Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Samenvatting

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Samenvatting

Micro-organismen produceren een breed scala aan (fosfo) lipasen die worden afgescheiden teneinde externe beschikbare substraten voor het organisme maken. Ook kunnen andere (fosfo) lipasen fysiek gekoppeld aan het producerende organisme veroorzaakt een omzet van intrinsieke lipiden en vaak aanleiding geeft tot een hermodellering van de celmembranen. Hoewel potentiaal (fosfo) lipase kan worden voorspeld met een aantal algoritmen wanneer het gen / eiwitsequentie beschikbaar, experimenteel bewijs van de enzymactiviteiten, substraatspecificiteiten en mogelijke fysiologische functies is vaak niet verkregen. Dit manuscript beschrijft de optimalisatie van testcondities voor potentiële (fosfo) lipasen met onbekende substraatspecificiteiten en hoe deze geoptimaliseerde omstandigheden te gebruiken in de zoektocht naar het natuurlijke substraat van een respectievelijke (fosfo) lipase. Met behulp van kunstmatige chromogene substraten, zoals p-nitrofenyl derivaten kunnen helpen in geringe sporenenzymatische activiteit een voorspeld (fosfo) lipase onder standaardomstandigheden. Hebben ondervonden dergelijke kleine enzymatische activiteit kunnen de verschillende parameters van een enzym assay worden gevarieerd teneinde een efficiëntere hydrolyse van het kunstmatige substraat te verkrijgen. Na de voorwaarden waaronder een enzym werkt goed hebben vastgesteld, moet een groot aantal potentiële natuurlijke substraten worden getest op hun degradatie, een proces dat gevolgd kan worden in dienst verschillende chromatografische methoden. De definitie van substraatspecificiteiten voor nieuwe enzymen, vormt vaak hypothesen voor een mogelijke fysiologische rol van deze enzymen, die vervolgens experimenteel getest worden. Door deze richtlijnen, konden we een fosfolipase C (SMc00171) die fosfatidylcholine aan fosfocholine en diacylglycerol, een cruciale stap voor de verbouwing van membranen in de bacterie Sinorhizobium meliloti upon fosfor randvoorwaarden groei degradeert identificeren. Voor twee voorspelde patatin-zoals fosfolipasen (SMc00930 en SMc01003) van hetzelfde organisme, konden we hun substraat specificiteiten opnieuw te definiëren en te verduidelijken dat SMc01003 is een diacylglycerol lipase.

Inleiding

-Glycerol gebaseerde lipiden zoals triacylglycerolen en (glycero) fosfolipiden zijn belangrijke en waarschijnlijk de meest bekende lipide-klassen ^1. Triacylglycerolen (TAGs) zijn vetten en oliën, die gewoonlijk fungeren als opslag lipiden en derhalve potentiële energie en koolstofbronnen. TAGs kan worden afgebroken door lipasen die vaak worden uitgescheiden door het producerende organisme externe TAGs verteren en beschikbaar als koolstofbronnen. Ook lipasen zijn uitgebreid bestudeerd in de jaren vanwege hun belangrijke biotechnologische toepassingen ^2.

Door hun amfifiele aard en hun bijna-cilindrische vorm, (glycero) fosfolipiden vertonen membraanvormende eigenschappen en meestal vormen de belangrijkste lipide componenten van een dubbellaag membraan ^3. In eenvoudige organismen zoals de bacterie Escherichia coli, slechts drie grote kopgroep varianten, fosfatidylglycerol (PG), cardiolipine (CL) en phosphatidylethanolamine (PE) worden aangetroffen, hoewel men dient te beseffen dat elk daarvan kan worden gesubstitueerd met een groot aantal verschillende vetacylketens op de sn-1 of sn-2 positie waardoor een groot aantal verschillende moleculaire species ⁴ . Andere bacteriën kunnen andere fosfolipiden, naast of in plaats daarvan. Bijvoorbeeld, Sinorhizobium meliloti, een bodem bacterie, die in staat is een stikstoffixerende wortel knobbel symbiose met de peulvruchten alfalfa (Medicago sativa) vormen, bevat naast een tweede zwitterionisch fosfolipide, fosfatidylcholine (PC) PE ^5. Ook lipiden zonder fosfor of glycerol kunnen amfifiele en deel uitmaken van de cellulaire membraan. Bijvoorbeeld upon fosfor beperkende groeiomstandigheden, S. meliloti, (glycero) fosfolipiden grotendeels vervangen door membraanlipiden die geen fosfor bevatten, dat wil zeggen, sulfolipiden, ornithine lipiden en diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) ^6. In bacteriën wordt DGTS gevormd van diacylglycerol (DAG) in een tweestaps route ⁷ maar de bron voor DAG generatie was niet duidelijk. Pulse-chase experimenten gesuggereerd dat PC een voorloper voor DGTS ⁸ zou kunnen zijn en het gebruik van de in dit manuscript konden we een fosfolipase C (PLCP, SMc00171) identificeren beschreven methodologie die in het kader van fosfor randvoorwaarden wordt gevormd en welke pc kan omzetten in DAG en fosfocholine ^8.

