Methodologieën voor het bestuderen B. subtilis Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Samenvatting

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Samenvatting

Dit werk beoordeelt verschillende methodologieën om de impact van kleine molecuul biofilm-remmers, zoals D-aminozuren, op de ontwikkeling en weerstand van Bacillus subtilis biofilms te bestuderen. Eerst worden methoden gepresenteerd die selecteren voor kleine molecuulremmers met biofilm-specifieke doelen om het effect van de kleine molecuulremmers op planktonische groei te scheiden van hun effect op biofilmvorming. Vervolgens richten we ons op hoe inoculatiecondities de gevoeligheid van meercellige, zwevende B. subtilis culturen voor kleine molecuulremmers beïnvloeden. De resultaten suggereren dat discrepanties in de gerapporteerde effecten van dergelijke remmers zoals D-aminozuren te wijten zijn aan inconsistente pre-cultuurcondities. Verder wordt een recent ontwikkeld protocol beschreven voor het evalueren van de bijdrage van kleine molecuulbehandelingen aan de biofilmresistentie tegen antibacteriële stoffen. Ten slotte worden scanning elektronenmicroscopie (SEM) technieken gepresenteerd om de driedimensionale ruimtelijke rangschikking van cellen en hun omringende extracellulaire matrix in een B. subtilis biofilm te analyseren. SEM geeft inzicht in de driedimensionale biofilmarchitectuur en de matrixtextuur. Een combinatie van de hier beschreven methoden kan de studie van biofilmontwikkeling in de aanwezigheid en afwezigheid van biofilmremmers aanzienlijk ondersteunen en licht werpen op het werkingsmechanisme van deze remmers.

Inleiding

Multi-cellulaire bacteriële gemeenschappen spelen een belangrijke rol in natuurlijke en anthropogene omgevingen, en kan nuttig of zeer schadelijk zijn. Deze meercellige kolonies bekend als biofilms, waarbij de afzonderlijke cellen zijn ingebed in een zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) matrix. De EPS sterk hechten de cellen aan het oppervlak ze koloniseren. Ze dienen als een schild tegen mechanische en chemische krachten en het creëren van nauw contact tussen naburige cellen, cellulaire communicatie ^{1 te} vergemakkelijken. Een biofilm kan worden gezien als een gedifferentieerd gemeenschap, waar de cellen in hoge mate gebruik gereguleerd, georkestreerd processen om hun activiteiten binnen de gemeenschap te coördineren, evenals verschillende diersoorten ^2-5. De overgang van een plankton, vrijlevende modus van de groei van een biofilm toestand wordt vaak geassocieerd met ontwikkelingsprocessen. Een goed voorbeeld is de Gram-positieve bodem bacterie Bacillus subtilis, en dus een undomesticated stam dient als een robuust model organisme om de ontwikkelingsfasen die leiden tot de vorming van biofilm te bestuderen. In deze bacterie, beweeglijke cellen zichzelf te organiseren in het oog springende meercellige structuren die gespecialiseerde taken ⁴ uit te voeren. Een groep cellen, de matrix-producenten uitscheiden exopolysaccharides ^6, het amyloïde proteïne TASA ^7,8 en de oppervlaktehydrofobiciteit eiwit BSLA ^9,10; die allemaal deelnemen aan de vergadering van de EPS ^11-13.

