Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Summary

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Abstract

Micro-organismen produceren een breed scala aan (fosfo) lipasen die worden afgescheiden teneinde externe beschikbare substraten voor het organisme maken. Ook kunnen andere (fosfo) lipasen fysiek gekoppeld aan het producerende organisme veroorzaakt een omzet van intrinsieke lipiden en vaak aanleiding geeft tot een hermodellering van de celmembranen. Hoewel potentiaal (fosfo) lipase kan worden voorspeld met een aantal algoritmen wanneer het gen / eiwitsequentie beschikbaar, experimenteel bewijs van de enzymactiviteiten, substraatspecificiteiten en mogelijke fysiologische functies is vaak niet verkregen. Dit manuscript beschrijft de optimalisatie van testcondities voor potentiële (fosfo) lipasen met onbekende substraatspecificiteiten en hoe deze geoptimaliseerde omstandigheden te gebruiken in de zoektocht naar het natuurlijke substraat van een respectievelijke (fosfo) lipase. Met behulp van kunstmatige chromogene substraten, zoals p-nitrofenyl derivaten kunnen helpen in geringe sporenenzymatische activiteit een voorspeld (fosfo) lipase onder standaardomstandigheden. Hebben ondervonden dergelijke kleine enzymatische activiteit kunnen de verschillende parameters van een enzym assay worden gevarieerd teneinde een efficiëntere hydrolyse van het kunstmatige substraat te verkrijgen. Na de voorwaarden waaronder een enzym werkt goed hebben vastgesteld, moet een groot aantal potentiële natuurlijke substraten worden getest op hun degradatie, een proces dat gevolgd kan worden in dienst verschillende chromatografische methoden. De definitie van substraatspecificiteiten voor nieuwe enzymen, vormt vaak hypothesen voor een mogelijke fysiologische rol van deze enzymen, die vervolgens experimenteel getest worden. Door deze richtlijnen, konden we een fosfolipase C (SMc00171) die fosfatidylcholine aan fosfocholine en diacylglycerol, een cruciale stap voor de verbouwing van membranen in de bacterie Sinorhizobium meliloti upon fosfor randvoorwaarden groei degradeert identificeren. Voor twee voorspelde patatin-zoals fosfolipasen (SMc00930 en SMc01003) van hetzelfde organisme, konden we hun substraat specificiteiten opnieuw te definiëren en te verduidelijken dat SMc01003 is een diacylglycerol lipase.

Introduction

-Glycerol gebaseerde lipiden zoals triacylglycerolen en (glycero) fosfolipiden zijn belangrijke en waarschijnlijk de meest bekende lipide-klassen ^1. Triacylglycerolen (TAGs) zijn vetten en oliën, die gewoonlijk fungeren als opslag lipiden en derhalve potentiële energie en koolstofbronnen. TAGs kan worden afgebroken door lipasen die vaak worden uitgescheiden door het producerende organisme externe TAGs verteren en beschikbaar als koolstofbronnen. Ook lipasen zijn uitgebreid bestudeerd in de jaren vanwege hun belangrijke biotechnologische toepassingen ^2.

Door hun amfifiele aard en hun bijna-cilindrische vorm, (glycero)....

Protocol

1. Clone en overexpressie structureel gen voor Voorspelde lipase

1. Middels polymerasekettingreactie (PCR) ¹⁴ en specifieke oligonucleotiden (Tabel 1) ^15, vergroot het gen van belang (smc01003, smc00930 of smc00171), voorspelde te coderen voor een lipase of fosfolipase, uit het genomische DNA van het gastheerorganisme (dwz , S. meliloti).
   1. Voegen specifieke restrictieplaatsen (de ontworpen sequentie van de oligonucleotiden). Digest het geamplificeerde DNA-fragment met de overeenkomstige restrictie-enzymen en deze klonen in een expressievector zoals plasmiden van de pET....

Results

Activiteit van PC-specifieke fosfolipase C SMc00171 met Bis- p nitrofenylfosfaat

Celvrije extracten verkregen van E. coli BL21 (DE3) pLysS x, die moest smc00171 expressie werden onderzocht op hun vermogen om bis-p-nitrofenylfosfaat esters hydrolyseren, onder toepassing van een spectrofotometrische enzymatische test, meten blz -NP ge.......