In een afzonderlijke studie, ontdekten we dat een acyl-CoA synthetase (FADD) deficiënte mutant van S. meliloti of Escherichia coli geaccumuleerde vrije vetzuren bij het invoeren van stationaire fase van ⁹ groei. Hoewel deze vetzuren leek te worden afgeleid van membraanlipiden, werden de precieze bron van de vrije vetzuren of de enzym (en) men ze niet bekend. Nogmaals, in dienst van de strategie die in dit manuscript, twee patatine-achtige ¹⁰ (fosfo) lipasen (SMc00930 en SMc01003) die hebben bijgedragen aan de vorming van vrije vetzuren in S. meliloti ¹¹ voorspeld. Verrassenderwijs SMc01003 DAG gebruikt als substraat converteren naar monoacylglycerol en tenslotte glycerol en vrije vetzuren ^11. Daarom SMc01003 een DAG lipase (DGLA).

Hoewel een aantal algoritmes aanwezig voor het voorspellen van mogelijke (fosfo) lipasen ^12,13, de exacte functie en fysiologische rol meestal niet bekend. Hier schetsen we een protocol, te klonen en overexpressie voorspelde of potentiële (fosfo) lipasen. Dit manuscript uitgelegd hoe enzymbepalingen kunnen worden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de overexpressie (fosfo) lipase met kunstmatige chromogene substraten. We geven voorbeelden hoe met een geoptimaliseerde enzym assay de echte (fosfo) lipase substraat kan worden opgetreden en hoe deze bevindingen ons begrip van microbiële fysiologie zou kunnen verrijken.

Protocol

1. Clone en overexpressie structureel gen voor Voorspelde lipase

1. Middels polymerasekettingreactie (PCR) ¹⁴ en specifieke oligonucleotiden (Tabel 1) ^15, vergroot het gen van belang (smc01003, smc00930 of smc00171), voorspelde te coderen voor een lipase of fosfolipase, uit het genomische DNA van het gastheerorganisme (dwz , S. meliloti).
   1. Voegen specifieke restrictieplaatsen (de ontworpen sequentie van de oligonucleotiden). Digest het geamplificeerde DNA-fragment met de overeenkomstige restrictie-enzymen en deze klonen in een expressievector zoals plasmiden van de pET series ^16.
   2. Na verificatie van de juiste DNA-sequentie voor het gekloneerde gen, transformeren de vector een expressiestreng zoals Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS ^16.
2. Bereid een overnachting pre-cultuur van de expressie gastheer E. coli BL21 (DE3) pLYSS, herbergt de respectieve pET vector met het gekloneerde gen of lege vector, in 100 ml kolven die 20 ml Luria Bertani bouillon (LB) ¹⁷ vermeerderd met de antibiotica. De cellen te kweken bij 30 ° C (of bij normale groeitemperatuur van de bacterie waaruit het lipase afkomstig).
   1. Uit de girale pre-culturen inoculeren 500 ml voorverwarmde LB medium (plus de benodigde antibiotica) in 2 L kweekkolven een eerste optische densiteit bij 620 nm (OD ₆₂₀₎ = 0,05. Volg groei van kweken en bij een OD ₆₂₀ = 0,3, voeg isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 100 pM en incubeer onder schudden bij 30 ° C gedurende 4 uur.
   2. Aan het einde van de incubatieperiode overbrengen elke cultuur een 500 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 5000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Resuspendeer bacteriële celpellets in 5 ml suspensie buffer (bijvoorbeeld, SMc00930- en SMc01003 tot expressie brengende cellen in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 en SMc00171 tot expressie brengende cellen in 50 mM diethanolamine-HCl pH 9,8). Bewaar de celsuspensies bij -80 ° C tot gebruik.

