Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

11.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54624

⸱

22 december 2016

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Samenvatting

Transductie-transplantatie is een snelle en efficiënte manier om hematologische kwaadaardige ziekten bij de mens in muizen te modelleren. Deze techniek resulteert in expressie van het gen van belang in hematopoëtische cellen en kan worden gebruikt om de rol van het gen in normale en/of kwaadaardige hematopoëse te bestuderen. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe transductie-transplantatie kan worden uitgevoerd met behulp van calreticulin (CALR) mutaties, die onlangs zijn geïdentificeerd in myeloproliferatieve neoplasma's (MPN), als voorbeeld. In dit protocol worden hele beenmergcellen van donormuizen, behandeld met 5-fluorouracil (5-FU), getransduceerd met een retrovirus dat mutaties in CALR codeert en getransplanteerd in levensgevaarlijk bestraalde syngeneïsche gastheren. Donorcellen die mutaties in CALR tot expressie brengen, zijn gemarkeerd met groen fluorescent eiwit (GFP). Getransplanteerde muizen ontwikkelen een MPN-fenotype, inclusief verhoogde bloedplaatjes in het perifere bloed, expansie van megakaryocyten in het beenmerg en beenmergfibrose. We geven een stapsgewijze beschrijving van hoe retrovirus te genereren, het virale titer te berekenen, hele beenmergcellen te transduceren en te transplanteren in bestraalde ontvangermuizen.

Inleiding

Transductie-transplantatie is een bruikbare methode voor hematologische maligniteiten model bij muizen. Deze techniek is bijzonder waardevol voor het bestuderen van myeloïde maligniteiten die teruggaat tot de eerste demonstratie dat ectopische expressie van BCR-ABL1 trouw kon recapituleren chronische myeloïde leukemie in muizen 1 geweest. Deze techniek is vervolgens vergemakkelijkt de uitgebreide studie van JAK2 V617F en MPL W515K / L gemuteerd myeloproliferatieve aandoening (MPN).

MPN zijn een groep van hematologische kwaadaardigheden welke door de overproductie van rijpe myeloïde cellen en beenmerg fibrose. Deze ziekten meestal voort uit de klonale expansie van een hematopoietische stamcel die een somatische mutatie in beide Jak2, MPL of CALr heeft verworven. Transductie-transplantatie JAK2 V617F en MPL W515K / L-modellen vertonen de klinische kenmerken van polycytemie vera en myelofibrosis 2-5 </ Sup>. Onlangs heeft een muismodel van calreticuline gemuteerde MPN is ook gemaakt met de transductie-transplantatie methode 6. Deze muizen ontwikkelen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met verhoogde bloedplaatjes, verhoogd aantal megakaryocyten en beenmerg fibrose. Samen hebben deze modellen niet alleen de gelegenheid om inzicht te krijgen in de moleculaire pathogenese van MPN, maar ook het vermogen ontwikkelen en therapie te bestuderen in een pre-klinische setting.

Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van transductie-transplantatie methode met een focus op de CALRdel52 mutatie. Deze techniek houdt transplantatie van retroviraal getransduceerde beenmergcellen expressie het mutante construct in bestraalde syngene ontvangende muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Californië, Irvine uitgevoerd. Alle procedures werden uitgevoerd onder isofluraananesthesie en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren.