Gezien de overvloed van biofilms in natuurlijke en antropogene niches en de vermeende fatale schade die ze kunnen veroorzaken, is er dringend behoefte aan manieren om hun vorming te voorkomen vinden. Kleinmoleculige remmers kunnen helpen bij het ontdekken van nieuwe regulatorische ketens, enzymen en structurele eiwitten betrokken bij biofilmvorming, en daardoor inzicht in de complexe processen van meercellige Gemeenschapsopbouw promoten. Zoals B. subtilis is een goed bestudeerde model voor biofilmvorming ^14,15, kan het worden gebruikt om de effecten van verschillende biofilminhibitoren beoordelen. Deze studie behandelt vier fundamentele methoden die sleutel voor het evalueren van de respons van biofilms te klein molecuul-remmers zijn. Eerst, zodat deze remmers een biofilm-specifiek doel, de afscheiding van het effect op plankton groei en het effect op biofilmvorming kritisch. De meeste antibacteriële middelen richten op cellen in hun planktonische groeifase, maar moleculen die de biofilm levensstijl richten op zijn zeldzaam. Bovendien, zoals moleculen die geen invloed plankton groei niet toxisch, ze kunnen de selectiedruk begunstiging antibiotica resistente mutanten ¹⁶ verminderen. Wanneer bijvoorbeeld biofilms worden behandeld met D-aminozuren of bepaalde andere celwand storende moleculen, ze ofwel verstoord of gedemonteerd, maar deze inhibitoren slechts licht beïnvloeden planktonische groei ^12,17. Daarentegen veel antibiotica drastisch beïnvloeden plankton groei, aan little of geen effect op biofilmvorming ^17.

Ten tweede, de oprichting van een consistent en robuust experimenteel kader om het effect van de kleine moleculen te bestuderen is cruciaal. We zagen dat het werkzame concentratiebereik van kleine molecule inhibitoren was gevoelig voor de voorkweek omstandigheden en de experimentele opstelling gebruikt om het effect van deze kleine molecule inhibitoren bestuderen. Verschillende rapporten, met name bestuderen B. subtilis onthulde variaties in het concentratietraject waarbij D-aminozuren remmen de vorming van pellicles - de drijvende bacteriële biofilms ^12,17-19. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat de volgende factoren verantwoordelijk zijn voor verschillen in de actieve concentratiegebied: de pre-kweekomstandigheden (logaritmische ^12,17 versus late stationaire groeifase ^20), het gebruikte groeimedium in de pre-kweekomstandigheid (rijk, undefined [Luria bouillon, LB] versus gedefinieerd [mononatriumglutamaatglycerol, MSgg]), de verhouding inoculatie het bijzonder het verwijderen van de pre-kweekmedium voor enting. De temperatuur van statische huidje groei vertoonden een minder belangrijke rol in het activiteitsgebied van de kleine molecule inhibitor D-leucine, representant D-aminozuur gebruikt in deze studie.

Tenslotte, zodra de biofilms worden behandeld met specifieke biofilm remmers, robuuste en informatief zijn vereist om de effecten van deze inhibitoren op biofilm fitness karakteriseren. Hier twee methoden onafhankelijk karakteriseren van het effect van kleine molecule inhibitoren worden beschreven: (1) Het effect op individuele cellen binnen een biofilm kolonie en hun resistentie tegen antimicrobiële agentia. Cellen in biofilms algemeen beter bestand tegen antibiotica vergeleken met vrijlevende bacteriën ^21-23. Hoewel dit fenomeen multifactorieel, werd het vermogen van de EPS antibiotische penetratie beperken vaak beschouwd als een aantrekkelijke verklaring ²⁴ . Deze methode beoordeelt de overleving van vooraf vastgestelde biofilm cellen na blootstelling aan antibacteriële stoffen. (2) Het effect op de biofilm kolonie architectuur van de grote tot de kleine schaal. Biofilm kolonies worden gekenmerkt door hun driedimensionale structuur en de aanwezigheid van de EPS. Gebruik scanning elektronenmicroscopie, kunnen veranderingen in de celmorfologie, biofilm kolonie structuur en architectuur en overvloed van het EPS worden gevisualiseerd door de grote (mm) de kleine schaal (micrometer).