2. Bereid Celvrije eiwitextracten en bepalen eiwitconcentratie

1. Ontdooi bacteriële cel schorsingen en op te slaan op het ijs. Pass celsuspensies drie keer door een koude druk cel op 20.000 pond per in ^2. Verwijderen intacte cellen en celafval door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
2. Na centrifugeren aliquots van 100 en 500 pl van het supernatant voor verdere analyse en bewaar ze bij -80 ° C tot gebruik.
3. Een van de 100 ui aliquot op eiwitconcentratie afzonderlijke celvrije extracten vast bij voorkeurswerkwijze of zoals beschreven ^18.

3. Gebruik kunstmatig substraat voor het optimaliseren van EnzymeActiviteiten van (fosfo) lipase

1. Voor een initiële dekking van de verschillende enzym activiteiten, gebruik van kunstmatige substraten die een gekleurd product opleveren bij hydrolyse, zoals p-nitrofenol (p -NP).
   1. Voor enzymassays al geoptimaliseerd kunstmatige p-nitrofenyl ester substraten (geschetste fosfolipase C PLCP (SMc00171), alsmede voor de voorspelde patatin-achtige fosfolipasen SMc00930 en SMc01003), gebruik pipetteren schema in Tabel 2.
   2. Bij het verkennen van een nieuw potentieel (fosfo) lipase, stelt een eerste standaard enzym assay bevattende 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 100 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 0,5 mM p-nitrofenyl-bevattende verbinding (p-nitrofenylfosfaat , bis-p-nitrofenylfosfaat, p-nitrofenyl decanoaat of p-nitrofenyl palmitaat) en celvrije eiwitextract (raadpleeg 1, 3, 10, 30, 100, 300 en 1000 ug) in een totaal volume van 1 ml in 1 ml plastic cuvettes.
      OPMERKING: Gebruik alkalische pH (figuur 1) bij het volgen van p-nitrofenyl ester hydrolyse in een continue assay. Alternatief Gebruik één tijdpunt assays voor een traject van pH-waarden, toevoeging NaOH aan het einde van de incubatieperiode om de enzymreactie te beëindigen en te waarborgen dat alle p -NP in de fenolaat vorm.
   3. Volg het tijdsverloop voor een verhoging van de absorptie bij 405 nm, door de vorming van p -NP in een spectrofotometer bij 30 ° C gedurende een 5 minuten periode. Kwantificeren van de aanvankelijk lineaire vorming van p -NP door het bepalen van de eerste helling van de toename van de absorptie per keer.
   4. Bereken de verandering van de concentratie (Δc) voor p -NP het gebruik van de wet van Lambert-Beer (AA = ε Δc d) ^1.
      OPMERKING: AA is de lineaire verandering van de absorptie bepaald ε is de molaire extinctiecoëfficiënt bij de betreffende golflengte (in eenheden van M ^-1 cm ^-1), d de lengte van het lichtpad (1 cm) en Δc de verandering van de concentratie (in eenheden van M) worden gebruikt.
      1. Aangezien de test volume 1 ml, berekent de hoeveelheid p -NP gevormd.
         LET OP: Bedrag = concentratie x volume.
      2. Bereken de enzymactiviteit door het bedrag van p -NP gevormd door de tijd waarin het is gevormd. Bepaal de specifieke enzymactiviteit van enzymactiviteit delen door de hoeveelheid eiwit (in mg) die verantwoordelijk voor het genereren deze activiteit.
   5. Vergelijk absorptie veranderingen veroorzaakt door eiwitextracten waarin een kandidaat-gen (smc00171, smc00930 of smc01003) had geuit met extracten dat alleen een lege vector haven.
      Opmerking: Om verder met de volgende stappen, de specifieke activiteiten veroorzaakt door eiwitextracten waarin een kandidaatgen voor een uit, ten minste twee of m bedragenore dan de waarden verkregen voor de specifieke activiteiten veroorzaakt door proteïne-extracten dat alleen een lege vector haven.
   6. Voor verdere experimenten, selecteert aandoeningen waarbij hydrolyse van p-nitrofenyl-bevattende verbinding minimaal met celvrije extracten (dwz lege vector) en waarvoor de meest uitgesproken vorming van p -NP en p -nitrophenolate anion (fig 1) kan worden waargenomen wanneer eiwitextracten worden gebruikt, waarbij een kandidaatgen voor een uit.
2. Na het bepalen van de initiële enzymactiviteit in 3,1, optimaliseren van de testomstandigheden voor de betreffende enzym variëren van pH, type buffer, buffersterkte concentraties van NaCl, detergentia zoals Triton X-100, en de afwezigheid of aanwezigheid van verschillende tweewaardige kationen.
   1. Voor verschillende concentraties van elk variabel Bepaal de specifieke enzymactiviteit (zie 3.1.4.2) (het hoogste aantal verkregen definieert de voorwaardevan de maximale enzymactiviteit). Met de combinatie van optimale omstandigheden die voor elke variabele om een ​​optimale enzym assay waarbij elke variabele in de optimale concentratie te bepalen.

