Methodenartikel

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn Ex Ovo Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo's

24.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54636

⸱

28 december 2016

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een nieuwe techniek om kuikenembryo's ex ovo te kweken voor time-lapse beeldvorming met behulp van doorgelaten licht en fluorescentiemicroscopie. De ondergedompelde filterpapiersandwich is een variant van de bekende filterpapierdragertechniek1 die het mogelijk maakt om kuikenembryo's volledig ondergedompeld in een vloeibaar kweekmedium te kweken.

Samenvatting

Als gevolg van de beschikbaarheid, lage kosten, vlakke meetkunde, en de transparantie, de ex ovo kippenembryo is uitgegroeid tot een belangrijke gewerveld dier model voor de studie van morfogenetische gebeurtenissen, zoals gastrulatie 2, neurulatie 3-5, somitogenesis 6, hart buigen 7, 8, en de hersenen vorming 9-13, tijdens de vroege embryogenese. De sleutel tot het begrijpen van morfogenetische processen is om ze dynamisch te volgen door time-lapse imaging. De overname van time-lapse filmpjes van chick embryogenese ex ovo is beperkt ofwel korte tijd ramen of op de noodzaak van een incubator voor temperatuur en vochtigheid rond het embryo 14. Hier presenteren we een nieuwe techniek om cultuur kippenembryo's ex ovo voor hoge-resolutie time-lapse beeldvorming met behulp van doorvallend licht microscopie. De ondergedompelde filterpapier sandwich is een variant van de gevestigde filterpapier carrier technique (EC-cultuur) 1 en maakt het kweken van kippenembryo's zonder de noodzaak van een klimaatkamer. Het embryo is ingeklemd tussen twee identieke filtreerpapier dragers en op de hoogte is ondergedompeld in een eenvoudige, geconditioneerd medium waarop een laag dunne minerale olie. Uitgaande van de primitieve streep fase (Hamburger-Hamilton stadium 5, HH5) 15 tot ten minste 28-somiet stadium (HH16) 15 kunnen embryo's gekweekt met hetzij hun ventrale of dorsale zijde worden. Dit maakt het mogelijk de overname van time-lapse filmpjes die ongeveer 30 uur van de embryonale ontwikkeling. Representatieve time-lapse beelden en films worden getoond. Embryo's zijn morfologisch vergeleken met een embryo gekweekt in standaard EC-cultuur.

De ondergedompelde filterpapier sandwich zorgt voor een stabiele omgeving te vroeg dorsale en ventrale morfogenetische processen te bestuderen. Het staat ook voor live-fluorescentie beeldvorming en micromanipulations, zoals microchirurgie, parel implantation, microinjectie, genuitschakeling en elektroporatie, en kan in hoge mate worden gecombineerd met onderdompeling doelstellingen laser-gebaseerde beeldvorming (inclusief licht-microscopie vel).

Inleiding

Embryogenese heeft de mens gefascineerd sinds het begin van de geschiedenis. Hoe de structuur en morfologie van een embryo te ontwikkelen dergelijke goed gedefinieerde temporele en ruimtelijke wijze? Het kippenembryo is een van de klassieke gewervelde diermodellen voor embryogenese om verschillende redenen: Het is gemakkelijk verkrijgbaar, goedkoop, transparant in het beginstadium en toegankelijk voor experimentele manipulaties, als het zich ontwikkelt buiten de moeder. Bovendien heeft een vrijwel vlakke geometrie tijdens de vroege morfogenetische gebeurtenissen, zoals hart en hersenen vorming, gastrulatie, neurulatie en somitogenesis 15.

