Methodenartikel

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

DOI:

10.3791/54613

⸱

23 november 2016

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micro-organismen produceren een breed scala aan (fosfo) lipasen die worden afgescheiden teneinde externe beschikbare substraten voor het organisme maken. Ook kunnen andere (fosfo) lipasen fysiek gekoppeld aan het producerende organisme veroorzaakt een omzet van intrinsieke lipiden en vaak aanleiding geeft tot een hermodellering van de celmembranen. Hoewel potentiaal (fosfo) lipase kan worden voorspeld met een aantal algoritmen wanneer het gen / eiwitsequentie beschikbaar, experimenteel bewijs van de enzymactiviteiten, substraatspecificiteiten en mogelijke fysiologische functies is vaak niet verkregen. Dit manuscript beschrijft de optimalisatie van testcondities voor potentiële (fosfo) lipasen met onbekende substraatspecificiteiten en hoe deze geoptimaliseerde omstandigheden te gebruiken in de zoektocht naar het natuurlijke substraat van een respectievelijke (fosfo) lipase. Met behulp van kunstmatige chromogene substraten, zoals p-nitrofenyl derivaten kunnen helpen in geringe sporenenzymatische activiteit een voorspeld (fosfo) lipase onder standaardomstandigheden. Hebben ondervonden dergelijke kleine enzymatische activiteit kunnen de verschillende parameters van een enzym assay worden gevarieerd teneinde een efficiëntere hydrolyse van het kunstmatige substraat te verkrijgen. Na de voorwaarden waaronder een enzym werkt goed hebben vastgesteld, moet een groot aantal potentiële natuurlijke substraten worden getest op hun degradatie, een proces dat gevolgd kan worden in dienst verschillende chromatografische methoden. De definitie van substraatspecificiteiten voor nieuwe enzymen, vormt vaak hypothesen voor een mogelijke fysiologische rol van deze enzymen, die vervolgens experimenteel getest worden. Door deze richtlijnen, konden we een fosfolipase C (SMc00171) die fosfatidylcholine aan fosfocholine en diacylglycerol, een cruciale stap voor de verbouwing van membranen in de bacterie Sinorhizobium meliloti upon fosfor randvoorwaarden groei degradeert identificeren. Voor twee voorspelde patatin-zoals fosfolipasen (SMc00930 en SMc01003) van hetzelfde organisme, konden we hun substraat specificiteiten opnieuw te definiëren en te verduidelijken dat SMc01003 is een diacylglycerol lipase.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

-Glycerol gebaseerde lipiden zoals triacylglycerolen en (glycero) fosfolipiden zijn belangrijke en waarschijnlijk de meest bekende lipide-klassen 1. Triacylglycerolen (TAGs) zijn vetten en oliën, die gewoonlijk fungeren als opslag lipiden en derhalve potentiële energie en koolstofbronnen. TAGs kan worden afgebroken door lipasen die vaak worden uitgescheiden door het producerende organisme externe TAGs verteren en beschikbaar als koolstofbronnen. Ook lipasen zijn uitgebreid bestudeerd in de jaren vanwege hun belangrijke biotechnologische toepassingen 2.

Door hun amfifiele aard en hun bijna-cilindrische vorm, (glycero)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Clone en overexpressie structureel gen voor Voorspelde lipase

  1. Middels polymerasekettingreactie (PCR) 14 en specifieke oligonucleotiden (Tabel 1) 15, vergroot het gen van belang (smc01003, smc00930 of smc00171), voorspelde te coderen voor een lipase of fosfolipase, uit het genomische DNA van het gastheerorganisme (dwz , S. meliloti).
    1. Voegen specifieke restrictieplaatsen (de ontworpen sequentie van de oligonucleotiden). Digest het geamplificeerde DNA-fragment met de overeenkomstige restrictie-enzymen en deze klonen in een expressievector zoals plasmiden van de pET....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Activiteit van PC-specifieke fosfolipase C SMc00171 met Bis- p nitrofenylfosfaat