Figuur 1. p-nitrofenyl esters kunstmatig substraat voor (fosfo) lipase in een spectrofotometrische assay. Na hydrolyse van p-nitrofenyl esters, een zuur (R-OH) en p-nitrofenol (p -NP) gevormd. Door de _pKa = 7,2 voor de dissociatie van de fenolische H ⁺ van p -NP, bij een pH> 9,2 meer dan 99% in de felgele p -nitrophenolate vorm en een molaire extinctiecoëfficiënt van 18.000 ^M-1 cm ^{- 1} kan worden gebruikt bij een golflengte van 405 nm voor de kwantificering van vrije p -nitrophenolate ^22. Wanneer buffers met een pH van 8,5 werden gebruikt, werd de absorptie bepaald bij 400 nm en een molaire extinctiecoëfficiënt van 14.500 M ^-1 cm ^-1 werd gebruikt ^23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

LET OP: Na de optimale omstandigheden voor de activiteit van het enzym van belang, zoals omschreven, beginnen aan de zoektocht naar de echte / fysiologische substraat van deze lipase. In principe nemen twee, vaak complementair, zal dit doel, een in vivo aanpak of een in vitro aanpak te komen.

4. In vivo identificatie van de fysiologische substraat van lipase

ove_content ">. OPMERKING: In een in vivo benadering, drukken de lipase van belang in een gastheerorganisme ^8,11 voor de registratie na verloop van tijd de vraag of de expressie van het lipase verandert de host's lipidenprofiel In een andere in vivo benadering, het genereren van een deficiënte mutant van het gen van interesse ^8,11 en onderzoeken of het lipidenprofiel verschilt van de wildtype versie ^6,8,11. om een kwantitatieve beoordeling van een organisme lipidenprofiel verkrijgen, een eenvoudige methode bestaat uit radioactief merken cellulaire verbindingen , het extraheren van de lipiden, gescheiden door chromatografie, en kwantificeren van de radioactief gelabelde gescheiden lipiden.