Morfogenetische processen kunnen het best worden begrepen als ze dynamisch worden bestudeerd, zoals door de overname van time-lapse beelden. De kippenembryo kunnen worden gevisualiseerd in ovo 16, maar met een slechte toegankelijkheid voor experimentele manipulaties en beperkte zichtbaarheid voor transmissie lichtmicroscopie beeldvorming. Daarom several technieken zijn voorgesteld om cultuur kippenembryo's ex ovo, hetzij geheel dooier kweeksystemen 13,17 - 19 of explantkweken 1,20 - 23. Geheel dooier kweeksystemen, het embryo blijft bovenop de dooier intact en de volledige inhoud van het ei naar een andere container voor incubatie. Deze container kan een surrogaat eierschaal 17, een petrischaal 19, of een hangmat gemaakt van plastic huishoudfolie wrap 13,18 zijn. Embryo's in de hele dooier culturen kan ideaal gekweekt tot uitbroeden en zijn toegankelijk voor micromanipulations. Deze technieken zijn vooral nuttig voor het bestuderen van de ontwikkeling van embryo na de start van de bloedcirculatie (die het contrast toeneemt), terwijl de jongere embryo moeilijk zichtbaar blijven. Deze vroege embryo's kunnen het best worden afgebeeld als ze worden uitgesneden uit de dooier en gekweekt in vitro explantaten. De explantaten zijn gemakkelijk toegankelijk voor experimental manipulaties en vereisen minder ruimte voor het kweken. Gedurende vele jaren, een techniek ontwikkeld door Denis Nieuw in 1955 en zijn varianten waren de gouden standaard van explantaatkweek methoden voor het kippenembryo's, waardoor het embryo toegankelijk zijn voor time-lapse microscopie en microchirurgische ingrepen 20,21 maken. Ondanks zijn grote succes, New techniek is relatief zwaar en tijdrovend. De blastoderm los vaak wanneer de vitelline membraan, het dragen van de blastoderm, wordt uitgerekt rond een glazen ring om de juiste spanning 1 te bereiken. Bovendien kan het embryo alleen gekweekt met ventrale zijde naar boven. De EC (Early Chick) cultuur, een meer recente techniek ontwikkeld door Chapman en Collignon 1, omzeilt het uitrekken van de vitelline membraan met behulp van een papieren filter drager met een centrale opening. Het filterpapier hecht aan de vitelline membraan, waardoor de natuurlijke spanning behoud, en omringt het embryo als een fotolijst 1.Embryo's worden vervolgens gekweekt op een agar-eiwit bodem, meestal met de ventrale zijde naar boven. Het kweken van dorsale kant naar boven lijkt alleen mogelijk voor embryo's in HH8 15 jaar en ouder. Veel groepen hebben het filterpapier carrier aan hun behoeften, aangepast zoals door het vervangen van de agar-eiwit bodem met een ondersteuning gemaakt van chirurgisch hechtdraad vezels 24 of een collageen gecoate membraan 25. Vaak embryo's gekweekt met nieuwe techniek of met het EG-cultuur worden blootgesteld, met hun dorsale of ventrale oppervlak om lucht naar zuurstof diffusie 1,20 vergemakkelijken. Deze explantkweken hebben in een vochtige atmosfeer worden gehouden om verdamping van het medium te vermijden en te voorkomen dat de embryo uitdroogt. Dit wordt bereikt door het incuberen van de schaal met de explantaatkweek in groter petrischaal met vochtig tissuepapier 1. De overname van time-lapse beelden van deze embryo's vereist hetzij het gebruik van een klimaat gecontroleerde incubator rond de hele microscoop of een buiARD-gestuurde container met een verwarmd deksel om condensatie in het lichtpad 14 te voorkomen. Echter, kippenembryo's ook de ontwikkeling van ex ovo volledig ondergedompeld in kweekmedium als filterpapier culturen 25, ingeklemd tussen een laag van zware minerale olie en eiwit in aanpassingen van New De techniek van 2,21, of gevouwen blastoderm explantaten in de "Cornish Pasty Cultuur "23,26, zonder direct contact met de lucht.

