials (aEPSPs) in dopaminerge neuronen
   1. Een prikkelende postsynaptische stroom (EPSC) golfvorm te injecteren als een actuele opdracht tijdens dual huidige-clamp opnamen (Figuren 4A en 4B). Om dit te doen, het bouwen van een dubbele exponentiële functie met een amplitude en tijdsduur die overeenkomen met echte waarden gemeten EPSCs in het neuron van belang ^55. de controle van de sampling rates van de geconstrueerde EPSC en van de geïnjecteerde EPSC golfvorm aandachtig naar de originele tijdsverloop te behouden.
      Opmerking: Voor het aanbrengen van de golfvorm in een echte neuron, te testen met behulp van een model cel.
   2. Sequentieel injecteren de golfvorm via de dendritische ensomatische pipet en opnemen resulterende mogelijkheden voor zowel somatische en dendritische pipetten gelijktijdig. Controleer regelmatig op mogelijke drift van pipetten.
8. Het beëindigen van de opname van een neuron
   1. Neem een ​​IR-DGC beeld bij een lage vergroting (doelstelling: 5X of 10X) om de positie van de neuron in het segment en de elektroden documenteren.
   2. Langzaam en voorzichtig terug te trekken van de dendritische en somatische pipetten van de neuronale membraan achtereenvolgens om outside-out plekken met beide pipetten vormen. Verwijder de pipet met een reeks zijdelingse opwaartse bewegingen ^38. Deze moet kort op het eerste en dan geleidelijk te verhogen in lengte. Deze configuratie bevordert de opname sluiten van het celmembraan.
   3. Bewaken van de afname van capacitieve stromen (verhoging van de toegang resistentie) in reactie op een 5 mV spanningspuls in voltage-clamp onder intrekking pipet.
   4. Zodra het membraan zeeleidde rond de pipet tip, neem het volledig uit de opname kamer. Verwijder de doelstelling uit het bad. Houd het segment in de opname kamer voor 15 - 20 min in standaard ACSF equilibratie van biocytine (van de intracellulaire oplossing) in de opgenomen neuron mogelijk.
   5. Voorzichtig de slice te dragen met behulp van de grote opening van een Pasteur pipet in een 25 ml brede mond amber (bruin) glazen fles met standaard ACSF. Sluit de fles met een dop. Zie paragraaf 6 voor de fixatie stap.

5.-Cell bevestigd Recordings

1. Selecteer een neuron dendriet met een zich over een grote afstand in hetzelfde vlak. Zorg ervoor dat de dendriet van belang kan worden gevolgd om een ​​goed gedefinieerde soma.
2. Vul het patch pipet met elektrode oplossing (Tabel 4). Het ontwerp van de oplossing voor de huidige interesse in de cel bevestigd configuratie op te nemen door het opnemen van specifieke farmacologische middelen aan andere ion cha blokkerennnels.
3. Patch de dendrite in de cel bevestigd mode
   1. Visualiseer een deel van de dendriet en de aanpak van de hercoderen pipet met behulp van de manipulator. Pas de druk bij de pipetpunt door eerst de manometer (70 - 80 mbar) om verplaatsing van de dendriet voorkomen. Patch de dendrite zoals beschreven in 4.5.4.
   2. Neem sommige IR-DGC foto's (figuur 5A). Probeer een afdichting weerstand zo groot mogelijk (> 1 GQ ³⁹⁾ te verkrijgen, op zijn best tussen 3-10 GQ voor cel verbonden opnamen ¹⁸ (figuur 5B). Trek de pipet van het membraan door een paar urn tot vervorming van de dendriet voorkomen.
   3. Observeer actie stromen in de cel bevestigd mode weerspiegelt spontane actiepotentialen van nigrale neuronen. Vul het ACSF met Ca ²⁺ en Na ⁺ kanaal blokkers _(CdCl2 en TTX, respectievelijk) om actie te stromen onderdrukken.
   4. Breng een 2 svoltage stap van -90 mV van een bedrijf potentieel van 0 mV om de patch op te roepen I _h (figuur 5C). Houd in gedachten dat de pipet potentieel en de rust membraanpotentiaal zijn in serie in de cel bevestigd configuratie ^56. Voor meer informatie, zie De Axon gids en Ref. ^39.
   5. Controleer regelmatig op mogelijke drift van de pipet.
   6. Aan het einde van de opname, scheuren de patch te gaan in de hele-cel modus en onmiddellijk een uitlezing van de membraanpotentiaal. Trek de pipet, zoals beschreven in de paragrafen 4.8.2 en 4.8.3 een outside-out patch te verkrijgen.
4. Opnemen van de overeenkomstige soma in whole-cell modus
   1. Kijk langs de dendrieten en zoek de bijbehorende soma. Gebruik een hoge weerstand pipet (5-10 MQ) ^6,14,57 gevuld met een K ⁺ -gebaseerde intracellulaire oplossing (Tabel 3). Breng een korte zuigkracht (onderdruk) aan depipet tip aan het membraan scheuren indienen om in de whole-cell-modus te gaan.
   2. Controleert de identiteit van de neuron in de huidige-clamp door toepassing van lange hyper- en depolariserende huidige stappen (figuur 5D) en laat biocytine diffunderen langs dendrieten. Solliciteer korte depolariserende huidige stappen om de AP tijdsverloop te visualiseren.
   3. Na ≤10 min, trekken de pipet om een ​​outside-out patch te verkrijgen zoals beschreven in de paragrafen 4.8.2 - 4.8.3. Voorzichtig de slice te dragen met behulp van de grote opening van een Pasteur pipet in een 25 ml amberkleurige glazen fles met standaard ACSF. Sluit de fles met een dop.
   4. Alternatief eerst een somatische hele cellen met een pipet oplossing die verder een fluorescerende kleurstof te verkrijgen. Kan de diffusie van de kleurstof en selecteer een gedeelte van een dendriet ^26. Met een tweede pipet, patch de dendrite in de cel verbonden modus. Gebruik een confocale microscoop voorradig als de visualisatie van de fluorescent label verbeterened dendrite ^14,22.
   5. Voer dendritische opnames in de outside-out configuratie, als alternatief of aanvulling op de cel bevestigd opnames ^10,22. Zie een voorbeeld van een voltage-gated stromingen opgenomen vanaf een outside-out patch in figuur 5E en 5F.