1. Radiolabeling van lipiden.
   1. Bereid een nacht voorkweek van een organisme van belang (E. coli of S. meliloti) in 5 ml van het gewenste kweekmedium (complex medium of gedefinieerd minimaal medium) en groeit bij 30 ° C.
   2. Uit de pre-culture, te enten in 20 ml van de same vers medium in een 100 ml kolf met een initiële OD ₆₂₀ = 0,3 voor de cultuur te verkrijgen.
   3. Neem een ​​monster (1 ml) van de cultuur onder steriele condities overgebracht in een 14 ml steriele polystyreen ronde bodem buis.
   4. Voeg 1 pCi [1- ¹⁴ C] acetaat (60 mCi per mmol) aan de 1 ml cultuur.
   5. Incubeer de vloeibare kweek onder roeren bij 30 ° C gedurende 24 uur.
   6. Aan het einde van de incubatieperiode, breng de cultuur een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 12.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
   7. Resuspendeer de pellet in 100 pl water. Op dit punt, bewaar de celsuspensie bij -20 ° C of onmiddellijk verder met de extractie van polaire lipiden (sectie 4.2).
2. Extractie van polaire lipiden.
   LET OP: De methode die hier in essentie beschreven volgt de procedure van Bligh en Dyer ¹⁹ gerapporteerd.
   1. De 100 ul waterige cel suspension, voeg 375 pl methanol: chloroform oplossing (2: 1, vol / vol).
   2. Vortex gedurende 30 seconden en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Centrifugeer 5 minuten bij 12.000 xg bij kamertemperatuur.
   4. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
   5. Voeg 125 ul van chloroform en 125 ui water, vortex 30 sec.
   6. Centrifugeer 1 min bij 12.000 xg bij kamertemperatuur.
   7. Breng de onderste chloroformfase naar een nieuwe buis en droog met een stroom stikstofgas.
   8. Lossen gedroogde lipiden in 100 ui chloroform: methanol (1: 1, vol / vol).
      OPMERKING: Op dit punt, kan een monster van 5 gl van de lipideoplossing wordt gekwantificeerd door vloeistofscintillatietelling.
   9. Voor dunne-laag chromatografische analyse (TLC), droog de resterende 95 pl met een stroom stikstofgas gedroogd en los lipiden in 20 pl chloroform: methanol (1: 1, vol / vol). Gebruik een 3 gl aliquotvoor TLC-analyse.
3. Scheiding van polaire lipiden door dunnelaagchromatografie (TLC).
   Opmerking: Afhankelijk van de lipideklassen te analyseren, kunnen verschillende combinaties van vaste en mobiele fasen gebruikt worden voor de scheiding. Hier een typische scheiding voor geladen polaire lipiden en andere, meer geschikt voor neutrale polaire lipiden, met behulp van hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) silicagel aluminiumplaten als de vaste fase worden uiteengezet.
   1. Scheiding van geladen polaire lipiden door tweedimensionale TLC (2D-TLC).
      1. Breng een hoeveelheid van 3 pl lipide monster in een hoek van een HPTLC silicagel aluminiumplaat (10 x 10 cm), 2 cm van de rand van de plaat.
      2. Bereiden en meng de mobiele fase (140 ml chloroform, 60 ml methanol en 10 ml water) voor scheiding in de eerste dimensie.
      3. Coat een TLC ontwikkelen kamer intern met chromatografie papier.
         Opmerking: Dit om te verzekeren dat de gasfase van de kamerwordt snel verzadigd (binnen 30 minuten) na de mobiele fase voor de eerste dimensie is toegevoegd aan de kamer en de kamer is afgesloten met een glazen plaat.