De ondergedompelde filtreerpapier sandwich is een nieuwe variant van het filter papierdrager techniek. Door het combineren van eerdere kennis over het kweken van kippenembryo's ex ovo, het maakt de geconditioneerde incubator en het verwarmde deksel overbodig. Het embryo is ingeklemd tussen twee identieke (laser-cut) filterpapier dragers 24 en gekweekt volledig ondergedompeld in een eenvoudige kweekmedium (Pannett-Compton zoutoplossing 27,28 en dun eiwit in een verhouding 3: 2) in een temperatuurgecontroleerde bevattenER. Een laag dunne minerale olie drijvende bovenop het medium voorkomt verdamping 2,21 en minimaliseert warmteverlies aan de omgeving. De bodem van de houder een raam, en de gehele installatie wordt uitgevoerd op een rechte lange werkafstand zoom microscoop. Deze opstelling maakt het mogelijk de overname van hoge-resolutie helderveld en donkerveld time-lapse filmpjes van ongeveer 30 uur van de embryonale ontwikkeling, variërend van de vroege primitieve streep podium om de 28-somite fase (gelijk aan Hamburger Hamilton stadia 5-16, HH5-16 ) 15. Embryo's kunnen net zo goed worden gekweekt met hun ventrale of dorsale zijde naar boven. Daarom embryo's zijn toegankelijk voor observatie en manipulatie van ventrale (bv vroege hart 7,8 en somitogenesis 6) en dorsale (bv late gastrulatie 2, neurale buis sluiting 3-5, en de vroege hersenontwikkeling 9-13) ontwikkeling. De ondergedompelde filterpapier sandwich provides een eenvoudige en stabiele omgeving voor microchirurgie, kralen implantatie, micro-injectie, gene silencing, en elektroporatie studies. De imaging potentieel kan nog veel verder worden geduwd door het gebruik van laser-based imaging (met inbegrip van light-sheet microscopie) en onderdompeling doelstellingen.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Nederland Wet op de dierproeven.

NB: De ondergedompelde filterpapier sandwich methode is gewijzigd ten opzichte van 1.

1. Ondergedompeld Filter Paper Sandwich Voorbereiding

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Bereid voorraadoplossingen A (1 liter ultrazuiver H 2 O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl2 · H2O en 12,7 g MgCl 2 · 6H 2 O) en B (1 liter ultrapuur H 2 O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O en 0,188 g NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) in schone 1-L flessen. Bewaar ze bij 4 ° C.
    2. Bereid 1 liter PC-zout door het mengen van 900 ml ultrapuur H 2 O met 40 ml van de oplossing A en 60 ml voorraadoplossing B (in deze volgorde precipitatie te voorkomen). Bereid PC-zoutoplossing vers frOM voorraad oplossingen A en B elke week.
      OPMERKING: Voorraadoplossingen kan enkele maanden worden bewaard bij 4 ° C. Autoclaveren en / of het toevoegen van antibiotica en antimycotische middelen zijn niet nodig.
  2. Incubatie van bevruchte kippeneieren
    1. In een bevochtigde incubator, leg de eieren op hun kant en broeden ze op 37,5 ° C tot ze de gewenste leeftijd bereiken.
      LET OP: Bewaren eieren niet langer dan twee weken (bij voorkeur bij 12-15 ° C) voorafgaand aan het experiment, omdat de uitkomst zal aanzienlijk dalen
  3. Filter papier dragers (aangepast van 1)
    1. Indien beschikbaar, gebruik maken van een lasersnijmachine aan zandloper-vormige filterpapier carriers gesneden uit dik filtratie papier (28 mm x 22 mm). Schuin de breedte in het midden van 22 mm tot 10,4 mm. Snijd een centrale ellipsvormige opening (10,6 mm x 5,5 mm), met de langere as van de ellips georiënteerd evenwijdig aan de grotere zijde van het filter papierdrager (figuur 1-M).
      1. Eventueel stelt een kartonnen sjabloon met de juiste afmetingen en breng de omtrek en die van de centrale opening dikke filtreerpapier met potlood. Knip het filterpapier carrier met behulp van fijne schaar.
    2. Knip twee identieke filterpapier dragers voor elk embryo moet worden geëxplanteerd. Bereid extra filterpapier carriers als back-up voor het geval dat een embryo verloren tijdens explanteren.
  4. Temperatuur-gecontroleerde oliebad (op de dag van het experiment)
    1. Plaats de temperatuurgestuurde beker in het midden van het gemotoriseerde xy-fase van de opstaande zoom microscoop en sluit de beker met de temperatuurregelaar.
    2. Zet vier grote roestvrij stalen ringen (30 mm buitendiameter 4 mm hoog, 1,5 mm wanddikte) in een 6 cm petrischaal bij wijze van gewicht en plaats de schotel in het midden van de geconditioneerde bekerglas.
      LET OP: Deze petrischaal net fungeert als een tijdelijke aanduiding om de olie te passen level.
    3. Vul het temperatuur-gecontroleerde beker met 130 ml van lichte minerale olie. Het olie- gehalte indien nodig zodat het eindigt ongeveer 3 mm onder de bovenkant van de 6 cm Petrischaal.
    4. Verwijder de 6 cm Petrischaal van de geconditioneerde bekerglas en de temperatuur op 40 ° C.