Protocol

1. beoordeling van het effect van kleine molecule inhibitoren op Pellicle en biofilm Colony Formation

1. Bereid een 2x oplossing van toegezegde biofilm inducerende MSgg medium ²⁵ zonder calciumchloride en ijzer (III) chloride hexahydraat. Na filter sterilisatie, voeg de calciumchloride. Het medium is direct gereed en kan bij 4 ° C worden bewaard in het donker.
2. Maak de 1x MSgg verdunning op de dag van het experiment.
   1. Verdun het 2x MSgg medium tot 1x met steriel gedestilleerd water (pellicles) of steriele 3% warm (80 ° C) agar (biofilms) en voeg ijzer (III) chloride hexahydraat tot een uiteindelijke concentratie van 50 uM (pellicles) of 250 uM ( biofilms). antibiotica of kleinmoleculige remmers toevoegen gewenste concentratie en meng goed. Bijvoorbeeld, tot een eindconcentratie van 0,5 mM D-leucine verkregen in 30 ml tot pellicles of biofilms stellen, voeg 196,6 ul van een 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucine voorraadoplossing.
      NEETE. De uiteindelijke 1x MSgg samenstelling wordt beschreven in Tabel 1 in vergelijking met het originele recept ^25, het medium bevatte 50 ug / ml threonine en de ijzerconcentratie te biofilm kolonies groeien op vaste MSgg medium werd verhoogd 2.5x de gerimpelde kolonie morfologie optimaliseren .
3. Na stollen van de agar, droog de vaste MSgg platen in een biologisch kap gedurende 30-45 minuten vóór de inoculatie.
4. Om specifieke remmers die interfereren met de mechanismen van vlies formatie (figuur 1) te selecteren, uit te sluiten dat de gebruikte concentraties van invloed plankton en statische groei.
   1. Bepaal planktonische groei (toename van de optische dichtheid in de tijd in vloeibare kweek) op eenvoudige groeicurve door de optische dichtheid bij 600 nm per uur tot de stationaire groeifase.
   2. Om te bevestigen dat de gemeten troebelheid cultuur vertegenwoordigt levende cellen telt, bepalen het aantal kolonievormende eenheden (CFU)van de cellen in het plankton groeifase van een trillende cultuur na verschillende tijdstippen.
   3. Om het effect van kleine molecule inhibitoren over statische vlies groei, oogst cellen aan het eind van een 3-daagse incubatie beoordeeld op 23 ° C van een 24-well celcultuur goed, geïnoculeerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in secties 1,7-1,9 en het bepalen van de CFU. Voor deze controle gebruik maken van een vlies-deficiënte stam die de operons die coderen voor de extracellulaire matrix componenten ontbreekt (dwz B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa).
      Opmerking: Deze stam kan groeien onder statische omstandigheden, maar in tegenstelling tot een vlies vormende wildtype, dat deficiënt is in het drijfvermogen aan het vloeistof-luchtgrensvlak, waarbij de groei wordt bevorderd door verhoogde zuurstofniveaus ^26. Zo, dit extracellulaire matrix-en vlies-deficiënte stam is een aanbevolen referentie-stam om de groei te kunnen beoordelen onder statische omstandigheden.
      OPMERKING: Voor de specifieke exvoldoende van de niet-canonieke D-aminozuur D-leucine hieronder beschreven effect op plankton en statische groei bij concentraties die beperkend vlies vorming werd uitgesloten ^12,17. De werkwijzen voor plankton en statische groei bepalen worden beschreven ^17.

Figuur 1. Conceptueel overzicht voor de identificatie van een robuuste experimentele opstelling aan de specifieke remming van de biofilmvorming Selectiecriteria voor kleine molecule remmers die specifieke interferentie met de vorming van biofilm zonder uitgesproken effect op plankton groei aangeven beoordelen.. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

