genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

Samenvatting

Hier wordt ribosomale spacer PCR (RS-PCR) gebruikt samen met een geminiaturiseerd elektroforesesysteem als een snelle en hoge resolutie methode voor genotypering van S. aureus tegen matige kosten waardoor een hoge doorvoer mogelijk is.

Samenvatting

De ribosomale spacer PCR (RS-PCR) is een zeer onderscheidend en robuust genotyperingsmethode voor S. aureus die een hoge doorvoer mogelijk maakt tegen redelijke kosten en daarom geschikt is voor routinematig gebruik. Voor de beste resolutie, data-evaluatie en databeheer is een geminiaturiseerde elektroforese systeem vereist. Samen met zo'n elektroforese systeem en de in-house ontwikkelde software (gratis beschikbaar hier) is de toewijzing van het bandenpatroon aan een genotype gestandaardiseerd en eenvoudig. DNA-extractie is eenvoudig (kookvoorbereiding), het opzetten van de reacties is makkelijk en ze kunnen op elke standaard PCR-machine worden uitgevoerd. PCR-cycli zijn gebruikelijk, behalve verlengde opwarmings- en verlengingstijden. In vergelijking met spa-typering en Multi Locus Sequence Typing (MLST), vereist RS-PCR geen DNA-sequencing, wat de analyse aanzienlijk vereenvoudigt en een hoge doorvoer mogelijk maakt. Bovendien is de resolutie voor boviene stammen van S. aureus minstens zo goed als spa-typering en beter dan MLST of pulsed-field gelelektroforese (PFGE). De RS-PCR database omvat momenteel een totaal van 141 genotypen en varianten. De methode is sterk geassocieerd met het virulentiegenpatroon, besmettelijkheid en pathogeniteit van S. aureus stammen betrokken bij boviene mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is besmettelijk en veroorzaakt problemen op bedrijven die grote kosten met zich meebrengen in Zwitserland en andere Europese landen. Alle andere genotypen die in Zwitserland worden waargenomen, infecteren individuele koeien en kwartalen. Genotypering door RS-PCR maakt de betrouwbare voorspelling van het epidemiologische en het pathogene potentieel van S. aureus betrokken bij boviene intramammaire infectie (IMI) mogelijk, twee sleutelfactoren voor klinische diergeneeskunde. Vanwege deze gunstige eigenschappen samen met redelijke kosten en een hoge monstersnelheid is het doel van deze publicatie om een gedetailleerd, stap-voor-stap protocol te geven voor het eenvoudig instellen en uitvoeren van RS-PCR voor genotypering van S. aureus in andere laboratoria.

Inleiding

Staphylococcus (S. aureus) is bekend als de voornaamste pathogeen wereldwijd verantwoordelijk voor intramammair infecties (IMI) bij runderen ^1. De studie van Fournier et al. ² aangetoond in Zwitserse koeien en de studies van Cosandey et al. ³ en Boss et al. ⁴ in koeien van de 12 Europese landen die S. aureus geïsoleerd van runderen IMI is een genetisch heterogene groep. Door PCR amplificatie van het 16S-23S rRNA spacergebied intergenische (RS-PCR), werden een totaal van 17 genotypen oorspronkelijk ontdekt in 101 epidemiologisch onafhankelijke isolaten ^2. Genotype B en C genotype (GTC) waren het meest voorkomende (80%), terwijl de andere 15 genotypes (GT), kwam zelden voor, elke maken van 1 tot 4% van alle isolaten. Op Europees niveau ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, en GTR waren de belangrijkste genotypen bestaande uit 76% van alle geanalyseerde stammen (n = 456). GTB was gelegen in Midden-Europa WOverwegende dat de andere genotypen werden op grote schaal verspreid. De resterende 24% van de -stammen 41 genotypes, velen werden echter slechts eenmaal waargenomen.

De studies van Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ en Graber et al. ⁵ verder aangetoond dat de genotypen sterk geassocieerd met virulentie gen patroon, evenals bij de Zwitserse als op Europees niveau. De studie wees verder uit enorme verschillen in de IMI-prevalentie onder S. aureus GTB, GTC en de andere genotypes ^2,5: overweegt GTB, tot 87% van de koeien in een kudde werden geïnfecteerd door deze genotype. Bij GTC en de andere genotypen echter IMI werd alleen gevonden in 1-2 koeien van een kudde.

IMI veroorzaakt door S. aureus, gewoonlijk leidt tot ontsteking van de overeenkomstige borstklieren en een toename van inflammatoire cellen in melk. Als gevolg daarvan, de somatische cel counts in melk (SCC), de belangrijkste indicator van de kwaliteit van de melk in de meeste landen, wordt verhoogd leidt tot een daling melkprijs of zelfs levering stop.