2. Ondergedoken Filter Paper Sandwich Production

  1. Kweekmedium (op de dag van het experiment)
    1. Giet 30 ml PC-zoutoplossing (zoals bereid in de stappen 1.1.1 tot 1.1.2) in een 50 ml centrifugebuis. Bereid een 50 ml centrifugebuis gevuld met 30 ml van PC-zoutoplossing elke twee embryo's geëxplanteerd.
    2. barst een niet-bebroede eieren voorzichtig in een 10 cm petrischaal.
    3. Oogst dunne albumen door verplaatsing plastic overdracht pipet langs de wanden van de petrischaal en zuigen in de dunne albumen. Verzamel 30 ml dunne albumine in een 50 ml centrifugebuis per twee embryo's geëxplanteerd. Zorg ervoor dat u alleen de t verkrijgenhin eiwit.
      LET OP: Meestal 3-4 eieren toestaan ​​dat de oogst van ongeveer 30 ml dunne albumine.
    4. Giet 20 ml dunne albumen in elke pc zoutoplossing gevulde 50 ml centrifugebuis (zoals bereid in stap 2.1.1).
    5. Meng de PC-zoutoplossing met de dunne albumen door voorzichtig een paar keer omkeren van de buizen. Laat het regelen voor een aantal minuten en controleer of het mengsel, de zogenaamde kweekmedium vanaf hier, is duidelijk. Als het kweekmedium is niet duidelijk, vers bereid PC-zoutoplossing uit de voorraad-oplossing en de oogst verse dunne albumine.
  2. Plaats twee kleine roestvrij stalen ringen (20 mm buitendiameter, 4 mm hoog, 1,5 mm wanddikte, 6,5 mm gat in de ring) zo ver mogelijk uit elkaar in een frisse 6 cm plastic petrischaal en vul het met 22 ml van de cultuur medium (zoals bereid in de stappen 1.4.1 tot 1.4.4) met een 25 ml plastic pipet (figuur 1-H). Zorg ervoor dat vuil dat zich op de top van het medium blijft in de centrifugebuis.
  3. Verwijder eventueel vuil or bellen uit het medium met een plastic pipet overdracht.
  4. Vul een 10 cm Petrischaal met 75 ml PC-zoutoplossing (voor gebruik in stap 2.15).
  5. Verwijdert een ei uit de incubator en laat het rusten op de bank zijn zijkant 1 min laten komen embryo naar de top van de dooier.
  6. Barst voorzichtig het ei in een petrischaal (figuur 1-A). Genieten de rand van een stuk fijne tissue in de dikke albumine en centreren blastoderm door te trekken, indien nodig.
  7. Verwijder het grootste deel van de dunne en dikke albumine van de petrischaal met behulp van een plastic overdracht pipet (met de tip afgesneden om de opname van de dikke albumine te vergemakkelijken).
  8. Maak een raam in de dikke albumine rond het embryo door zachtjes weg te vegen de dikke albumine met een stukje weefsel papier, af te stappen van het centrum (figuur 1-B). Voorkom dat het weefsel papier uit die verbonden zijn aan de vitelline membraan.
  9. Met behulp van een pincet, plaatst u voorzichtig een papieren filter vervoerder op de vitelline membraan rond de embryo met de lange as van de elliptische opening evenwijdig aan de anterior-posterior as van het embryo (figuur 1-C).
  10. Knijp een tip van de nagel schaar door het vitelline membraan in de buurt van het filter papier drager en snel snijden rond de hele filterpapier carrier (figuur 1-D).
  11. Met een pincet, tilt het filter papierdrager verwijderd van de dooier in schuine richting parallel aan de anterior-posterior as van het embryo (Figuur 1-E).
  12. Draai het filter papier vervoerder rond naar de buikzijde van het embryo op de top te hebben en onder te dompelen in de PC-zoutoplossing. Dompel het filterpapier het langs de anterior-posterior as van het embryo in een schuine richting.
  13. Te ontdoen van alle de dooier nog aan de vitelline membraan en de blastoderm door voorzichtig te spoelen met PC-zoutoplossing uit een plastic overdracht pipet. Houd het geheel van het filterpapier ondergedompeld in een carrierll keer (figuur 1-F).
  14. Verwijder het filter papier vervoerder van de PC-zoutoplossing langs de anterior-posterior as van het embryo in een schuine richting en zich te ontdoen van de overtollige vloeistof door deppen de rand van het filter papier vervoerder op een tissue papier.
  15. Houd het filterpapier horizontaal, met de ventrale zijde van het embryo naar boven en plaats nog een filter papierdrager boven op de eerste, met een tweede pincet. De openingen moeten exact overeenkomen, waardoor het embryo tussen de twee lagen filterpapier (figuur 1-G) sandwichmethode.
  16. Onmiddellijk onderdompelen filter papierdrager sandwich in het kweekmedium in een schuine richting langs de anterior-posterior-as van het embryo. Plaats het in het gebied overspant de ruimte tussen de twee stalen ringen (figuur 1-H).
  17. Bevestig het filtreerpapier sandwich door het plaatsen van twee stalen ringen bovenop de beide andere, ervoor te zorgen dat de opening van de embryo blijft volledig blootgelegd (figuur 1-I).
  18. Controleer het gemiddeld niveau en zorg ervoor dat de bovenste afstandhouder is gewoon ondergedompeld in het medium. Indien nodig, toevoegen of verwijderen van kleine hoeveelheden medium.
  19. Plaats het petrischaal in het midden van de temperatuurregeling oliebad en stabiliseren de schotel zijdelings door drie grote roestvrij stalen ringen (30 mm buitendiameter 4 mm hoog, 1,5 mm wanddikte) naast de schaal in de olie . Zorg ervoor dat de stalen ringen raken de zijkanten van de schaal (figuur 1-J).
  20. Pipet langzaam ongeveer 6 ml lichte minerale olie bovenop het medium met een kunststof transferpipet, zodat het medium is bedekt met een continue laag van minerale olie (figuur 1-K).
  21. Stel de time-lapse acquisitie.
    LET OP: beeld brengen van de embryo's als horizontale panorama's van de vijf overlappende sub-beelden (tegels) maakt gedetailleerde beeldvorming (5x objectief), met een algemene overview van de morfologie 29-30. Imaging intervallen tussen 3 en 10 minuten laten de gedetailleerde volgen van morfologische veranderingen 31 en het verwerven van kleine z-stacks (06:55 verschillende vlakken op een afstand van 30 pm) compenseert deel van de verdikking en draaien van het embryo 30 . Z-vliegtuigen met het hoogste contrast kan worden geselecteerd voor verdere verwerking 32 van de afzonderlijke frames in time-lapse filmpjes (zie de representatieve resultaten sectie voor meer informatie op de afbeelding acquisitie).