1. Generatie van ecotrope retrovirus

  1. Bereid hoogwaardige plasmiden met een concentratie van ten minste 1 ug / ul met behulp van een commercieel maxi-prep kit of cesiumchloride zuivering.
    Opmerking: Deze omvatten een MSCV hoofdketen vector coderend voor het gen van belang (hier CALr 7,8) en teller keuze (GFP, Neo, etc.) en een ecotropische inpak plasmide, coderend voor gag-pol-env (bedoelde hier plasmide).
  2. Ontdooien en uitbreiding weinig overgezette 293T cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en L-glutamine met penicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 6 cellen in een 10 cm weefselkweek behandeld schotel in een vochtigeweefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  3. Uitbreiden 293T-cellen in de cultuur. De dag voor transfectie, wassen cellen door toevoeging van 1 ml PBS en zuig supernatant in een vacuüm kolf.
  4. Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min.
  6. Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10.
  7. Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
  8. Seed 2 x 10 6 cellen per schaaltje in drie 10 cm weefselkweek behandeld gerechten per virus gegenereerd.
    OPMERKING: Voor een optimaal resultaat, niet toestaan dat de cellen tot 30 hoger is dan - 50% samenvloeiing op het moment van transfectie of een slechte virus opbrengst kan worden verkregen.
  9. Onmiddellijk voor transfectieaspireren media in een vacuüm kolf en te vervangen door 5 ml vers D10.
  10. Voor elke 10 cm Petrischaal te transfecteren bereiden individuele steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
  11. Pipetteer 760 ul gereduceerd serum medium in elk microcentrifugebuis, dan wordt voorzichtig 40 pl transfectiereagens direct in het medium. Incubeer de buizen in weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  12. Voeg 30 ug MSCV vector met gen van interesse (15 ug bij gebruik lege vector) en 5 ug plasmide aan elke respectieve buis en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur in weefselkweek kap gedurende nog 15 min.
    OPMERKING: Kleinere vectoren hebben de neiging om een hogere virale opbrengsten hebben.
  13. Voeg voorzichtig het totale volume van elke reactie (ongeveer 800 ui) druppelsgewijs in zijn respectievelijke 10 cm petrischaal en zachtjes kantelt de schaal van links naar rechts om te mengen. Terug cellen aan de bevochtigde weefsel culture incubator.
  14. Na 8 uur of overnacht incuberen in weefselkweek incubator, aspiraat media in een vacuüm fles en voorzichtig vervangen door 10 ml vers D10.
  15. Op 48 uur na transfectie supernatant te verzamelen in een 35 ml spuit en filtreer door een 0,45 urn membraan celresten te verwijderen.
  16. OPTIE: Plaats 10 ml vers D10 terug op de 293T-cellen en aanvullende virus kan worden geoogst 72 uur na transfectie.
  17. Gooi 293T-cellen in biologisch gevaarlijk afval als er geen extra virus wordt verzameld.
  18. Aliquot virale supernatant in voor eenmalig gebruik volumes (bijvoorbeeld 1 ml voor virustiter of 6,5 ml voor BM-infectie). Flash-freeze virus met vloeibare stikstof en opslag virus bij -80 ° C.
    LET OP: Vermijd herhaalde vries / dooicycli als zij zeer virustiter te verminderen.

2. Bepaal Relatieve virale titer door flowcytometrie

  1. 3T3 cellen ontdooien en handhaven D10. Cultuur van de cellen in een 10 cmweefselkweek behandelde schotel in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Uitvoeren virale titer in drievoud. Om cellen te bereiden, wassen cellen door het toevoegen van 1 ml PBS en zuig supernatant in een thermoskan.
  3. Cellen trypsinize, voeg 2 ml 0,05% trypsine en incubeer gerechten in een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  4. Om behandeling met trypsine te stoppen, voeg 3 ml D10 voor te schotelen en overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. Spin cellen bij 400 xg gedurende 10 min.
  5. Zuig supernatant in een vacuüm kolf en resuspendeer celpellet in 2 ml D10.
  6. Tel de cellen met behulp van trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
  7. Zaad 3T3 cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen in vijftien 60 mm weefselkweek behandelde gerechten en incubeer overnacht.
  8. Maak 1: 3, 1:10, 1:30 en 1: 100 verdunningen van ontdooide virale supernatant middels D10 in een totaal van 1 ml. Ook een virus-vrij controle.
  9. aspireren media van 3T3 cellen in een vacuüm kolf en vervangen door 4 ml D10.
  10. Overlay de 3T3 cellen met verdunningen van virale supernatant en voeg polybreen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml elk gerecht. Incubeer gedurende 48 uur in de weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  11. Bepaal relatieve virale titer met stroomcytometrie:
    1. Om de cellen te wassen, zuigen de media in een vacuüm kolf en voeg 5 ml PBS.
    2. Zuig het PBS in een thermoskan. Voeg 1 ml 0,05% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten om cellen los van de schotel.
    3. Voeg 3 ml D10 en pipet op en neer om alle resterende cellen van de plaat los te maken. Breng de cellen een FACS buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
    4. Decanteer supernatant en was cellen met 3 ml PBS. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min en decanteren supernatant. Resuspendeer in 200 ul PBS.
    5. Run cellen op een flowcytometer 9. Verzamel tussen de 20.000 - 30.000 events binnen tHij woont cel gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen.
      OPMERKING: De virale titer wordt aanvaardbaar geacht wanneer de 1:30 verdunning van viraal supernatant opbrengst minimaal 50% GFP + 3T3 cellen. Als deze verdunning geeft minder dan 50% GFP + cellen vervolgens suboptimale transductie resultaten kunnen worden verkregen. De berekening van virale titer te bepalen werd aangepast van Limon et al. , Blood (1997) 9.
    6. Relatieve virus titer te bepalen, gebruik maken van de vergelijking: virus titer = deeltje eenheden (PFU) / ml = [(Aantal 3T3 Cellen × frequentie van GFP + cellen) / Volume van Supernatant (ml)] × Verdunningfactor.