Discussion

In de afgelopen 20 jaar hebben genomen van vele organismen gesequenced en hoewel een schat aan genoomsequentie gegevens zijn gegenereerd, wordt de functionele interpretatie achterstand en belemmert daardoor ons begrip van de werking van het genoom. Genfuncties in het genoom worden vaak toegewezen op basis van similariteit met genen van bekende functie of voorkomen van geconserveerde motieven. De precieze functie van een bepaald gen vaak niet bekend. Vooral voorspelde structurele genen voor enzymen kunnen gemakkelijk met.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	JT Baker	9180-03	TLC analysis & Lipid extraction
Methanol	JT Baker	9070-03	TLC analysis & Lipid extraction
Acetic Acid	JT Baker	9507-05	TLC analysis & Lipid extraction
Hexanes	JT Baker	9309-02	TLC analysis & Lipid extraction
Diethylether	Sigma	32203	Enzymatic assays
bidistilled water	ANY	NA	Enzymatic assays
Tris Base	Sigma	T-1503	Enzymatic assays
HCl	Baker	9535-02	Enzymatic assays
NaCl	Baker	3624-01	Enzymatic assays
Triton X-100	Sigma	X-100	Enzymatic assays
LB broth	ANY	NA	Bacterial growth, 10 g tryptone + 5 g yeast extract + 10 g NaCl per liter of bidistilled water
tryptone	Becton Dickinson and Company	211705	Bacterial growth
yeast extract	Becton Dickinson and Company	212750	Bacterial growth
TY broth	ANY	NA	Bacterial growth, 8 g tryptone + 3 g yeast extract + 66 mg CaCl2·2H2O per liter of bidistilled water
CaCl2·2H2O	Baker	1332-01	Enzymatic assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG)	Invitrogen	15529-019	Bacterial growth
Diethanolamine	Sigma	D-8885	Enzymatic assays
MnCl2	Sigma	221279	Enzymatic assays
Phospholipase A2 snake venom	Sigma	P0790	Enzymatic assays
Phospholipase C Clostridium perfringens	Sigma	P7633	Enzymatic assays
Bis-p-nitrophenyl phosphate	Sigma	07422AH	Enzymatic assays
p-nitrophenyl stearate	Sigma	N3627	Enzymatic assays
p-nitrophenyl dodecanoate	Sigma	61716	Enzymatic assays
p-nitrophenyl decanoate	Sigma	N0252	Enzymatic assays
p-nitrophenyl palmitate	Sigma	N2752	Enzymatic assays
p-nitrophenyl butyrate	Sigma	N9876	Enzymatic assays
p-nitrophenyl octanoate	Sigma	21742	Enzymatic assays
Acetic Acid, sodium salt [1-14C]	Perkin Elmer	NEC084	Bacterial growth
dimethylsulfoxide (DMSO)	JT Baker	9224-01	Enzymatic assays
Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets.	Merck	105547	TLC analysis & Lipid extraction
Spectrometer UV/VIS Lambda 35	Perkin Elmer	NA	Enzymatic assays
Storm 820 Phosphorimager	Molecular Dynamics	NA	Photostimulable Luminescence scanner
Multipurpose Scintillation Counter	Beckman Coulter	NA	Radioactivity Quantification
French Pressure Cell	ThermoSpectronic	NA	Breakage of cells
chromatography paper 3MM Chr	Whatman	3030917	TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021our	reference 11		studied strain
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells	Novagen	69451	protein expression strain
pET9a vector	Novagen	69431	protein expression vector
pET17b vector	Novagen	69663	protein expression vector
sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon	Becton Dickinson	352057	radiolabeling of bacterial cultures
polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Eppendorf	30125.15	Enzymatic assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol	Sigma	D9135	lipid standard
L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl	Sigma	P6267	lipid standard
DL-α-monopalmitin	Sigma	M1640	lipid standard
palmitic acid	Sigma	P0500	lipid standard