5. Streak out B. subtilis uit een -80 ° C voorraad (LB culture van 10 ⁹ cellen / ml ingevroren in 20% glycerol) om enkele kolonies isoleren op een LB-1,5% agar plaat met een steriele tip of applicator stick.
6. Groei overnacht bij 30 ° C.
7. Kritische stap: Voor een robuuste vlies remming door de niet-canonieke D-aminozuren zoals D-leucine, groeien een enkele kolonie uitgekozen uit de LB-1,5% agar plaat 3 ml LB-bouillon bij 37 ° C gedurende 4 uur in een schudden incubator (schudden snelheid 200 rpm). Vervang de LB bouillon met biofilm inducerende MSgg medium vóór de inoculatie door centrifugatie 1,5 ml startercultuur gedurende 4 minuten bij 6000 xg, zorgvuldig verwijderen van het supernatant en opnieuw suspenderen van de pellet in 1,5 ml MSgg medium. De rest van de kweek kan worden weggegooid.
   Belangrijk: Om de robuustheid van het systeem te waarborgen, dient de optische dichtheid bij 600 nm (OD ₆₀₀₎ van de gewassen startercultuur tussen 0,6 en 1.
8. Tijdens de groei van de starter cultuur, bereiden een 12-well celcultuur multidish plaat met daG 3 ml MSgg medium zonder of met een concentratiebereik van de kleine molecule inhibitor (bijvoorbeeld 0,3, 0,5, 1 mM D-leucine ^17). Om uit te sluiten randeffecten, verspreiden de locatie van de verschillende concentraties over de multidish plaat. U kunt ook gebruik maken van 24-well celcultuur multidish platen met 1,5 ml MSgg medium.
9. Beënt de putjes van de 12-well celcultuur multidish plaat met 3 ul van de gewassen startercultuur (1: 1000 verdunning).
   Opmerking: Een lagere verdunningsverhouding, dwz 1: 500 kan worden gebruikt. Dit vermindert de ontwikkelingstijd van de pellicles.
10. Groeien de pellicles bij 23 ° C onder statische omstandigheden, voor drie dagen. Mis pellicles niet bewegen tijdens deze periode, omdat het uiteindelijke oppervlak morfologie van het vlies kan beïnvloeden.
11. Verwerven van foto's met een verrekijker en homogene blootstelling van de bliksem. U kunt ook een foto van de pellicles met een hoge resolutie camera. Artefacten veroorzaakt door inconsis voorkomentent licht hoeken en schaduwen, neem top-down foto's met de op een statief vaste camera en gebruik een zachte en grote lichtbron bij 45 ° van beide kanten.
    Opmerking: Een alternatieve methode B. bestuderen subtilis multicellulariteit is de biofilm kolonie assay op vaste, biofilm-inducerende MSgg medium. Net als pellicles, deze test maakt het mogelijk de studie van spatiotemporele processen. Zodra het actieve bereik van kleine molecule inhibitoren wordt bepaald, kan hun effect op biofilm kolonievorming bestudeerd.
12. Biofilm kolonies groeien, symmetrisch spot 1,5 pl van de ongewassen voorkweek (stap 1,7) op de gedroogde MSgg 1,5% agar plaat met behulp van een sjabloon - 4 druppels per petrischaal van 8,5 cm diameter. Laat de druppels adsorberen op de plaat alvorens ze te verplaatsen.
    OPMERKING: De matrijs helpt om een ​​gelijke verdeling van de biofilm kolonies in het gebied waar de cellen worden gekweekt krijgen. Om de sjabloon te bereiden, trek de totale oppervlakte van de groei in de originele weegschaal, verdeel het op gelijke sekteors en markeer het midden. Voor een ronde petrischaal van 8,5 cm diameter, dit wijst 14 ^cm2 tot een biofilm kolonie.
13. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende drie dagen. Gedurende deze tijd biofilm kolonies ontwikkelen en vormen een driedimensionale, gerimpelde structuur.
14. Maak foto's zoals in stap 1.11.

2. Ethanol Verzet Assay

1. Grow biofilms zoals beschreven in de stappen 1,1-1,7 en 1,12-1,14.
2. Na 68 uur groei bij 30 ° C, snijd de biofilm kolonies in twee gelijke delen met behulp van een scheermesje en het template.