3. transduceren Donor Bone Marrow Cells

  1. Om donor muizen voor het beenmerg te bereiden (BM) oogst, eerst verdoven muizen door isofluraan vaporizer met een debiet van 5% gecombineerde supplementairezuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen.
    OPMERKING: Donormuizen (minder dan 8 weken oud) worden bereid 5 dagen voorafgaand aan beenmerg oogst (8 dagen voorafgaand aan de transplantatie). Één donor muizen genoeg cellen minstens 2 ontvangers.
  2. Injecteren 150 mg / kg 5-fluorouracil (5-FU) via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een 27 G x ½ "naald.
    VOORZICHTIGHEID! 5-FU een anti-kanker chemotherapeutisch middel. handvat 5-FU altijd in een gecertificeerde zuurkast of een getunnelde bioveiligheid kast. Neem contact op met het laboratorium en dierlijke veiligheid commissie van de instelling om de juiste etikettering van muizen behandeld met 5-FU te bepalen.
    1. Plaats de verdoofde muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop.
    2. Te beginnen met de naald lateraal van de mediale ooghoek en met de schuine kant naar boven, steek de naald op een 45° hoek in het mediale richting en stopt wanneer de naald half ingebracht. Langzaam injecteren cellen en verwijderen verwijder voorzichtig de naald.
      LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld.
    3. Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding.
  3. Oogst beenmerg 5 dagen na 5-FU behandeling (3 dagen voorafgaand aan de transplantatie).
    1. Verdoven muizen met isofluraan vaporizer met een stroomsnelheid van 5% gecombineerde extra zuurstof bij 1 l / min. Knijp voet naar responsiviteit te beoordelen.
    2. Sacrifice muis door cervicale dislocatie. Steriliseren muis door royaal besproeien met 70% EtOH totdat vacht nat wordt.
    3. Gebruik ontleden schaar, een insnijding in de huid en fascia ontleden de weg van de beenspieren. Vervolgens ontleden het been uit de buurt van de muis door het scheiden van het dijbeen op de heup en het scheenbeen bij de enkel.
    4. Bochthet been in een "L" vorm en scheiden elke poot bot door te snijden bij het kniegewricht met het ontleden van een schaar.
    5. Kraakbeen bij de distale einden van elk been bot verwijderen met het ontleden schaar om voorzichtig schrapen de spieren in de richting van het ene uiteinde van het been bot totdat het kraakbeen is uitgeschakeld.
    6. Met behulp van een spuit met een 27 G x ½ inch naald, flush elk been bot met PBS aangevuld met 2% FBS meer dan 100 um nylon membraan in een 50 ml conische buis. Flush been tot been wit wordt het aantal cellen geoogst maximaliseren.
    7. Gebruik de plunjer van een injectiespuit aan cellen mash door het nylon membraan in de 50 ml conische buis om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Herhaal dit met andere muis been.
  4. Centrifugeer cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Resuspendeer BM in 5 ml ammoniumchloride kalium (ACK) buffer om rode bloedcellen te lyseren. Incubeer cellen op ijs gedurende 10 min.
  5. Vulbuis met PBS om cellysis te stoppen. Centrifuge cellen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg en verwijder het supernatant. Herhaal lysis stap als de BM pellet rode kleur.
  6. Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen door trypan blauw exclusie onder toepassing van een hemocytometer.
  7. Resuspendeer cellen bij 2 x 10 6 cellen per m met 2x pre-stim cocktail die bestaat uit DMEM aangevuld met 20% FBS, L-glutamine, penicilline / streptomycine, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) en SCF (112 ng / ml). Plaat 2 ml per putje in 6 well platen.
  8. Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Voeg 2 ml virale supernatant aan elk putje met BM cellen en voeg polybreen (8 ug / ml). Spin platen bij 30 ° C gedurende 90 min bij 1500 xg dan plaat terug naar de weefselkweek incubator overnacht.
  10. Pipet celsuspensie in conische buizen en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 400 xg, niet de plaat verwijderen. Resuspendeer cellen in 2 ml vers 2x pre-stim cocktail per putje en terug te keren naar de oorspronkelijke bronnen.
  11. Voer een 2e spinoculation door herhalen van de stappen 3,7-3,9.