figure-protocol-1
Figuur 1: Het opzetten van de verzonken Filter Paper Sandwich. (A) Een ei wordt gekraakt in een petrischaal. (B) De meeste dikke en dunne albumine van de petrischaal met een plastic pipet verwijderd (niet getoond). Vervolgens wordt een venster in de dikke albumine creëerde eenrond de embryo door zachtjes weg te vegen de dikke albumine met een papieren zakdoekje. (C) Een filtreerpapier drager wordt geplaatst rond de blastoderm bovenop de dooier. (D) Het filtreerpapier drager is losgesneden van het omringende vitellinemembraan en (E) uit de bovenkant van de dooier. (F) De resterende dooier wordt zorgvuldig weggespoeld in een PC-zoutbad. (G) Het embryo is ingeklemd met een tweede identieke filterpapier carrier. (H) Het filtreerpapier sandwich is ondergedompeld in het medium en geplaatst op twee metalen roestvrij stalen ringen (embryo geconfronteerd dorsale of ventrale zijde naar boven). (I) Twee ringen stabiliseren sandwich van bovenaf. (J) De petrischaal met de embryo wordt overgebracht naar de temperatuurregeling oliebad. Roestvrij stalen ringen stabiliseren van de petrischaal zijwaarts. (K) Het kweekmedium wordt bedekt met een laag minerale olie.(L) Schematische voorstelling van de verzonken filter sandwich. (M) Afmetingen van het filterpapier dragers voor het ondergedompelde filtreerpapier sandwich. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 2: Morfologische Vergelijking tussen de embryo's in de EG-Culture 1 en in ondergedompelde Filter Paper Sandwich cultuur. Geselecteerde time-lapse frames tonen de embryo's in 3 uur intervallen. Frames worden verkleind tot een overzicht van de volledige embryomorfologie geven. Embryo's werden leeftijd gekoppeld aan de 7-somite fase (HH9) 15. 0 uur geeft het begin van elk experiment. Anterior is altijd aan de linkerkant. Beelden werden verkregen met behulp van donkerveld verlichting. (A) Embryo in EG cultuur 1, beschaafd ventrale kant naar boven op een agar-eiwit bodem 1,33. Hoge kwaliteit afbeeldingen kunnen worden verkregen, omdat de embryo opgesloten in de z-richting. (B en C) Twee embryo gekweekt in ondergedompelde filtreerpapier sandwich: (B) buikzijde en (C) dorsale kant naar boven.Embryo's in het filterpapier sandwich ontwikkelen zonder kwaliteitsverschillen ten minste 27 uur. Ze ontwikkelen functionele bloedcirculatie en craniale en cervicale buiging en zet met succes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Time-lapse acquisitie afhankelijk van het microscoopsysteem beschikbaar. In deze studie, een lange werkafstand, werd rechtop zoom microscoop gebruikt. De zoomfactor is ingesteld op 5X. In combinatie met de 16x vergroting van het oculair, resulteerde in 80x totale vergroting, met een theoretische resolutie van 1,3 um / pixel (zoals in de microscoop software) 30. Om de field-of-view te verhogen, werden embryo's afgebeeld als horizontale panorama's van de vijf sub-beelden (tegels). Daarom is een tegel gebied, bestaande uit vijf overlappende tegels, gedefinieerd 29. Deze tegel regiois gepositioneerd dat de elliptische opening van het filter papierdrager volledig te dekken in de horizontale lengte (Figuur 2B - 0 uur). Elke tegel heeft een afmeting van 2048 x 2048 pixels, die een field-of-view van ongeveer 2,7 mm en tegels werden met een overlapping van 10% verkregen, zodat de totale field-of-view van ongeveer 12 mm x 2,7 mm voor het panorama. De gemotoriseerde xy-stage bewogen ten opzichte van het doel met een snelheid van ongeveer 1,75 mm / sec tussen verwerving van de afzonderlijke tegels 29. Het live-beeld was gericht op de voorste presomitische mesoderm en de meest recent gevormde somieten (het onderzoek focus van onze groep). Ter compensatie van de verdikking en krullen van het embryo in de z-richting, werden kleine z-stacks (06:55 verschillende vlakken op een afstand van 30 pm) op elk tijdstip 30 verkregen. Deze werden geselecteerd rond het brandvlak van het voorste uiteinde van de presomitische mesoderm. De duur van de time-lapse ACQuisition werd ingesteld op 50 uur en beeldvorming intervallen van 3, 4 of 10 min werden gekozen 31. De kwaliteit van de time-lapse overname kan worden verbeterd door heroriëntering elke 5-10 uur en het herdefiniëren van de z-stack rond de nieuwe optimale focal plane. Na afloop van het experiment werd de hele tijdreeksen handmatig bewerkt en subsets van afbeeldingen met de z-vlak met de beste scherpstelling zijn gemaakt en opgeslagen in een aparte map 32. Deze subsets van beelden waren-time gestikt om een ​​complete tijdreeksen van beelden met optimale scherpstelling te creëren. De tegels van elk beeld van deze complete tijdreeksen werden gestikt en samengesmolten zonder schaduw correctie 30, en time-lapse frames werden geëxporteerd als JPEG-afbeeldingen van 100% van de grootte en 95% compressie 32. De time-lapse frames werden ingevoerd als een reeks afbeeldingen in professionele video-editing software. De gedetailleerde 100% zooms werden gestabiliseerd, en de algehele contrast werd aangepast naar onze smaak. De laatste tijd vervalt waren coderend met de H.264-codec en geëxporteerd in MPEG-4 containers. Films worden weergegeven op een framerate van 15 frames / seconde (fps) en een resolutie van 1920 x 1080 pixels.