Naast de RS-PCR van Fournier et al. ^2, zijn andere typen werkwijzen beschreven voor subtypering runderen stammen van S. aureus ^8-11. Twee voorkomende zijn onder andere een spa typen ¹² en Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Eerstgenoemde is een basis van DNA sequentiebepaling de variabele spacergebied van Staphylococcus spa gen dat codeert voor proteïne A, terwijl de laatstgenoemde de sequentie van 7 housekeeping genen vereist. Dit betekent dat één en zeven ¹² PCR's ¹³ respectievelijk moeten worden uitgevoerd, gevolgd door amplicon zuivering sequentiereactie en analyse met gebruikmaking van specifieke apparatuur. Vergeleken met RS-PCR, deze methoden vereisen een aanzienlijke extra inspanning in het laboratorium als gevolg een lage monsterdoorvoer en hoge kosten. Dethroughput is bijzonder laag voor PFGE. Gezien de resolutie van deze methoden voor runderen stammen van S. aureus, RS-PCR minstens even goed als spa typen ⁴ en beter dan MLST ⁴ of ¹⁵ PFGE.

Al deze methoden, met inbegrip van binaire typering ¹³ demonstreerden hun effectiviteit bij het verkrijgen van meer inzicht in de pathogenese van runderen IMI veroorzaakt door S. aureus, maar vanwege de genoemde beperkingen zijn ze minder geschikt voor grote klinisch onderzoek. Bovendien, genotypering door RS-PCR zoals beschreven door Fournier et al. ² maakt betrouwbare voorspelling van de epidemiologische en potentieel pathogene S. aureus die betrokken zijn bij runderen IMI, twee belangrijke waarden in de klinische diergeneeskunde.

Protocol

1. Staphylococcus aureus isolaten

1. Verspreid 10 pl S. aureus voorraad cultuur of een kolonie gekweekt op een selectief medium op Columbia agar-platen die 5% schapen bloed (BA).
2. Incubeer aëroob bij 37 ° C gedurende 18 uur tot 24 uur.

2. DNA Extraction

1. Bereid TEL buffer die 10 mM Tris-HCl en 10 mM _Na2 EDTA, pH 8,5. Aliquots en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
2. Verzamel 1 kolonie van BA met een steriele plastic lus of een steriele houten tandenstoker en resuspendeer in 100 ul TEL. Gebruik 1,5 ml buizen met schroefdoppen.
3. Incubeer bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Daarna plaatst de monsters onmiddellijk op nat ijs.
4. Verdun de monsters 1: 100 in _H2O geschikt voor PCR (= matrijs DNA voor PCR). De onverdund en verdund monsters bij -20 gedurende 1 maand bewaard ° C.

3. RS-PCR

1. Voor elk monster pipet in een PCR-buis 1,5 pl _H2O, 12,5 gl Taq Master Mix, 2 pi G1 primer 10 uM, 2 pl L1 primer 10 uM en 7 pl matrijs-DNA dat overeenkomt met ongeveer 30 ng zuivere DNA ^2.
2. Voer het volgende programma fietsen in een standaard PCR cycler: 15 min 95 ° C, gevolgd door 27 cycli bestaande uit 94 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door een 2 min helling en hybridisatie bij 55 ° C gedurende 7 min. Na nog eens 2 min helling verlengen bij 72 ° C gedurende 2 minuten. PCR beëindigd met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door afkoeling tot 4 ° C.
   OPMERKING: De PCR producten kan gedurende 5 dagen worden bewaard bij -20 ° C.
3. Voor elke uitvoering van RS-PCR omvatten een positieve controle, dat wil zeggen een monster met een bekend genotype (normaal GTB) en een negatieve controle (H ₂ O).

4. elektroforese

1. Gebruik commerciële geminiaturiseerde elektroforese kit voor DNA (MED kit) tezamenmet een bioanalyzer aangesloten op een pc en de geïnstalleerde software. Bestudeer de bijbehorende handleiding van de fabrikant zorgvuldig.
2. Stel de chip priming station en stel de spuit clip volgens de handleiding van de fabrikant.
3. Bereid de gel-dye mix volgens de handleiding van de fabrikant.
4. Het laden van de gel-kleurstof mix (volgens de handleiding van de fabrikant).
   1. Equilibreren de gel-kleurstof mengsel tot kamertemperatuur gedurende 30 min vóór gebruik.
   2. Zet nieuwe DNA-chip op de chip priming station. Pipetteer 9 ul van gel-kleurstof in de goed gemarkeerde G.
   3. Zorg ervoor dat de zuiger wordt geplaatst op 1 ml en sluit vervolgens de chip priming station. Druk op de zuiger totdat het wordt vastgehouden door de spuit clip. Wacht precies 30 seconden daarna de spuit clip los te maken.
   4. Wacht 5 sec. Trek langzaam terug zuiger tot 1 ml positie.
   5. Open chip priming station en pipet 9 ul van gel-kleurstof in beide putten gemarkeerd als 'G'.
5. Het laden van de MArker
   1. Pipetteer 5 ul van merker in alle 12 monster putten en in de ladder ook. Geen van deze 13 putten leeg te laten.
6. Het laden van de Ladder en de monsters.
   1. Pipetteer 1 pl DNA ladder naar de goed aangegeven met de ladder teken.
   2. Pipetteer 1 pl monster (gebruikte putjes) of 1 pl gedeïoniseerd water (ongebruikte wells).
   3. Zet de chip horizontaal in de adapter en vortex gedurende 1 min bij 2400 rpm.
   4. Voer de chip in de bioanalyzer binnen 5 min.
7. Het uitvoeren van de Analyse
   1. Start de bioanalyzer en de aangesloten computer. Open de software.
   2. Open het deksel van de bioanalyzer en plaats de chip in de chip houder (de chip past maar op één manier). Sluit het deksel voorzichtig.
   3. In het Instrument context van de software te kiezen "Elektroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Accepteer het huidige bestand voorvoegsel van de software of wijzigen.
   4. Klik op de startknop in de software. Voer het monster namen in de software. Als de chip run is voltooid (na ongeveer 30 min) het einde van Run bericht verschijnt in de bioanalyzer software.
   5. Verwijder de chip en reinig de elektroden van de bioanalyzer volgens de instructies van de fabrikant.