Figuur 2. Voorbeeld proefopzet de weerstand van biofilm kolonie cellen beoordeeld in sterilisatiemiddelen. (A) Sjabloon voor de gelijkmatige verdeling van biofilm kolonies in een petrischaal en snijden. (B)Top-down beelden van onbehandeld wild-type biofilm geteeld voor 68 uur op vaste, gedefinieerde biofilm-inducerende MSgg medium bij 30 ° C. De uitbreiding laat zien hoe een biofilm kolonie in twee gelijke helften kunnen worden gesneden. (C) De twee gelijke helften biofilm gelijk worden behandeld (controle, PBS) of PBS of steriliseermiddel en verwerkt zoals beschreven. Schaal bar:. 1 cm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Til elke helft van de biofilm kolonie van de agarplaat met een kleine spatel en verplaatsen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 500 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Eventueel schrapen de resterende cellen van de plaat en overbrengen naar de microcentrifugebuis ook.
   OPMERKING: De tweede helft van de biofilm kolonie verschillend behandeld, afhankelijk van of het de bestrijding of de bestendigheid tegen steri testenLizing agenten.
4. Voor de controle, incubeer de tweede helft van de biofilm kolonie in 500 pl PBS zoals in stap 2.3. Om de weerstand te bepalen sterilisatiemiddelen, de tweede helft van de biofilm kolonie overdragen aan 500 pl 50% (v / v) ethanol.
   OPMERKING: Alternatieve sterilisatiemiddelen zoals natriumhypochloriet worden gebruikt. Voor sterilisatiemiddelen gebruikt, bepalen de actieve concentratie en incubatietijd vooraf een apart experiment.
5. Incubeer de biofilm kolonies 10 min op de bank-top bij kamertemperatuur.
6. Centrifugeer de biofilm kolonies gedurende 5 min bij 18.000 xg en verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 300 pl PBS.
7. Ultrasone trillingen de cellen mild (amplitude 10%, puls 5 sec) met de microtip van een ultrasoonapparaat.
   LET OP: De ultrasoonapparaat energie moet voldoende zijn om aparte biofilm aggregaten. Echter, soms ook weer sonicatie het lyseren. Bevestig vooraf door lichtmicroscopie dat de ultrasoonapparaat energieniet meer lyseren de cellen en alle aggregaten opgelost.
8. Voeg 700 pl PBS tot een eindvolume van 1 ml. Voer een seriële verdunning (tot 10 ^-7) in PBS en verdeel 100 ul van 3 verdunningen op een LB-1,5% agar plaat met steriele glazen kralen.
   OPMERKING: De optimale verdunningen worden uitgeplaat dient te worden bepaald in een voorafgaande proef, omdat dit afhankelijk is van de hoeveelheid cellen in de biofilm kolonie van belang en de overleving van de cellen in reactie op het sterilisatiemiddel.
9. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 30 ° C, tellen de CFU en bepaal CFU / ml. Van het uiteindelijke CFU / ml van elke helft biofilm kolonies Bereken het percentage overlevenden.
   OPMERKING: Indien uitgevoerd en geanalyseerd zoals beschreven, de twee helften van de controle biofilm kolonie en de onbehandelde versus-ethanol behandelde helft van de onbehandelde biofilm kolonie zulke verschillen dan 10% in aantal levensvatbare cellen werd verkregen, verifiëren de symmetrie of de weerstand van de kolonie , respectively. Als alternatief, kunnen de resultaten worden weergegeven in totaal CFU. De cel tellingen van de controle- en behandelde biofilm kolonie moet in dezelfde orde van grootte blijft. Daarentegen worden de celtellingen van de ethanol-behandelde helft van een kleine-molecule behandelde biofilm kolonie verwachting met ten minste twee orden van grootte te krijgen voor een verhoogde gevoeligheid voor de sterilisatiemiddel.