Figuur 2 toont een vergelijking tussen een embryo in kweek EC 1 (figuur 2A) en twee embryo's in de verzonken filtreerpapier sandwich cultuur, waarvan een gekweekte ventrale zijde naar boven (figuur 2B) en de ander dorsale zijde naar boven (figuur 2C). Alle embryo's waren van vergelijkbare leeftijd de zeven somiet fase (HH9) 15 en afgebeeld met een tijdsresolutie van 4 min (figuur 2A en B) of 10 min (figuur 2C). Geselecteerde frames van 3 uur intervallen zijn weergegeven. De EC cultuur (Figuur 2A) toegestaan zeer stabiel beeldvorming als gevolg van de embryo rustend op een stabiele agar-eiwit bodem 1,33. De gehele embryo bleef in een focal plane overal thij hele time-lapse. Dit kan gunstig zijn voor korte experimenten (enkele uren) en vroege embryo's, maar het komt met een volledige opsluiting van het embryo in de z-richting mogelijk belemmeren de succesvolle driedimensionale ontwikkeling op lange termijn. In het begin, de opsluiting resulteerde slechts in een lichte zijdelingse afvlakking van het hoofd van de embryo's ten opzichte van een embryo gekweekt in ondergedompelde filtreerpapier sandwich met de ventrale zijde naar boven (vergelijk Figuur 2A en 2B op 0 uur). Later, het draaien van het hoofd werd aangetast (Figuur 2A - 21 uur) en de hartslag vertraagd. Bloedcirculatie bijna gestopt. Zie Aanvullende Movie 1 voor de volledige time-lapse van het embryo in de EG-cultuur. Het bovenste paneel in deze film geeft een volledig overzicht van het embryo, terwijl het paneel aan de linker visualiseert de ontwikkeling van het hart in volledige resolutie. De segmentatie van de presomitische mesoderm in somieten kan seen in detail op de lagere rechter.