6. biocytine Labeling van nigrale Neuronen

1. Fixatie van het weefsel
   1. Gebruik indien mogelijk aparte kamers voor slice opname / histochemische verwerking ^38.
   2. Bevestig de segmenten van de ACSF vervangen door 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH = 7,4) met een Pasteur pipet. Gebruik altijd vers bereide fixatief (<< 1 week oud).
      LET OP: Gebruik de juiste handschoenen en een chemische kap geplaatst in een histologie laboratorium paraformaldehyde manipuleren vanwege de toxiciteit. Lees het veiligheidsinformatieblad van deze gevaarlijke product voor gebruik en check de regelgeving inzake chemische veiligheid (Richtlijn voor gevaarlijke stoffen (67/548 / EEG) van de Europese Commissie), zoals dit poeder wordt verondersteld om kanker te veroorzaken. Andere details zijn in Ref. ^58.
   3. Leg ze bij 4 ° C overnacht. Voorkom vervuiling van de patch-clamp setup of apparatuur die wordt gebruikt voor elektrofysiologie door paraformaldehyd.
   4. Na fixatie vervangen fixeeroplossing met PBS. Gebruik een andere Pasteur pipetten voor het verwijderen van fixatief en toepassing van PBS. WINKEL segmenten in PBS bij 4 ° C voor verdere verwerking (1-2 weken). In dit geval vervangt PBS twee keer per week. Gebruik altijd vers bereide PBS (<< 1 week oud).
2. Kleuring van het weefsel
   1. Bereid een 24 goed celkweek plaat voor de kleuring stappen. Gebruik schone apparatuur om schijfjes te dragen. Spoel de schijfjes 3 x 5 min met verse PBS.
   2. Solliciteer Fluoresceïne avidine DCS (avidine D, cell sorter rang; 1 pl FLUOREScein / ml Triton X-100) en 0,3% Triton X-100 in PBS bij 4 ° C overnacht. Bescherm de schijfjes van licht gedurende de kleuring. Als alternatief voor fluorescentie, label neuronen via 3,3'-diaminobenzidine voor lichte of elektronenmicroscopische analyse ^21,58.
      LET OP: Triton X-100 is gevaarlijk. Lees veiligheidsinformatieblad en de richtlijnen van de EU van de Commissie voor het gebruik van deze stof.
   3. Spoel 3 x 30 min met PBS en vervolgens met PB (fosfaatbuffer, om de vorming van kristallen aan het oppervlak van de plak te voorkomen).
3. Monteer de plakjes op standaard glas dia's. Bestrijk de sneetjes zorgvuldig met een inbedding medium. Vermijd luchtbellen in de inbedding medium. Zet het dekglaasje voorzichtig om volledig te bedekken de slice. Air-Droog de glaasjes 's nachts voordat ze visualiseren met een microscoop.
4. Bewaar de gemerkte plakjes bij 4 ° C na zichtbaar. Nuttig tricks op histochemische procedures zijn in Refs. ^58,59.
5. Reinig de gebruikte voor histologie en elektrofysiologie afzonderlijk apparatuur. Heeft histologie en elektrofysiologie apparatuur die niet door elkaar.