      4. Bereiden en meng de mobiele fase (130 ml chloroform, 50 ml methanol en 20 ml ijsazijn) voor scheiding in de tweede dimensie overgebracht in een tweede TLC ontwikkelkamer inwendig gecoat chromatografiepapier en laat de kamer verzadigen.
      5. Zorgvuldig overdracht van de HPTLC silicagel aluminium plaat met de gedroogde lipide monster naar de eerste kamer en de ontwikkeling van (dat wil zeggen, uit te voeren chromatografie) de plaat gedurende 60 minuten in de gesloten kamer in de eerste dimensie ^5.
      6. Neem de plaat uit de kamer en laat oplosmiddelen drogen in een stroom kap voor 30 min.
      7. Nadat de plaat van 90 graden met betrekking tot de vorige chromatografie, breng de HPTLC silicagel aluminiumplaat waarop de lipiden in één dimensie gescheiden, de twd kamer en de ontwikkeling van de plaat gedurende 60 minuten in de tweede dimensie ^5.
      8. Verwijder de plaat uit de kamer en laat de oplosmiddelen drogen in een stroom kap voor ten minste 2 uur.
   2. Scheiding van neutrale polaire lipiden.
      1. Toepassen 3 gl aliquots lipide monsters op een HPTLC silicagel aluminiumplaat vanaf 2 cm van de rand van de plaat. Indien meerdere monsters worden geanalyseerd in een eendimensionale chromatografie, op een afstand van ten minste 1,5 cm tussen de verschillende voorbeeldtoepassing spots.
      2. Voor te bereiden en meng de mobiele fase (140 ml hexaan, 60 ml diethylether en 8 ml azijnzuur) en overbrengen in een TLC ontwikkelen kamer inwendig bekleed met chromatografie papier en afgedekt met een glazen plaat naar de kamer verzadigde (30 min) te laten.
      3. Breng de HPTLC silicagel aluminium plaat met de gedroogde lipide monsters naar de kamer en de ontwikkeling van de plaat gedurende 30 minuten in de gesloten kamer.
      4. Neem de plaat uit de kameren laat de oplosmiddelen drogen in een stroom kap voor 2 uur.
4. Kwantificering en visualisatie van gescheiden polaire lipiden.
   1. Zodra de ontwikkelde TLC plaat droog, incuberen met een fotostimuleerbare luminescentie (PSL) scherm in een gesloten cassette voor 3 dagen.
   2. Expose de geïncubeerde scherm om een ​​PSL scanner en het verwerven van een virtueel beeld van de afgescheiden radioactief gemerkte lipiden.
   3. Voer kwantificering met behulp van PSL software ^20.
5. Visualisatie en isolatie van afzonderlijke polaire lipiden klassen.
   1. Incubeer ontwikkelde TLC plaat gedurende 10 min in een kamer chromatografie bij aanwezigheid van 1 g jodium kristallen.
      LET OP: Gescheiden lipide verbindingen zullen de jodium te ontbinden en verschijnen als bruinachtige vlekken.
   2. Omcirkel de vlekken met een potlood, vergelijken met de relatieve mobiliteit (R _f) van de standaard verbindingen (dat wil zeggen 1,2-dipalmitoyl sn-glycerol, dipalmitoyl-L-α-fosphatidylcholine, DL-α-monopalmitine of palmitinezuur) en identificeren welke lipide klasse zij zouden behoren.
   3. In een zuurkast, laat de jodium verdampen uit de TLC plaat.
   4. Met behulp van een spatel, schraap de silica gel die de verbinding van interesse van de plaat en extraheer de verbinding uit het silicagel met een mengsel van 100 pi water en 375 pi methanol: chloroform oplossing (2: 1; vol / vol).
   5. Ga verder met extractie volgens Bligh en Dyer zoals geschetst (4.2.2 en verder).
   6. WINKEL gezuiverd lipideklasse in 100 ui chloroform: methanol (1: 1, vol / vol) bij -20 ° C tot gebruik.

5. In vitro identificatie van de fysiologische substraat van lipase

Opmerking: In een in vitro benadering onderzoeken of de lipase plaats een mengsel van geïsoleerde lipiden of afzonderlijke zuivere lipiden kunnen omzetten in de overeenkomstige hydroltion producten onder de gedefinieerd als optimale in 3.2 omstandigheden.

1. Gebruik pipetteren regelingen voor enzym assays als per tabel 3 voor PC-specifieke fosfolipase C SMc00171 (zie 5.2), fosfolipase A (zie 5.3), en DAG lipase SMc01003 (zie 5.4) activiteit.
2. Bepaling van PC-specifieke fosfolipase C (tabel 3).
   1. Een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 5000 tellingen per minuut (cpm) van de totale ^14-gelabeld PC en een oplossing van Triton X-100.
   2. Mix en droog onder een stroom van stikstof.
   3. Diethanolamine add-HCl, pH 9,8 buffer, en NaCl en _MnCl2 oplossingen en tweevoudig gedestilleerd water tot een eindvolume van 99,5 pl verkrijgen. Vortex gedurende 5 sec.
   4. Voeg 0,5 pl enzym (5 ug eiwit) (dwz een celvrij extract waarin overexpressie SMc00171 aanwezig is) om de reactie te starten. Meng kort.
   5. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur.
   6. Stop de reactie van detoevoeging van 250 ul methanol en 125 ui chloroform.
   7. Extract lipiden zoals eerder beschreven (zie 4.2).
   8. Aparte lipiden door één-dimensionale (1D) -TLC (zie 4.3.2 en 4.4), en analyseren door PSL beeldvorming.
3. Bepaling van de fosfolipase A activiteit (Tabel 3).
   1. Een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 5000 cpm totaal ^14-C gemerkte fosfolipiden en een oplossing van Triton X-100.
   2. Mix en droog onder een stroom van stikstof.
   3. Voor een uiteindelijke 100 gl assay add Tris-HCl, pH 8,5 buffer NaCl-oplossing en water. Vortex gedurende 5 sec.
   4. Voeg 5 ul enzym (50 ug eiwit) (dwz een celvrij extract waarin overexpressie SMc00930 of SMc01003 aanwezig is).
   5. Incubeer bij 30 ° C gedurende 5 uur.
   6. Stop de reactie door toevoeging van 250 ul methanol en 125 ui chloroform.
   7. Extract lipiden zoals eerder beschreven (zie 4.2), apartnemen met 1D-TLC via 130 ml chloroform, 50 ml methanol en 20 ml ijsazijn als de mobiele fase, en analyseren van PSL beeldvorming.
4. Bepaling van diacylglycerol (DAG) lipase-activiteit.
   1. Bereiding van ¹⁴ C-gelabeld DAG.
      1. Radioactief label S. meliloti culturen (zie 4.1) en pak polaire lipiden (zie 4.2) zoals beschreven. Aparte S. meliloti totale lipide extracten van 1D-TLC in chloroform: methanol: azijnzuur (130: 50: 20, vol / vol) via de tweede dimensie beschreven scheiding 4.3.1 omstandigheden.
      2. Visualiseer PC door jodium kleuring en gebruik maken van een potlood om de lokalisatie van fosfatidylcholine (PC) te markeren.
      3. Isoleer radiolabeled PC zoals beschreven in 4.5.
      4. Kwantificeren uitgepakte PC door scintillatietelling.
         LET OP: Ongeveer 320.000 cpm PC wordt verwacht.
      5. Behandel PC (250.000 cpm) met 0,1 U van fosfolipase C uit Clostridium perfringens in 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5% Triton X-100 en 10 mM _CaCl2 gedurende 2 uur in een totaal volume van 100 ul en stop de reactie door toevoeging van 250 ul methanol en 125 ui chloroform.
      6. Extract lipiden zoals eerder en apart beschreven door hen door 1D-TLC (zie 4.3.2).
      7. Isoleer diacylglycerol van siliciumoxideplaat en kwantificeren scintillatietelling (zoals beschreven in 4.2)
   2. Diacylglycerol lipase assay (Tabel 3).
      1. Een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 5000 cpm van ¹⁴ C-gelabeld DAG en een oplossing van Triton X-100.
      2. Mix en droog onder een stroom van stikstof.
      3. Voor een uiteindelijke 100 gl assay add Tris-HCl (pH 9,0) -buffer, een NaCl-oplossing en gebidestilleerd water. Vortex gedurende 5 sec.
      4. Start de reactie door toevoeging van 5 pi enzym (50 ug eiwit celvrij extract).
      5. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur.
      6. Stop de reactie door toevoeging van 250 pl methanol eend 125 pl chloroform en extract lipiden zoals eerder beschreven (zie 4.2).
      7. Analyseer neutrale polaire lipiden door 1D-TLC (zie 4.1.3.2) en de daaropvolgende PSL beeldvorming.

Resultaten

Activiteit van PC-specifieke fosfolipase C SMc00171 met Bis- p nitrofenylfosfaat

Celvrije extracten verkregen van E. coli BL21 (DE3) pLysS x, die moest smc00171 expressie werden onderzocht op hun vermogen om bis-p-nitrofenylfosfaat esters hydrolyseren, onder toepassing van een spectrofotometrische enzymatische test, meten blz -NP ge...

Discussie

In de afgelopen 20 jaar hebben genomen van vele organismen gesequenced en hoewel een schat aan genoomsequentie gegevens zijn gegenereerd, wordt de functionele interpretatie achterstand en belemmert daardoor ons begrip van de werking van het genoom. Genfuncties in het genoom worden vaak toegewezen op basis van similariteit met genen van bekende functie of voorkomen van geconserveerde motieven. De precieze functie van een bepaald gen vaak niet bekend. Vooral voorspelde structurele genen voor enzymen kunnen gemakkelijk met...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chloroform	JT Baker	9180-03	TLC-analyse & Lipid extractie
Methanol	JT Baker	9070-03	TLC-analyse & Lipid extractie
Azijnzuur	JT Baker	9507-05	TLC-analyse & Lipid extractie
Hexanen	JT Baker	9309-02	TLC-analyse & Lipid extractie
Di-ethylether	Sigma	32203	Enzymatische assays
bidistilleerd water	ELK	NIET VAN TOEPASSING	Enzymatische assays
Tris Base	Sigma	T-1503	Enzymatische assays
HCl	Baker	9535-02	Enzymatische assays
NaCl	Baker	3624-01	Enzymatische assays
Triton X-100	Sigma	X-100	Enzymatische assays
LB-bouillon	ELK	NIET VAN TOEPASSING	Bacteriegroei, 10 g tryptone + 5 g gistextract + 10 g NaCl per liter bidistilleerd water
tryptone	Becton Dickinson and Company	211705	Bacteriegroei
gistextract	Becton Dickinson and Company	212750	Bacteriegroei
TY-bouillon	ELK	NIET VAN TOEPASSING	Bacteriegroei, 8 g tryptone + 3 g gistextract + 66 mg CaCl2·2H2O per liter bidistilleerd water
CaCl2·2H2O	Baker	1332-01	Enzymatische assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG)	Invitrogen	15529-019	Bacteriegroei
Diethanolamine	Sigma	D-8885	Enzymatische assays
MnCl2	Sigma	221279	Enzymatische assays
Phospholipase A2 slangengif	Sigma	P0790	Enzymatische assays
Phospholipase C Clostridium perfringens	Sigma	P7633	Enzymatische assays
Bis-p-nitrofenylfosfaat	Sigma	07422AH	Enzymatische assays
p-nitrofenyl stearaat	Sigma	N3627	Enzymatische assays
p-nitrofenyl dodecanoaat	Sigma	61716	Enzymatische assays
p-nitrofenyl decanoaat	Sigma	N0252	Enzymatische assays
p-nitrofenyl palmitaat	Sigma	N2752	Enzymatische assays
p-nitrofenyl butyraat	Sigma	N9876	Enzymatische assays
p-nitrofenyl octanoaat	Sigma	21742	Enzymatische assays
Azijnzuur, natriumzout [1-14C]	Perkin Elmer	NEC084	Bacteriegroei
dimethylsulfoxide (DMSO)	JT Baker	9224-01	Enzymatische assays
Aluminium HPTLC silicagel 60 platen. Silicagel HPTLC platen formaat 20 x 20 cm, 25 vellen.	Merck	105547	TLC-analyse & Lipid extractie
Spectrometer UV/VIS Lambda 35	Perkin Elmer	NIET VAN TOEPASSING	Enzymatische assays
Storm 820 Phosphorimager	Molecular Dynamics	NIET VAN TOEPASSING	Photostimulable luminescentiescanner
Multifunctionele scintillatieteller	Beckman Coulter	NIET VAN TOEPASSING	Radioactiviteitskwantificering
Franse drukcellen	ThermoSpectronic	NIET VAN TOEPASSING	Celbreuk
chromatografiepapier 3MM Chr	Whatman	3030917	TLC-analyse
Sinorhizobium meliloti 1021our	referentie 11		onderzochte stam
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competente cellen	Novagen	69451	eiwitexpressiestam
pET9a-vector	Novagen	69431	eiwitexpressievector
pET17b-vector	Novagen	69663	eiwitexpressievector
steriele polystyreen buis met ronde bodem (14 ml) Falcon	Becton Dickinson	352057	radiolabeling van bacterieculturen
polypropyleen microcentrifugebuisjes (1,5 ml)	Eppendorf	30125.15	Enzymatische assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol	Sigma	D9135	lipid standaard
L-α-fosfatidylcholine, dipalmitoyl	Sigma	P6267	lipid standaard
DL-α-monopalmitine	Sigma	M1640	lipid standaard
palmitinezuur	Sigma	P0500	lipid standaard