3. Biofilm Colony Monstervoorbereiding voor Scanning Electron Microscopy

1. Groeien biofilm kolonies zoals beschreven in de stappen 1,1-1,7 en 1,12-1,14.
2. Bereid een verse partij van 2% (v / v) glutaaraldehyde, 3% (v / v) paraformaldehyde oplossing in 100 mM natriumcacodylaat, 5 mM calciumchloride, pH 7,3. Bereid 5 ml fixeermiddel voor elke petrischaal van 8,5 cm diameter.
   LET OP: Glutaraldehyd en paraformaldehyde gevaarlijk zijn. Behandel ze met veiligheidsuitrusting in een chemische kap. Gooi de oplossingen en de verontreinigde materialen om de Hazardous afval.
3. Voeg voorzichtig het fixeermiddel om de biofilm kolonies zonder direct afgeven bovenop de biofilms.
   LET OP: Door het hydrofobe karakter van de biofilm kolonie, de koloniën langzaam los te maken van de agar en beginnen te zweven.
4. verzegelen voorzichtig de platen met een strook van Parafilm. Incubeer op een roterende schudder gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens de platen overnacht overbrengen naar 4 ° C.
5. De volgende dag, verwijder de vloeistof met een Pasteur pipet glas verbonden met een vacuümpomp.
6. voeg 10 ml 100 mM natriumcacodylaatbuffer, 5 mM calciumchloride buffer voorzichtig naar de biofilm wassen en incubeer gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de vloeistof met het Pasteur glazen pipet uit de hoek van de plaat om te voorkomen dat schade aan de biofilm en voeg verse wasoplossing door voorzichtig pipetteren. Herhaal deze stap een keer.
7. Voor het ontwateren van de biofilm koloniën, verder met de volgende stappen: 2x 5 min in DDH ₂ O; 2x 20 min in 30% ethanol; 2x 20 min in 50% ethanol; 2x 20 min in 70% ethanol; 2x 20 minuten in 96% ethanol; 2x 30 min in 100% ethanol.
   1. Voeg 15 ml van de vloeistof voor elke petrischaal van 8,5 cm diameter bij elke stap en verwijder de vloeistof zorgvuldig na elke incubatie.
8. Met twee verschillende methoden voor het drogen van de monsters uit ethanol.
   1. Voor drogen aan de lucht uit ethanol:
      1. Snijd een cellulose filterpapier (diameter van 9 cm) in kwartalen. In het kort onderdompelen een kwart in 100% ethanol, en vervolgens zorgvuldig te dragen een drijvende biofilm kolonie op het. Plaats het natte filtreerpapier in een petrischaal bekleed met een papieren filter. Dek de petrischaal en laat de biofilm koloniën droog 's nachts in een chemische kap.
   2. Voor kritisch punt (CP) -drying met behulp van kooldioxide (CO ₂₎ de overgang vloeistof:
      1. Vul 75% van het kritische punt gedroogd machinekamer met 100% ethanol. Breng de monsters in een houder, elk monster in zijn eigen cHamber. Eventueel stuurde de biofilm met een schaar in kleine stukjes. Laat de monsters ondergedompeld in ethanol gedurende alle handelingen. Vervolgens overdracht van de houder in de kamer en sluit de kamer stevig vast.
      2. Koel de kamer naar 7 ° C en start roeren. Vul de kamer volledig met vloeibare CO _2. Tijdens een 7 minuten incubatietijd, laat de ethanol mengsel met CO _2. Vervolgens ontladen 25% van de oplossing.
         NB: Mag niet de ruimte onder het niveau van het monster.
      3. Herhaal stap 3.8.2.2 vier keer.
      4. Herhaal stap 3.8.2.2 vijfmaal met een incubatietijd van slechts 5 minuten. Ten slotte moet de ethanol volledig vervangt CO _2.
      5. Tijdens de laatste ronde, lege slechts 5% van de kamer. Schakel de roeren en de koeling. Start verwarmen van de kamer naar 42 ° C. Bij een temperatuur van 31,1 ° C en een druk van 73,9 bar, de vloeibare CO ₂ zijn kritische punt, de toestand bereikt waarin het gasvormige phase heeft dezelfde dichtheid als de vloeistoffase van het oplosmiddel ^27. Wanneer de temperatuur 42 ° C bereikt, incubeer 10 min. Bij 42 ° C, de _CO2 in de kamer voorkomt als superkritisch gas.
         LET OP: Controleer voortdurend de druk van de kamer. De druk mag niet hoger zijn dan 120 bar bij 42 ° C.
      6. Start om het gas langzaam los met doorlopende verwarming. Dit houdt de bemonsteringen in het CO _2-gas fase en voorkomt de vervorming van het monster morfologie door de vloeistof oppervlaktespanning. Stel de flowmeter tot 5 l / uur door fijnafstelling doseerklep regelen van de stroommeter. Wacht tot de al de druk in de kamer wordt vrijgegeven. Open nu de kamer en verwijder voorzichtig de monsters uit de houder.
9. Coat een elektronenmicroscopie stomp met carbon tape. Met behulp van een pincet, zorgvuldig overdracht van de biofilm kolonies op de stomp. Sluit elke kolonie aan de stomp door toevoeging van een dunne brug uit autobon tape, wat cruciaal is voor lading eliminatie in de elektronenbundel. In dit stadium omgaan met de biofilm kolonies voorzichtig aangezien zij zeer kwetsbaar. Bewaar de monsters in een exsiccator gedurende ten minste 24 uur of totdat onderzoek.
10. De dag van het onderzoek met de elektronenmicroscoop, sputter-coaten van de biofilm koloniën gedurende 2 minuten in een 60 ° hoek in een goud-palladium-sputter coater. Herhaal deze stap twee keer en draai de monsters van 120 ° in tussen. Eind, sputter-coat monster eenmaal gedurende 3 min van bovenaf. De 20 nm dunne laag goud-palladium verbetert de geleidbaarheid en verhoogt het contrast van het monster voor de beeldvorming in de SEM.
11. Bewaar de monsters in een exsiccator tot de rehydratatie van het monster ²⁸ mogelijk is totdat beeldvorming met een rasterelektronenmicroscoop ^29,30.