7. post hoc Visualisatie van biocytine gevulde Neuronen

1. Gebruik een confocale microscoop om de morfologie van teruggewonnen neuronen te visualiseren.
   1. Ruwweg zoek de fluorescent gelabelde neuron in de slice met epifluorescentie. Onderzoek de dendritische prieel van neuronen en zoek de axon en axonale bleb (2-4 um Ø) met behulp van een 10x of 20x objectief. Noteer de loop van de axon.
   2. Overschakelen naar de confocale microscoop en selecteer de 488 nm laser diode aan de fluoresceïne in de gelabelde neuron prikkelen. Volg de verlenging van het axon en dendrieten in de z-as.
   3. Neem opeenvolgende afbeeldingen om een ​​z-stack voor de gehele cel te verkrijgen. Pas de resolutie van de z-as (afstand tussen opeenvolgende afbeeldingen) tot 0,5-1 urn. Verzamel confocale beelden van een cel using laag (10X objectief) en hoge (60X objectief, olie-immersie) vergroting.
   4. Open het beeldbestand van het neuron verkregen met de confocale microscoop met een imaging software (ImageJ) ^60. Vergelijk imago van de z-projectie met afbeelding van een IR-DGC op het oog om de precieze positie van de patch pipetten lokaliseren tijdens de elektrofysiologische opname (figuren 1, 2A, 3A, 4A, 5A en 5E).
   5. Bepaal morphometries van gelabelde neuronen: het meten van de axon - soma afstand, afstanden tussen opname pipetten langs de somatodendritische domein en tussen de dendritische pipet en axon met behulp van de "Measure" -functie in ImageJ.
   6. Reconstrueren sommige neuronen met NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ of Neuromantic ^61.

8. Analyse van de elektrofysiologische gegevens

1. Met het softwarepakket gekoppeld aan de versterker om de gegevens (bijv Clampfit) of rechtstreeks een grove analyseandere software voor data-analyse, zoals Stimfit, een open source software ^62,63 als in onze recente publicatie ¹³ of bijvoorbeeld WinWCP.

Resultaten

De hierboven beschreven protocol is van plan om het verzamelen van gegevens met behulp van dendritische patch-clamp opnames te vergemakkelijken. Deze techniek, gecombineerd met een post hoc histochemie, helpt om inzicht te krijgen in de mechanismen van de vele elektrische signalen uit of zich naar dendrieten. Directe toegang tot dendrieten met patch pipetten is moeilijk, maar speciale aandacht voor een aantal methodologische aspecten zal het slagingspercentage van de opnames te verbeteren. Een onderzoeker voldoende ervaring in stabiele somatische opname kunnen verwachten dat een hoge weerstand (GQ) zegels en complete experimenten te verkrijgen over de meeste pogingen. Een tot twee hoogwaardige dendritische opnames kunnen worden verzameld per dissectie.

De beschikbaarheid van hoogwaardige hersencoupes met gezond somata en dendrieten is vereist bij onderstaande structuren (Figuur 1). de -criteriaeen voor het selecteren van deze neuronen zijn een glad en homogeen oppervlak over de hele cel en een soma en dendrieten met weinig contrast wanneer waargenomen met optimale aangepast optiek (Figuur 1A en 1B). Het selecteren van neuronen te sterk algemeen contrast leidt tot onstabiele opnames (figuur 1C en 1C). Dus deze neuronen worden vermeden.

In vergelijking met andere neuronen, nigrale DA neuronen Specifieke morfologische en elektrofysiologische kenmerken. Deze functies meestal gemeten met een somatische pipet kan ook worden waargenomen in dubbele somatische (figuur 2) en somatodendritische opnamen (figuur 3). Lange hyperpolarizing huidige injecties leiden tot een membraanpotentiaal rectificatie genaamd 'sag' (Figuren 2B en 5D). Het axon oorsprong, in de meeste gevallen op een dendritische site geïdentificeerddie complementaire criteria ^13,25,26, wat aangeeft dat de dendritische compartiment deze neuronen heterogeen (Figuur 3A - 3B). Bijgevolg, de ruimte waarin de eerste AP wordt waargenomen correspondeert met het compartiment waar de axon komt (Figuur 3C - 3D) ^13,25,26. Het axon wordt doorgaans beëindigd door een axonaal bleb door een stek van de axon tijdens het snijden ^64, maar deze structuur is niet systematisch gedetecteerd.