4. Transplant donorcellen in Ontvanger Muizen

  1. Bereid syngene ontvangende muizen voor transplantatie met letale dosis totale lichaamsbestraling <24 uur voor de injectie van BM cellen.
    OPMERKING: Lethal stralingsdosis voor BALB / c-muizen typisch 800-900 cGy en 1,000-1,200 cGy voor C57B / 6 10. De dosis wordt gewoonlijk verdeeld in twee sessies van bestraling afstand tenminste 3-4 uur apart.
  2. Vervolg van stap 3.11, oogst getransduceerde donorcellen van de 6 wells platen door voorzichtig pipetteren supernatant in conische buizen. Was elk putje met 1 ml PBS om resterende cellen te verzamelen en voeg aan 50 ml conische buizen.
  3. Voeg 0,5 ml van 0,05% trypsine aan de putjes en incubeer bij 37 ° C in de weefselkweek incubator gedurende 5 min.
  4. Voeg 1 ml D10 te putten en los eventuele resterende cellen door zachte pipetteren. cellen toe te voegen aan de respectievelijke buiss van stap 4,2 en pellet door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g.
  5. Was de cellen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 400 x g. Hersuspenderen in 5 ml PBS en tel cellen met een hemocytometer door trypan blauw exclusie.
    OPMERKING: Als de vector een GFP-tag dan kwantificeren van het percentage GFP-positieve cellen met een flowcytometer.
  6. Resuspendeer 5 x 10 5 - 2x 10 6 cellen in 50-100 pi PBS voor injectie in muizen.
  7. Injecteren cellen via retro-orbitale injectie in verdoofde muizen met behulp van een steriele 27 G x ½ "naald.
    LET OP: Overige injectie technieken zijn staart-ader, milt, of dijbeen.
    1. Verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen.
    2. Plaats de muis op zijn kant en beperken door zowel de duim en wijsvinger, zodat de gaten enigszins uitsteekt uit de kop.
    3. Met de schuine kant naar boven, steek de needle lateraal van de mediale ooghoek bij een 45 ° hoek.
      LET OP: Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, moet het oog iets terug te trekken en er geen weerstand moet op de naald inbrengen worden gevoeld.
    4. Onderzoek muis op tekenen van schade zoals zwelling of bloeding.
      NB: Na de transplantatie muizen zal lage bloeddruk telt voor een aantal weken te hebben en dus vatbaar zijn voor infecties. Profylaxe met antibiotica of het gebruik van aangezuurd water worden gebruikt.
  8. Een maand na de transplantatie, meet de% GFP in het perifere bloed als indicator voor getransplanteerde donor cellen door flowcytometrie.
    OPMERKING: GFP alleen niet succes van implantatie van de cellen te bepalen. De virale transductie mogelijk mislukt nog aanslaan kan zijn opgetreden. In dit geval zou er geen GFP + cellen worden gedetecteerd, maar aanslaan van getransplanteerde cellen succesvol was.
    1. Neem 10 pi van perifeer bloed by aanprikken van de ader vena been met een 21 G x 1 ½ "spuit en voeg deze toe aan 100 mM EDTA in PBS om stolling te voorkomen.
    2. Voeg 1 ml ACK om bloed en Lyse op ijs gedurende 10 min. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min.
    3. Aspireren supernatant in een vacuüm kolf en voeg 1 ml PBS aangevuld met 2% FBS aan lysis te stoppen. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min.
    4. Aspiraat supernatant onder vacuüm kolf en resuspendeer pellet in 100 pl PBS gesupplementeerd met 2% FBS.
    5. Run monsters op een flowcytometer en het verzamelen van 300.000 events binnen de levende cellen gate (bepaald door FSC vs. SSC) en bereken het percentage van de GFP + en GFP - cellen 9.
  9. Daarnaast is op 1 maand na de transplantatie, uit te voeren complete bloedbeeld (CBC) met behulp van een geautomatiseerde veterinaire hematologie-analyse 18 tot progressie van de ziekte te volgen.
    LET OP: Ga door met de ziekte door% bewakenGFP in perifeer bloed en CBC maandelijks.
  10. Om het experiment te beëindigen, verdoven muis met behulp van isofluraan en pinch voet naar responsiviteit te beoordelen. Sacrifice muis door cervicale dislocatie en de oogst milt en beenmerg voor histopathologie.