5. Afleiden het Genotype van de elektroforese Profile

1. Laad de Mahal software (software is gratis verkrijgbaar bij de auteurs).
2. -invoer van gegevens in de Mahal software: "File"> "Import Reference Data"
3. Open de elektroforese uitgevoerd in de context van de gegevens bioanalyzer software. Selecteer een elektroforese-profiel van één monster.
4. Controleer of de betreffende pieken.
   1. Gebruik de Mahal software om te controleren of de desbetreffende pieken: 'Extra'> 'Mean Fluorescentie ". Steek in het vak "Fluorescentie"de fluorescentiewaarden aangeduid als fluorescentie-eenheden (FU) als ze kunnen worden afgelezen van de bioanalyzer software. Steek de 4 (3) pieken met de hoogste fluorescentie in oplopende volgorde en gescheiden door een komma. Voorbeeld: 126.130.132.137.
      OPMERKING: Indien niet al deze pieken FU worden aangegeven door de bioanalyzer software, moeten ze worden geschat door ze te lezen uit de grafiek.
5. Druk op de knop "Berekenen". Een piek is relevant als de waargenomen fluorescentie de waarde die in het vak "Minimal piekhoogte" overschrijdt.
6. Afleiden het genotype.
   1. Invoegen in het Mahal tekstvak "Input Peaks (bp)" de maten in bp van alle relevante pieken in oplopende volgorde en gescheiden door een komma. Voorbeeld: 440.462.519.579.637.
      OPMERKING: Indien niet al deze piek maten zijn aangegeven door de bioanalyzer software, moeten ze worden geschat door ze te lezen uit de grafiek.
7. Druk op de knop "Berekenen".
8. In de lijstdoos, kijk voor de minimale kwadraat mahalanobis-afstand "D2M". Als het overeenkomstige P-waarde recht is ≥0.05 dan de kans is ≥5% dat de nulhypothese H ₀ verworpen (H _0: de waargenomen en het referentieprofiel identiek zijn), wat betekent dat de waargenomen profiel wordt geaccepteerd identiek zijn het referentieprofiel van het vermelde genotype.
9. Als D2M is minimaal, maar het gebied van de overeenkomstige P-waarde leeg verwerpen H ₀ met een kans <5%.
   Opmerking: Dit betekent dat de profielen ongelijke hoewel D2M minimaal. Een dergelijk resultaat kan het gevolg zijn van niet-gemiddelde elektroforese condities.
   1. Om te corrigeren voor deze afwijkingen, in te voegen in het tekstvak "Waargenomen Peak (bp)" de waarde 395 en druk op de "Bereken" knop. Controleer opnieuw voor een minimale D2M en een bijbehorende P-waarde ≥0.05. Als dit niet lukt, probeer dan de waarden 405, 415 en 425.
      OPMERKING: Soms kleinere stappen zijn zelfsaangeduid. Indien nog niet gelukt, de waargenomen profiel niet in de referentiegegevens, kan het een nieuwe genotype of variant.
10. diverse Profielen
    1. Herhaal stap 5,6-5,9 voor elke elektroforese profiel afzonderlijk.

Resultaten

Definitie van een genotype en zijn varianten

Een elektroforetische profiel verschilt in meer dan één band alle bekende genotypen wordt beschouwd als een nieuw genotype. Nieuwe genotypen worden omschreven en uitgebreid volgens Fournier et al. ⁵ leidt tot de genotypen GTA te GTZ, gevolgd door de genotypes GTAA te GTAZ en GTBA te GTBZ en GTCA te GTCC thans. Variatie in één band als een genotypische variant. He...

Discussie

De meest kritische fase van de gehele procedure is wanneer er een overmaat van DNA in RS-PCR (> 30 ng zuiver DNA / assay) ^2. In het algemeen is de resolutie van een profiel is optimaal als alle van de toppen beginnen en eindigen bij de baseline. Indien twee pieken te dicht bij elkaar, resolutie onvolledig. Onder deze omstandigheden kan de bioanalyzer software leiden tot ongepaste piek identificatie waardoor handmatige identificatie vereist is.

Alle zichtbaar gescheiden en relev...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substantie is gelijkwaardig aan Na2EDTA·2H2O
Hydrochloorzuur 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% schapenbloed	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert software	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'