Resultaten

Het vlies test is een methode om de sterk gereguleerd en dynamische processen te bestuderen B. subtilis multicellulariteit. Daarnaast wordt het vlies assay geschikt voor een reeks van ofwel pre-startersvoorwaarden of klein molecuul concentraties getest in een enkele celkweek multidish plaat in één experiment. Echter, B. subtilis pellicule formatie is gevoelig voor de voorkweek omstandigheden (bijvoorbeeld groeimedium van de voorkweek en groeifase), de inoculatie verhouding en het verwijderen v...

Discussie

Bacillus subtilis vormen robuust en zeer gestructureerd biofilms zowel in vloeibare (pellicles) en op vast medium (kolonies). Daarom dient het als een ideaal model organisme met het werkingsmechanisme van bepaalde biofilminhibitoren karakteriseren. Op vaste media, cellen vormen meercellige structuren met onderscheidende kenmerken die niet duidelijk in pellicles, zoals rimpels straalt van het centrum naar de rand. Zo pellicles en kolonies zijn complementair systemen om B. te studeren subtilis m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
kaliumfosfaat monobasic	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
kaliumfosfaat dibasic	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morfolino)propaansulfonzuur	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
magnesiumchloride hexahydraat	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
calciumchloride anhydrisch	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
mangaan(II)chloride tetrahydraat	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
ijzer(III)chloride hexahydraat	Sigma, 270,30 g/mo)	F2877-500G
zinkchloride anhydrisch	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
thiaminehydrochloride	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-tryptofaan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenylalanine	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-threonine	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
glycerol anhydrisch	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamine mononatriumzouten hydraat	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucine	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
ethanol anhydrisch	Gadot	830000054
mesjes	Eddison	NA
cirkelvormige cellulose filterpapieren	Whatman, 90 mm	1001-090
glutaaraldehyde	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water	16220
paraformaldehyde	EMS, 16% in water	15710
natriumcacodylaat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
calciumchloride 2-hydraat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
stub-aluminium mount	EMS, sloted head	75230
koolstofkleefband	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuge	Eppendorf table top centrifuge 5424	NA
Digital Sonifier, Model 250, gebruikt met Double Step Microtip	Branson	NA
Incubator 30 °C	Binder	NA
Incubator 23 °C	Binder	NA
Filter Systeem, 500 ml, polystyreen	Cornig Incorporated	NA
Rotor Shaker - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Spuitcoater	Edwards	NA
CPD 030 Critical Point Dryer	BAL-TEC	NA
Environmental Scanning Electron Microscope	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA