Methodenartikel

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

DOI:

10.3791/54604

⸱

18 november 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de introductie van cellen Praktische kenmerken gevolgd door de directe afgifte van cellen om deze functies in een hydrogel bioink een geautomatiseerd robot doseersysteem. De specifieke bioink werd gekozen omdat het cellen mogelijk maakt sediment richting en zin de functies. Het doseersysteem bioprints levensvatbare cellen in hydrogel bioinks met behulp van een tegendruk bijgestaan ​​printkop. Echter, door het vervangen van de printkop met een scherpe pen of scalpel, het doseersysteem kan ook worden gebruikt om topografische signalen door bovengrondse etsen maken. De beweging stylus kan worden geprogrammeerd in stappen van 10 urn in de X, Y en Z richting. De gevormde groeven konden mesenchymale stamcellen oriënteren, beïnvloeden ze een langwerpige morfologie uitgelijnd vast met de richting van de groeven. Het patroon kan worden gemaakt met behulp plotsoftware in rechte lijnen, concentrische cirkels, en sinusgolven. In een volgende procedure, fibroontploffing en mesenchymale stamcellen werden gesuspendeerd in een 2% gelatine bioink voor bioprinting een tegendruk gedreven extrusie printkop. De cel dragende bioink werd vervolgens bedrukt met dezelfde geprogrammeerde coördinaten gebruikt voor het etsen. De bioprinted cellen konden detecteren en reageren op de geëtste eigenschappen zoals blijkt uit hun gerekte orientatie langs de richting van de geëtste groeven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het opzettelijk patroonvorming van cel plaatsing maakt de vorming van culturen die na te bootsen in vivo cellulaire organisatie 1. Inderdaad, kan het onderzoek naar de interactie tussen verschillende celtypen worden bijgestaan door het organiseren van hun ruimtelijke plaatsing 2,3. De meeste systemen patronen afhankelijk oppervlaktemodificatie procedures voor het bevorderen of het voorkomen van celhechting aan latere passieve cel depositie. Bioprinting biedt ruimtelijke en temporele controle over de cel distributies 1. Naast deze functies is bioprinting beschreven als een technisch eenvoudige, snelle en kosteneffectieve werkwijze voor het complexe geometrische scaffolds 4. Het maakt gebruik van computer design software en maakt de introductie van cellen in het fabricageproces 4.

Bioprinting systemen zijn gecategoriseerd op basis van hun werkingsprincipes als laser gebaseerde, inkjet gebaseerde of extrusie-gebaseerde 4. Extrusie bioprinting is beschreven als het meest veelbelovend als het laat de fabricage van de georganiseerde constructies van klinisch relevante maten binnen een realistische termijn 4-6. Zij worden uitgevoerd door zowel mechanisch als tegendruk bijgestaan ​​extrusie van een cel die hydrogel bioink. In de hier gepresenteerde methode werd tegendruk toegepast. Zoals gezegd, worden de cellen geleverd in een cytocompatible bioink. Dergelijke bioink moet het versterken van cellen ondersteunen zonder dat schadelijke afschuifspanning en zijn van voldoende viscositeit om de integriteit van de gedrukte sporen behouden zonder instorten of verspreider (aangeduid als "inkt bleed") 7-10.

De interactie van cellen met het oppervlak dat bedekt is bekend dat cellulaire beïnvloeden. Het oppervlak topografie kan de vorm cel oriëntatie 11, en ook het fenotype regelen. In het bijzonder zijn de fabricage van groeven en kanalen aangetoond dat inducereneen verlengde langwerpige morfologie op meerdere celtypen. De goedkeuring van deze morfologie is gevonden om het fenotype van multipotente en pluripotente cellen te beïnvloeden. Bijvoorbeeld, wanneer uitgelijnd op goten, mesenchymale stamcellen (MSC) er aanwijzingen differentiatie richting cardiomyocyten 12,13 en vasculaire gladde spiercellen nemen het contractiele fenotype via synthetische 10,14-17.