De uitgesproken sag waargenomen in nigrale DA neuronen volgend op de activering van I _h suggereert een hoge expressie van HCN subeenheden. Om de invloed van I _h over de integratie van synaptische signalen te bepalen, werden synaptische-achtige stroom (EPSC) golfvormen gegenereerd en via de dendritische registratie-elektrode geïnjecteerd tijdens somatodendritisch dual-opnamen ⁵⁵ ( Figuur 4). De kinetiek van deze gesimuleerde EPSCs waren gebaseerd op de opkomst en verval tijd constanten van echte spontane EPSCs. Het verkregen aEPSP werd opgenomen met de somatische elektrode. Bath toepassing van de _Ih blocker ZD 7288 vergroot de duur van de aEPSP, waarin de bijdrage van _Ih het tijdsverloop van synaptische signalen (Figuur 4B). ZD 7288 afgeschaft eveneens de membraanpotentiaal rectificatie bevestigt dat de sag resultaten van de activering van I _h (Figuur 4C). De met gesimuleerde EPSPS resultaten kunnen worden gecorreleerd met experimenten met elektrisch opgewekte EPSPS ^65. De precieze verdeling van het kanaal in de somatodendritisch domein van DA neuronen in kaart werden cellen gevoegd opnamen uitgevoerd (figuur 5). Een hoge weerstand afdichting (>> 1 GQ) is een absolute noodzaak voor de cel bevestigd opnamen (Figuur 5B ). In dendrieten van de DA neuronen, ik _h activeert langzaam met lange hyperpolarizing spanning stappen en de huidige steady-state wordt bereikt na honderden ms (figuur 5C), zoals eerder aangegeven ^66. Deze waarneming geeft aan dat HCN kanalen uitgedrukt in dendrieten DA neuronen verschillende subeenheden in vergelijking met die in piramidale neuronen of andere celtypen ^10,16,66. Aangezien de verdeling van het kanaal niet-homogene zou kunnen worden in de dendritische compartiment en zoals de dendritische compartiment is zelf heterogene, de identiteit van de dendriet (axon-dragende of nonaxon dragende dendrite) wordt onthuld door het IR-beeld-DGC te vergelijken met de confocale afbeelding na biocytine kleuring (Figuur 3A en B). Herstel van celmorfologie is daarom noodzakelijk voor zowel dual somatodendritisch opnames en voor cel bevestigd opnamen via latere somatische whole-cell opnames.

Figuur 1. Het visualiseren van het Soma en proximale dendrieten van nigrale dopaminerge neuronen Met behulp van infrarood videomicroscopie. (A) IR-DGC beeld van een nigrale DA neuron die de soma en proximale dendrieten en zowel somatische en dendritische pipetten. Een dubbele somatodendritische opname werd succesvol uitgevoerd op deze gezonde neuron. Observeer de lage contrast en het gladde oppervlak hele somatodendritische domein van de cel. (B) Een ander voorbeeld van een gezonde DA neuron. (C) DA neuron met een ruwere en oneffen oppervlak en een groter contrast. Terwijl een dubbele opname is verkregen, de stabiliteit niet optimaal en de opnameduur was kort (~ 15 minuten) door een geleidelijke verhoging van de toegankelijkheid weerstand op beide pipetten. (D) Tweede voorbeeld van een DA neuron met een sterk contrast soma en proximale dendrite. In dit geval werd een sterke toename van de weerstand kort toegang waargenomen na de breuk in het whole-cell modus. Een poging om de toegang tot weerstand door negatieve druk te verlagen is mislukt. Neuronen in paneel C en D kunnen zijn beschadigd tijdens het snijden procedure en moet worden vermeden experimenten. (E) gelijktijdig dubbele somatische opname in een gezonde DA neuron aan het begin van de opname. (F) Hetzelfde neuron zoals in paneel E met een gezwollen cel lichaam na ~ 17 min. Let op de volledige afwezigheid van contrast, de bal-achtige uiterlijk van de soma en de aanwezigheid van de grote kern niet waarneembaar is bij gezonde neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Gelijktijdige Double Somatische Opnemen van een DA Neuron. (A) IR-DGC afbeelding tijdens dubbele somatische opname van een DA neuron. (B) hyperpolarizing en depolariserende 1 s lang lopende injecties (-160 tot 80 pA, verhogen 80 PA) en overeenkomstige spanning veranderingen gelijktijdig opgenomen met zowel een patch pipetten. Let op de aanwezigheid van de sag in de spanning spoor met de lange hyperpolarizing huidige stap en de grote na-hyperpolarisatie na de AP tijdens de depolariserende stroomstoot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Dual S omatodendritic Opname in een DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatic pipet is 29 micrometer. (B) Confocale z-projectie beeld van het neuron in paneel A label met avidine geconjugeerd aan fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). De neuron was gevuld met biocytine tijdens het opnemen. Het axon afkomstig van een proximaal dendriet dichtbij de soma zoals aangegeven door de pijl. (C) Gelijktijdige dual somatodendritische whole-cell voltage opname van de neuron in panel A. AP opgenomen in de soma (zwarte spanning sporen) en dendriet (rood spanning sporen) in reactie op een 1 s lang stroominjectie stap via de somatische (linker, zwarte bes sporen) en als alternatief dendritische pipet (rechts, rood huidige trace) (D) somatische en dendritische AP getoond uitgebreid tijdschaal.. Bij beide somatische of dendritische huidige injectie, de somatische AP (zwart) vooraf aan de dendritische AP (rood). De vertraging tussen AP's in deze neuron bedroeg 120 microseconden en 210 microseconden met somatische en dendritische huidige injectie, respectievelijk. vertragingenwerden gemeten bij AP halfmaximale amplitude tijdens de stijgende fase van het AP. De AP wordt eerst waargenomen in het compartiment in de buurt van waar de axon naar voren komt, wordt bevestigd eerdere opmerkingen ^25,26. In dit geval wordt de dendritische opname gemaakt van een axon-dendriet ontbreekt. Een voorbeeld van een opname van een axon-dragende dendriet is in Ref. ¹³ (in de fig. 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Voortplanting van Kunstmatige EPSPS Langs de somatodendritische As van DA neuronen. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron. De afstand tussen de dendritische en somatische pipet 45 urn. Beide patch pipetten zijn in de hele cel current-clamp opnamemodus. (B) Currentopgenomen met dendritische pipet huidige-clamp en gebruikt om de kunstmatige EPSP (boven) genereren. De stroom wordt verkregen door de injectie van een EPSC-achtige golfvorm (τ _stijging = 0,6 ms _verval τ = 3 ms; amplitude = 100 pA) via de dendritische opname pipet ^55. Aan de onderkant, gepropageerd aEPSPs opgenomen in de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het bad toepassing van het I _h blocker ZD7288 (30 micrometer; red trace). Elke spanning spoor is het gemiddelde van 40 enkele sweeps. Let op de grote toename van EPSP duur in aanwezigheid van ZD7288 met vermelding van de bijdrage van I _h naar het tijdsverloop van EPSPS. (C) Spanning sporen opgenomen van de soma onder controle omstandigheden (zwart) en na het aanbrengen van 30 uM ZD 7288 ( rood) in antwoord op een lange (30 pA, 1 s) hyperpolarizing huidige stap. Let op de afwezigheid van de membraanpotentiaal rectificatie (sag) na de blokkering van I _{h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.}