Celvrije extracten verkregen van E. coli BL21 (DE3) pLysS x, die moest smc00171 expressie werden onderzocht op hun vermogen om bis-p-nitrofenylfosfaat esters hydrolyseren, onder toepassing van een spectrofotometrische enzymatische test, meten blz -NP ge.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen 20 jaar hebben genomen van vele organismen gesequenced en hoewel een schat aan genoomsequentie gegevens zijn gegenereerd, wordt de functionele interpretatie achterstand en belemmert daardoor ons begrip van de werking van het genoom. Genfuncties in het genoom worden vaak toegewezen op basis van similariteit met genen van bekende functie of voorkomen van geconserveerde motieven. De precieze functie van een bepaald gen vaak niet bekend. Vooral voorspelde structurele genen voor enzymen kunnen gemakkelijk met.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 en 178.359 in Investigación Científica Básica evenals 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) en vanaf Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ChloroformJT Baker9180-03TLC-analyse & Lipid extractie
MethanolJT Baker9070-03TLC-analyse & Lipid extractie
AzijnzuurJT Baker9507-05TLC-analyse & Lipid extractie
HexanenJT Baker9309-02TLC-analyse & Lipid extractie
Di-ethyletherSigma32203Enzymatische assays
bidistilleerd water ELK NIET VAN TOEPASSINGEnzymatische assays
Tris BaseSigmaT-1503Enzymatische assays
HClBaker9535-02Enzymatische assays
NaClBaker3624-01Enzymatische assays
Triton X-100SigmaX-100Enzymatische assays
LB-bouillonELKNIET VAN TOEPASSINGBacteriegroei, 10 g tryptone + 5 g gistextract + 10 g NaCl per liter bidistilleerd water
tryptoneBecton Dickinson and Company211705Bacteriegroei
gistextractBecton Dickinson and Company212750Bacteriegroei
TY-bouillonELKNIET VAN TOEPASSINGBacteriegroei, 8 g tryptone + 3 g gistextract + 66 mg CaCl2·2H2O per liter bidistilleerd water
CaCl2·2H2OBaker1332-01Enzymatische assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG)Invitrogen15529-019Bacteriegroei
DiethanolamineSigmaD-8885Enzymatische assays
MnCl2Sigma221279Enzymatische assays
Phospholipase A2 slangengifSigmaP0790Enzymatische assays
Phospholipase C Clostridium perfringensSigmaP7633Enzymatische assays
Bis-p-nitrofenylfosfaatSigma07422AHEnzymatische assays
p-nitrofenyl stearaatSigmaN3627Enzymatische assays
p-nitrofenyl dodecanoaatSigma61716Enzymatische assays
p-nitrofenyl decanoaatSigmaN0252Enzymatische assays
p-nitrofenyl palmitaatSigmaN2752Enzymatische assays
p-nitrofenyl butyraatSigmaN9876Enzymatische assays
p-nitrofenyl octanoaatSigma21742Enzymatische assays
Azijnzuur, natriumzout [1-14C]Perkin ElmerNEC084Bacteriegroei
dimethylsulfoxide (DMSO)JT Baker9224-01Enzymatische assays
Aluminium HPTLC silicagel 60 platen. Silicagel HPTLC platen formaat 20 x 20 cm, 25 vellen.Merck105547TLC-analyse & Lipid extractie
Spectrometer UV/VIS Lambda 35Perkin ElmerNIET VAN TOEPASSINGEnzymatische assays
Storm 820 PhosphorimagerMolecular DynamicsNIET VAN TOEPASSINGPhotostimulable luminescentiescanner 
Multifunctionele scintillatietellerBeckman CoulterNIET VAN TOEPASSINGRadioactiviteitskwantificering
Franse drukcellenThermoSpectronicNIET VAN TOEPASSING Celbreuk
chromatografiepapier 3MM ChrWhatman3030917TLC-analyse
Sinorhizobium meliloti 1021ourreferentie 11onderzochte stam
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competente cellenNovagen69451eiwitexpressiestam
pET9a-vectorNovagen69431eiwitexpressievector
pET17b-vectorNovagen69663eiwitexpressievector
steriele polystyreen buis met ronde bodem (14 ml) FalconBecton Dickinson352057radiolabeling van bacterieculturen
polypropyleen microcentrifugebuisjes (1,5 ml)Eppendorf30125.15Enzymatische assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerolSigmaD9135lipid standaard
L-α-fosfatidylcholine, dipalmitoylSigmaP6267lipid standaard
DL-α-monopalmitineSigmaM1640lipid standaard
palmitinezuurSigmaP0500lipid standaard

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).
  2. Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
  3. Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipase ActivityPhospholipase AssayEnzyme OptimizationSubstrate SpecificityChromogenic SubstratesThin Layer ChromatographyRadioactive LabelingPhosphatidylcholine DegradationDiacylglycerol LipaseSinorhizobium Meliloti

Gerelateerde artikelen