De cel uitlijnen kanalen of groeven kunnen worden geproduceerd op een polymeeroppervlak via een aantal methoden, bijvoorbeeld diep reactief ionen etsen, electron beam lithografie, direct printen, femtosecondlaser, fotolithografie en droog etsen plasma 18. Deze benaderingen zijn vaak tijdrovend, vereist ingewikkelde apparatuur en kunnen beperkend in de vorm van het gegenereerde patroon. Bovendien hebben ze geen patronen met bioprinting synchroniseren en houden geen rekening met onmiddellijke cellularization. De coordinately gecontroleerde beweging van een geautomatiseerdeafgiftesysteem kunnen complexe patronen volgen voor de depositie van oplossingen. Hier laten we zien hoe de microschaal gecontroleerde beweging kan worden benut om kanalen voor mobiele oriëntatie te creëren. Een scherpe pen of scalpel wordt in plaats van extrusie spuit de printkop bevestigd en materiaal kan vervolgens etsen polymeeroppervlak onder leiding van de plotsoftware. De werkwijze biedt veelzijdigheid patroonontwerp, geldt voor polymere materialen gewoonlijk in bioengineering zoals polystyreen, PTFE en polycaprolacton. Als een volgende stap het etsen, kunnen de cellen direct worden bioprinted de groeven bekrast. De gelatine bioink hier gebruikt was in staat om zowel handhaven van de sporen en laat de afgezette cellen om de geëtste kenmerken voelen. Mesenchymale stamcellen bioprinted op de geëtste groeven werden aangetoond langwerpige daarlangs in duidelijke lijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van een tegendruk robot geassisteerde doseersysteem (figuur 1A) als een oppervlak etsen (Figuur 1B) en extrusie-gebaseerde bioprinter (figuur 1C) 10.

1. Wijziging van een polystyreen Surface

  1. Met 1 mm polystyreen platen aangezien polystyreen weefselkweekplaten doorgaans naar boven buigen in het midden, tast de hoogte consistentie van zowel etsen en afdrukken.
    LET OP: Als het polystyreen platen niet worden aangepast voor celadhesie, wordt plasma behandeling uitgevoerd.
  2. Zuurstofplasma behandeling.
    1. Selecteer eerst een druk van 2 bar op de regelaar van de zuurstoffles verbonden met het plasma machine. Schakel vervolgens de plasma machine en voer de volgende voorwaarden het bedieningspaneel van het apparaat: 150 W, 30 SSCM zuurstof, 10 min (om de macht, de gasstroom en tijd respectievelijk).
    2. Plaats de polystyreen Substrate in het plasma kamer, sluit de deur en druk op de startknop op het bedieningspaneel. Week de zuurstofplasma behandeld polystyreen substraat in foetaal runderserum en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur voor driemaal wassen 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

2. Programmeren Print Patterns

  1. Gebruik het programma om First Etch het oppervlak met een stylus of Scalpel.
    1. Bij gebruik van een stylus, plaatst een 1,5 mm diameter textiel naald (van binnen met zorg) in het mondstuk van een afgifte injectiespuit (hetzij 5 of 10 ml) totdat het wordt ingeklemd en bevestigd. Bij gebruik van een scalpel, kies dan een ronde behandeld scalpel, zodat deze in de klem mechanisme van de drukkerij arm kan worden bevestigd.
      NB: De stylus etst gebogen patronen beter dan de scalpel.
    2. Bij de eerste poging om een ​​bioprinted arrangement te maken, schetsen het gewenste patroon op ruitjespapier met genummerde assen voor het genereren van de XY coördinaten. Dan, input coördinaten geëtst / bioprinted patroon in het spreadsheet software (figuur 2).
      OPMERKING: De "gewenste patroon" kan in vele vormen zoals lineaire, S-vormig of cirkelvormig. De keuze is afhankelijk van het experimentele model vereist, zoals parallelle lijnen lineair voor de differentiatie van MSCs tot cardiomyocyten als hier getoond. De scatter grafiek functie kan de visualisatie van de voorgestelde plot patroon.
    3. Open de afdruk / doseren software. Selecteer "Programma> Programma toevoegen", gevolgd door "Edit> Add Point" voor het opzetten van het programma. Exporteer de x- en y-coördinaat waarden die zijn verkregen uit het werkblad in de afdruk / afgeven van software met behulp van de "Kopiëren en plakken" functie.
    4. Kalibreer de "z" hoogte van de robot voor elke run om de stylus / printen mondstuk te plaatsen op het oppervlak.
      1. In de print / doseren software, selecteer de optie "Robot", klik op "Veranderen van Mode &# 34; en activeer de optie "Teaching mode". Eenmaal geselecteerd, de software kan de functie "Jog" van de robot.
      2. Om te joggen, eerst initialiseren de robot naar zijn standaard positie door het selecteren van de volgende opdrachten in de menubalk; "Robot> Meca Initialize", selecteer vervolgens "Robot> Jog". Voer de numerieke waarden (in mm) in de "X en Y slots" vereist om de naald precies te plaatsen op de oorsprong van het patroon.
      3. Vervolgens invoeren van een numerieke waarde (in mm) in de "Z houder" de stylus of afdrukken spuitmond in contact te brengen met het oppervlak, maar niet buigen of inspringen oppervlak. Dit punt wordt als "Z" startwaarde.
        OPMERKING: De diepte van elke groef kan eenvoudig worden gevarieerd met de Z-hoogte van het systeem. Groeven 40, 80 en 170 urn worden gedemonstreerd in het oppervlak van 1 mm dikke polystyreen platen (figuur 4 en tabel 1) te snijden.
    5. Selecteer de print instructie voor elk van de coördinaatpunten, dwz "begin regel Dispense" naar het eerste punt en afdrukken opening definiëren, "Line Passing" naar tussenpunten aan en "End of Line Dispense" om aan te geven aan de robot de beëindiging oplage.
    6. Communiceer het programma om de robot door het selecteren van de follow commando's van de bovenste menubalk: "Robot> Verzenden C & T gegevens".
    7. Start de ets / oplage, door het veranderen van de robot om de "Run" modus. Doe dit door het selecteren van "Robot> Changing Mode> Switch Run Mode" uit de menubalk bovenaan.
    8. Start de drukkerij procedure door op de groene "start" op de robot dispenser console.

3. Voorbereiding en afdrukken van Cell-bevattende Gelatine Bioink

  1. Los 2% gelatine in Minimum Essential Medium Alpha Medium (aMEM) (aangevuld met 10% FBS en 2% antibiotica / antimycotic) bij 60 ° C gedurende 2 uur om de bioink oplossingen te bereiden.
  2. Pre-cultuur van de Red Fluorescent Protein uiten van mesenchymale stamcellen (RFP-MSC's) tot 70% samenvloeiing in 10 cm weefselkweek gerechten met aMEM / 10% FBS. Laat de aangehechte cellen tot een suspensie verwijderen van het medium en bekleding met 1x trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  3. Pellet de cellen door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml 1x PBS en tel de celdichtheid met behulp van een hemocytometer.
  4. Nadat men de bioink afkoelen tot kamertemperatuur, meng in een voldoende hoeveelheid om de suspensie van RFP-MSC's in de bioink tot een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen ml-1 te bereiken.
  5. Giet de cel lager bioink in een drukkerij spuit met de nozzle gesloten. Koel de geladen injectiespuit op 4 ° C om een ​​afdrukbare viscositeit te bereiken.
  6. Plaats de geladen spuit op de geautomatiseerderobot doseersysteem en bevestig de luchtdruk lijnen. Verwijder de spuit Luer afdichting en bevestig de afdruk mondstuk.
  7. Extrusie van de cellularized bioinks in dunne lijnen met behulp van 0,05 MPa tegendruk, op 5 mm / sec schrijfsnelheid van een 10 ml spuit via een 27 G naald / nozzle (taps toelopend aanbevolen meer dan cilindrisch) op een polystyreen film oppervlak, naar aanleiding van de voorgeprogrammeerde depositie patroon in stap 2.1 beschreven om de cellularized bioink plaatsen op de pre-geëtste groeven.
  8. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur, voeg 10 ml groeimedium (aangevuld met 10% FBS en antibiotica) en incuberen van de cellen gedurende 24 uur (om de cellen te detecteren en te reageren op de geëtste kenmerken) voor weergave onder gebruikmaking van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij 10x vergroting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De representatieve resultaten tonen aan dat de tegendruk robot geassisteerde verdeelsysteem kan worden gebruikt als een op extrusie gebaseerde bioprinter voor het uitvoeren van zowel oppervlakte- etsen en bioink drukken (Figuur 1 A). Het kan worden gebruikt voor het genereren van geëtste groeven polymeeroppervlakken, en vervolgens een cel die bioink direct afdrukken op de eigenschappen (Figuur 1 B en C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kritische stap van deze procedure is de feitelijke bioprinting levering van de stamcellen de procescel sedimentatie moet toelaten de functies afdrukken zonder bioink verspreiden / bloeden, cellen leveren zonder schuifspanning celdood en niet tot differentiatie ongewenste richting lijn.

Indien de verwachte celuitlijning uitblijft, wordt de bioink viscositeit moeten worden beoordeeld op zijn geschiktheid voor afdrukken. Het is belangrijk dat de bioink kunnen de cellen sedimenteren de patroo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerend financieel belang hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk wordt ondersteund door de Singapore National Research Foundation onder het CREATE-programma (NRF-Technion): Het Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program en door de Public Sector Funding (PSF) 2012 van de Science and Engineering Research Council (SERC) onder de Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Robotisch doseersysteemJanome2300N
PlasmamachineFemto ScienceCovance
USB-microscoop
Optisch microscoopOlympusIX71
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
SpreadsheetExcelExcel
AfdrukcoördinatensoftwareJanomeJR C-Points
BeeldverwerkingssoftwareNational Institutes of Health (NIH)ImageJ
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Stylus (mes)OLFAAK-5
5 ml drukspuitSan-ei TechSH10LL-B
30 G druknaaldSan-ei TechSH30-0.25-B
1 mm polystyreenplatenPlaatselijke aankoop
Fétaal bovien serumInvitrogen 10270-098
Fosfaat gebufferde zoutoplossingInvitrogen
Gelatine uit varkenshuid, Gel sterkte 300, Type ASigma Aldrich9000-70-8
αMEMInvitrogen41061-029
Antibiotisch antimycotischSigma AldrichA5955-100ML
Rode fluorescente eiwit mesenchymale stamcellen (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
  2. Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
  3. Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
  4. Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 123-152 (2015).
  5. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  6. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  7. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  8. Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 1-17 (2015).
  9. Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16(2015).
  10. Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
  11. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  12. Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
  13. Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
  14. Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
  15. Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
  16. Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
  17. Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089(2014).
  18. Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
  19. Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
  20. Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
  21. Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
  22. Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
  23. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  24. Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 249-270 (2015).
  25. Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 229-248 (2015).
  26. Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. , Springer International Publishing. 33-66 (2015).
  27. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  28. Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
  29. Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
  30. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  31. Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041(2014).
  32. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  33. Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
  34. Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109(2014).
  35. Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
  36. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105(2014).
  37. Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Oppervlakte etsenbioprinten van cellenhydrogel bio inktmet tegendruk ondersteundpolystyreenoppervlakzuurstofplasmabehandelingfoetaal runderserumgelatine bio inktmesenchymale stamcellen

Gerelateerde artikelen