Figuur 5. Aanwezigheid van I _h in Dendrieten van DA Neuron. (A) IR-DGC beeld van een DA neuron en pipet op proximale dendriet. (B) en capacitieve lekstromen tijdens een 5 mV spanning commando in-cell bijgevoegde configuratie. De afdichting verzet 5 GQ in dit voorbeeld (C) hyperpolarisatie spanningsstap. (90 mV; top) van een membraan potentiaal van 0 mV induceerde een langzaam activerende I _h. De huidige trace werd omgekeerd en uitgerust met een enkele exponentiële functie die een tijd constante van τ = 632 ms. (D) Spanningreacties van de hele-cel opgenomen soma (panel A) tot 1 s hyper- en depolariserende stroompulsen (-160 tot 120 pA, 40 pA increment). De somatische whole-cell opname werd uitgevoerd nadat de cellen gehecht opname. Let op de afwezigheid van AP door het extracellulaire toepassing van TTX en Cd2 ⁺ spontane vuren onderdrukken in cellen gevoegd opname. Deze spanningsafhankelijke Na ⁺ en Ca ²⁺ stroom blokkers werden toegevoegd aan actie stromen onderdrukken. Panelen A - D van dezelfde neuron (E) IR-DIC beeld van een DA neuron en een dendritische pipet (F) Spanningsafhankelijke stromen door een testpuls geactiveerd om 0 mV van een 50 ms prepulse bij -120 mV.. in een outside-out patch uitgesneden uit de proximale dendrieten van het neuron in paneel E. Holding potentieel -80 mV. Let op de tijdsafhankelijke inactivatie van de huidige. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Stof	g / mol	Concentratie	voor 1 L
NaCl	58,443	125 mM	7,305 g
NaHCO3	84,007	25 mM	2.100 g
KCl	74,551	2,5 mM	0,186 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,172 g
glucose	198,17	25 mM	4,95 g
MgCl2	1 M (oplossing)	1 mM	1 mL
CaCl2	1 M (oplossing)	2 mM	2 mL
Osmolariteit: ~ 310 mOsmol / L (optimaal bereik: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4

Tabel 1: kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF).

Stof	g / mol	Concentratie	voor 1 L
NaCl	58,443	87 mM	5,084 g
NaHCO3	84,007	25 mM	2,1001 g
KCl	7,551	2,5 mM	0,18637 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,17248 g
MgCl2	1 M (oplossing)	7 mM	7 mL
glucose	198,17	10 mM	1,9817 g
sucrose	342,29	75 mM	25,672 g
CaCl2	1 M (oplossing)	0,5 mM	0,5 mL
Osmolariteit: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tabel 2: Sucrose-ACSF plakjes bereiden.

Stof	g / mol	Concentratie	voor 100 ml
KMeSO 4	150,2	120 mm	1,8024 g
KCl	74,56	20 mM	0,14912 g
MgCl2	1 M (oplossing)	2 mM	200 gl
Na 2 ATP	551.1	2 mM	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mM	0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine	255.1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0,1 mM	3,803 mg
Hepes	238,31	10 mM	0,23831 g
biocytine	1 mg / mL		0,1 g
Osmolariteit: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ingesteld met KOH

Tabel 3: Intracellulaire oplossing voor dubbele opnamen.

Stof	g / mol	Concentratie	voor 100mL
KCl	74,56	120 mm	0,8947 g
CaCl2	1 M (oplossing)	2 mM	200 gl
MgCl2	1 M (oplossing)	1 mM	100 gl
Hepes	238,31	10 mM	0,23831
TEA-Cl	165,7	20 mM	0,3314 g
4-AP	94,11	5 mM	0,04705 g
BaCl2	244,26	1 mM	0,02443 g
CdCl2	183,32	0,02 mM	0,3666 mg
TTX	1 mM	200 nM	20 gl
Osmolariteit: ~ 290 mOsmol / L aanpast met D-glucose (Ref. 16); pH = 7,4

Tabel 4: Elektrode oplossing voor cel verbonden opnamen.

Discussie

Dit rapport beschrijft een stap-voor-stap protocol dual somatodendritische whole-cell opnames en lokale dendritische opnamen voeren. Het is nuttig voor het bepalen van de invloed van ionkanalen (dwz I _h) op het tijdsverloop van postsynaptische potentialen en in kaart brengen van de verdeling van het ionkanaal _(Ih) langs de somatodendritische domein van nigrale DA neuronen, respectievelijk. Resulterende elektrofysiologische metingen worden gecombineerd om hoc histochemie plaatsen op celmorfologie herstellen. De procedure werd gebruikt om DA neuronen in de substantia nigra onderzoeken, maar kan worden gegeneraliseerd naburige nigrale GABA neuronen, ventrale tegmentale gebied DA neuronen en andere neuronen van de middenhersenen. Alle stappen kunnen ook worden gevolgd om andere ionkanalen, uitgedrukt in dendrieten van nigrale neuronen zonder belangrijke wijzigingen te onderzoeken. Bericht hoc visualisatie is met name relevant voor de neuronen met axon-dragendedendrieten, zoals nigrale neuronen ^25,26, hippocampus Oriens-Alveus interneuronen ²¹ of een CA1 piramidale neuronen ^67. Interessant, neuronen het delen van deze functie lijkt vaker voor dan algemeen wordt gedacht ⁶⁷ te zijn. Morfologische analyse toont ook de precieze positie van de elektroden en axon. De detectie van de laatste kan worden geoptimaliseerd door de etikettering van eiwitten tot expressie gebracht in de axon eerste segment (spanningsafhankelijke Na ⁺ kanalen of Ankyrin G) met behulp van immunohistochemie ^68,69.

De betrouwbaarheid van de gegevens verzameld met dendritische opnames en daaropvolgende neuronale labeling steeds afhankelijk van de kwaliteit segment. Maximale inspanningen moeten derhalve worden toegepast om de levensvatbaarheid van cellen in het weefsel te behouden. Dit wordt bereikt met zachte behandeling van gezonde dieren, kwalitatief hoogwaardige gereedschappen en reagentia, voldoende zuurstofvoorziening van het weefsel en ijskoude temperaturen gedurende de voorbereiding van de schijfjes. Stabiele opname-omstandigheden een beroep doen op de selectie van gezonde neuronen. In de hele-cel functie zou serieweerstand aanvankelijk zo laag mogelijk en constant gehouden gedurende het experiment. De stabiliteit van de opnames is verder afhankelijk van hoogwaardige manipulatoren verstoken van drift en trillingen. Deze verstoringen kunnen worden gereduceerd door het optimaliseren van de pipet stabiliteit: het controleren van de verbinding met pipet houder en headstage, beheersen die micromanipulator kabels slap vermijden plotselinge temperatuurschommelingen of podium beweging en controleren van het mechanisme van de manipulator. Voor dubbele opnamen is methylsulfaat ^13,15,21 opgenomen in de intracellulaire oplossing, maar gluconaat ^9,14,25 alternatief kan worden toegepast. Echter, de belangrijkste anion de membraanpotentiaal ^70,71 en sommige spanningsafhankelijke stroom ⁷² te wijzigen. Intracellulaire oplossing kan worden aangevuld met ATP, GTP en fosfocreatine de physiolo behoudengische functies van neuronen. Bovendien, het toevoegen van een fluorescerende kleurstof in de pipetoplossing (bijvoorbeeld Alexa 594 of Sulforhodamine 101 ⁴¹⁾ aan de dendrieten visualiseren tijdens een somatische opname kan nuttig zijn om bijvoorbeeld een drukuitoefening plaatsen (figuur 7 in Ref. ⁴¹⁾ of een elektrische stimulerende pipet. De pipet oplossing-cel aangesloten opnamen bevat een hoge concentratie K ⁺ en Na ⁺ geen grote _Ih opnemen. Opmerkelijk de concentratieverhouding Na ⁺ / K ⁺ beïnvloedt de amplitude ^10, de omkeringspotentiaal van de huidige ¹¹ en de gating van I _h ^73. Als alternatief kan ik _u ook worden opgenomen met behulp van buiten-outs ^10. In deze opname configuratie zonder dat door de intracellulaire milieu in de nabijheid van de kanalen worden verstoord. Bijgevolg verschillen in voltage-afhankelijke activering van I _{h werden vergelijkbare stromen verkregen met cellen verbonden patches en buiten-outs ^10. Zwelling van neuronen wordt soms aangetroffen in patch-clamp en ontstaat vaak door verschillende oorzaken, zoals de lage kwaliteit van het water, sterke onbalans in osmolariteit en pH tussen de intra- en extracellulaire oplossingen ³⁹ of fouten in de samenstelling van oplossingen. De kwaliteit van elektrofysiologische opnames heeft een directe invloed op de kwaliteit van de morfologie van teruggewonnen neuronen. Hoge weerstand somatische pipetten worden gebruikt voor dubbele opnamen (6-10 MQ, zoals in referentie ^6,11.) En één somatische opnamen na-cel verbonden opnamen op de verdunning van het intracellulaire milieu ¹⁴ minimaliseren. De hele cellen somatische opname na-cel aangesloten opname dus kort gehouden (<10 min). Outside-out patches van zowel de somatische en dendritische pipetten zijn essentieel voor een goede afsluiting van het cell membraan en de daaropvolgende herstel van de cel morfologie. Naast de structuur van de cel, kan de neurochemische inhoud worden bepaald voor de opgenomen neuronen ^59,74. Zo kan het intracellulaire tyrosine hydroxylase worden immunolabeled voor eenduidige identificatie van DA neuronen ^13.}

DA neuronen worden voornamelijk in de SN pars compacta, met een veel lagere dichtheid in de SN pars reticulata, waar ze worden vermengd met een groter aantal GABA neuronen ^75. Terwijl het cellichaam van DA neuronen vaak groter dan die van GABA neuronen, de visuele identificatie van deze cellen met IR-videomicroscopie onzeker en gedeeltelijk belemmerd door de dekking van de pars compacta. Om deze beperkingen te omzeilen, kan de voorselectie van DA neuronen worden vergemakkelijkt door het gebruik van transgene muizen die een fluorescente merker in een specifieke populatie van neuronen (TH ⁶⁵ of DAT voor DA neuronen, GADvoor GABA neuronen) en epifluorescentie verlichting. Alternatief kan een fluorescerende kleurstof in de oplossing van de somatische elektrode worden opgenomen om de visualisatie van dendrieten vergemakkelijken. Hogere resolutie van de fluorescerende cel wordt aangeboden door Nipkow draaiende schijf confocale ^14,22,30 of twee-foton microscopie ⁷ gecombineerd om IR-DGC ^6. Verscheidene voordelen gerelateerd aan DGC vergeleken met DIC. Ten eerste, zoals DIC prisma's niet nodig zijn, imago van de IR-DGC kan worden bedekt met een afbeelding fluorescentie ^49,52,53,76. Ten tweede kan DGC worden gecombineerd met fotostimulering en optogenetics ^77.

Een nadeel van slice voorbereiding is het behoud van de integriteit van neuronen. DA neuronen breiden hun dendrieten in de drie ruimtelijke vlakken ^78,79 en derhalve afknotting van de dendritische compartiment kan niet volledig worden vermeden in plakken ^80. De keuze van de oriëntatie van plakjes (coronale, horizontaal of parasagittale) is een trade-off. De oorsprong van de innervatie en de proefopzet moet worden geacht om de juiste oriëntatie van de plakken te selecteren.

Direct dendritische patches is de techniek om de verdeling van functionele ionkanalen kaart in de verschillende compartimenten van cellen. Daarnaast biedt deze techniek de variabiliteit in functionele eigenschappen kanalen ²⁰ bepalen. Als aanvulling van de locatie en de dichtheid van ionkanalen kan worden vastgesteld met behulp van immunohistochemie op het Licht en elektronen microscopie niveaus ^17,23. Deze benadering biedt de mogelijkheid om het kanaal dichtheid in klein kaliber structuren die niet toegankelijk zijn patch pipetten bepalen. Maar deze kanalen kan in een afzonderlijke functionele toestand ²⁴ of zelfs inactief ten opzichte van die zijn opgenomen met patch-clamp technieken. Beide technieken zijn daarom nodig om een ​​compleet beeld van de locatie en de eigenschappen van het verkrijgen vanionenkanalen in een specifieke cellulaire gebied ^17. Met de ontwikkeling van spanningsgevoelige kleurstoffen, is spanning beeldvorming gebruikt om de verspreiding van AP's en EPSPS in neuronen op meerdere locaties ⁸¹ onderzocht. Als alternatief voor dubbele patch-clamp Deze benadering kan ook worden toegepast voor dunne dendrieten die niet toegankelijk patch pipetten maar vereisen nauwkeurige kalibratie van de signaal en middeling.

Terwijl DA neuronen in de SN en ventrale tegmentale gebied op grote schaal onderzocht middels somatische opnamen in de fysiologische en pathofysiologische context, de functionele eigenschappen van de dendrieten nog zwaar in beide gevallen. Patchen van dendrieten is geïmplementeerd voor nigrale dopamine neuronen door verschillende groepen met succes ^13,25,26 en blijft de methode bij uitstek om prikkelbaar eigenschappen van deze fijne subcellulaire structuren ⁸ ontleden. Dendritische opnames zorgen voor een verdere MOGELIJKHEDEschap om de efficiëntie en de plasticiteit van synaptische transmissie en de plasticiteit van dendritische prikkelbaarheid ^82,83 onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Double-distillated water	Millipore	Super Q	Resistivity >14 MΩ cm, ideaal 18,2 MΩ cm bij 25 °C, gefilterd (0,22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/nl/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilterkaarsen	Robu	Porositeit 3, 6 mm of 13 mm diameter
Weefselsnijder met vibroprobe	Leica	VT1200	snijparameters: snelheid 0,07, amplitude 1,40
Weefselsnijder	Dosaka	DTK-1000	snijparameters: snelheid 4, frequentie 7
Vleesmesjes	Gilette	Super Silver
Dissectie-instrumenten	Braun, Aesculap
Reservekamer			Op maat gemaakt
PP bekers	VWR	213-1725	400 ml
Spuitfilter	Merk Millipore	Millex - GV 0,22 µm
Cyanoacrylaatlijm	UHU	"Sekunden Kleber"	vloeibare lijm
Opnamekamer	Luigs & Neumann	Slice mini kamer
Horizontaal pipettrekker	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipetten	Hilgenberg	1807524	2 mm buitendiameter/1 mm binnendiameter glazen capillaire buisjes, uiteinden gebrand en gepolijst, gewassen
Tandartswas	Coltène/Whaledent		orthodontische schaal wax strips
Platinum rooster			om plakjes in de opnamekamer te verankeren, op maat gemaakt met een platina schijf
Microforge	Narishige	MF-830	om pipetpunten te branden en te polijsten
Kaliummethylsulfaat	MP Biomedicals	215481
Biocytine	Molecular probes	B1592
Manometer	GREISINGER electronic	GDH 13 AN
Microscoop	Zeiss	FS
Dodt Gradient Contrast	Luigs & Neumann
Manipulators	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Frame grabber	The Imaging Source	DFG/USB2pro
Camera	DAGE-MTI	NC-70
Condensor	Zeiss		condensor met hoge numerieke apertuur werkend met olie
Objectief	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63X vergroting, lange afstand, hoog numeriek objectief met een apertuur van 1,0 water-immersie
Viervoudige wissel	Luigs & Neumann		tussen de camera en de microscoop
Zwart & witte videomonitor	Sony	SSM-175CE	16-inch, 850 TV-lijnen, analoog
Monsterflessen, Amberglas, met Dop	VWR	215-2409	om plakjes over te brengen van de setup naar de histologiekamer
The Axon Guide	Molecular Devices		Boek
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Analyse van elektrofysiologische data
Paraformaldehyde	Sigma	441244	zie VEUILIJKHEIDSDATABLAD en Richtlijn Gevaarlijke Stoffen (EU) voor gebruik
Welpencel kweekplaat	Greiner-Bio-One	662160	voor het kleuren van vaste plakjes
Triton X-100	Merk	108643	zie VEUILIJKHEIDSDATABLAD en Richtlijn Gevaarlijke Stoffen (EU) voor gebruik
muis anti-TH monoklonaal primair	Immunostar	22941	werkconcentratie: 1/1.000
geit anti-muis secundair antilichaam - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	werkconcentratie: 1/500
Normaal geitenserum	Dako	X0907
ProLong Diamond Antifade	Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluoresceïne Avidine DCS	Vector Lab	A-2011
Confocale microscoop	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin voor ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		Reconstructie van biocytine gevulde neuronen
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Reconstructie van biocytine gevulde neuronen
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Analyse van elektrofysiologische data