    OPMERKING: De duur van het experiment is subjectief en de einddatum worden beoordeeld op basis van het verwachte fenotype.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De transductie-transplantatietechniek resulteert in hematopoietische reconstitutie van de ontvangende muizen met cellen het gen van belang tot expressie brengen. Figuur 1 toont een overzicht van de transductie-transplantatie muismodel van calreticuline gemuteerde MPN. Kort samengevat, retrovirus expressie CALRwt of CALRdel52 wordt gebruikt om BM cellen te infecteren van een C57B / 6 donormuis. Getransduceerde cellen worden getransplanteerd in bestraalde C57B / 6 ontvange...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het beenmerg transplantaties uitgevoerd bij muizen een essentiële trombocytemie-achtige ziekte met progressie herhalen om myelofibrose met CALRdel52 mutatie als de bestuurder van ziekte. Succesvolle transplantatie van cellen die CALRdel52 resulteert in verhoogde bloedplaatjes, uitbreiding van megakaryocyten en beenmerg fibrose. Beenmerg transplantatie een meerstaps proces is het belangrijk om stappen waarbij technische fout kan worden vermeden slechte engraftment va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de V Foundation Scholar (AGF) en de MPN Research Foundation (AGF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellijnen
DMEMCorningMT-10-013-CV
293T cellenATCCCRL-11268
3T3 cellenATCCCRL-1658
Plasmiden
EcoPak, ook bekend als pCL-EcoAddgene12371Retrovirale verpakkende cellijnen, zoals EcoPack 2-293, kunnen in plaats van het EcoPak-plasmide en standaard 293T-cellen worden gebruikt. Aanvullende γ-retrovirus envelop en verpakking plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene en anderen.
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene20672Aanvullende γ-retrovirale transfer plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene en anderen.
Verbruiksartikelen
27 G x 1/2" naaldenBD305620
Foetaal bovien serumCorningMT-35-010-CV
Penicilline/streptomycine/L-glutamineCorningMT-30-009-CI
Trypsine-EDTA (0,05%)CorningMT-25-052-CIKan zelfgemaakt worden
PBSCorningMT-21-031-CV
10 cm schalenFisher172931
15 ml conische buizenFisher12565268
60 mm schalenFisher150288
PolybreenFisherNC9840454
5-FUFisherA13456-06
100 µm cel zeefjesFisher22363549
50 ml conische buizenFisher12565270
6-well plateFisher130184
FACS buizenFisher14-959-5
0,45 μm spuitfiltersFisher0974061B
Opti-MEMGibco31985-070
ACK bufferLonza10-548EKan zelfgemaakt worden
Recombinant muur IL-3Peprotech213-13
Recombinant muur IL-6Peprotech216-16
Recombinant muur SCFPeprotech250-03
X-tremeGENE 9Roche6365809001Transfectiereagens
1,5 ml centrifugebuizenUSA Scientific1615-5500
Apparatuur
BD Accuri C6
X-ray bestraler

Referenties

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
  2. Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
  3. Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
  4. Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18(2006).
  5. Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
  6. Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
  7. Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  8. Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
  9. Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
  10. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  11. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  12. Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
  13. Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
  14. Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
  15. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  16. Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
  17. Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
  18. Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Calreticuline mutatiebeenmergtransplantatieretrovirale transductieGFP expressiehematopo tische cellenberekening van de virustiter5 FU behandelingbestraalde ontvangende muizen
Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.