Embryo's in de verzonken filtreerpapier sandwich, daarentegen, werden hun drie-dimensionale expansie beperkt door de natuurlijke spanning van de membranen rond hen. Ze konden gekweekt, ofwel met hun ventrale (Figuur 2B) of dorsale zijde naar boven (figuur 2C) zijn. Hoe dan ook, de embryo's toonde continue somitogenesis, en hun hoofden gedraaid. Ze ontwikkelden craniale en cervicale buiging en functionele bloedcirculatie. Beide embryo's in het filterpapier sandwich werden afgebeeld met de focus op het segmenteren mesoderm, zodat delen van het hoofd geleidelijk verplaatst onscherp als de embryo groeide, verdikt, en begon te draaien, terwijl het segmenteren van een deel van het mesoderm in focus bleef (vergelijk figuur 2B en 2C op 21 uur tot 27 uur). Aanvullende Movie 2 toont de complete time-lapse film van het embryo afgebeeldefiguur 2B. De imaging-interval 4 min. Het bovenste deel van deze film toont een volledig overzicht van de embryo. De ontwikkeling van het embryo werd achtereenvolgens afgebeeld op 46 uur, maar na ongeveer 30 uur, de focus op de segmentering mesoderm verloren door de algemene verdikking en draaien van het embryonaal weefsel. De linker paneel toont de vroege ontwikkeling van het hart in volledige resolutie van de verworven time-lapse frames. Door fusie van de gepaarde cardiale primordia aan beide zijden van de middellijn, is een nagenoeg rechte buisvormige structuur gevormd, die later begint te slaan en buigen naar rechts. De lagere rechter paneel toont de meest recent gevormde somieten en het voorste punt van de presomitische mesoderm in volledige resolutie en volgt de vorming van nieuwe somieten in de tijd. Aanvullende Movie 3 toont een andere embryo gekweekt en afgebeeld ventrale kant naar boven in de verzonken filterpapier sandwich. De imaging-interval 4 min. De film behandelt the ontwikkeling van het embryo van het podium HH5-6 tot ongeveer stadium HH14 15, over ongeveer 27 uur van de cultuur tijd. Het hoofd vouw vormen en zich ontwikkelt naar achteren. Het hart vormen van de bilaterale primordia, begint te slaan, en buigt naar rechts. De eerste 3-4 somieten vormen tegelijk. Extra somieten knop af achtereenvolgens uit de voorste punt van de presomitische mesoderm. Het onderste paneel toont het hoofd gebied van het embryo in volledige resolutie, zodat de controle van het hoofd vouwen en de vorming van de vroege hart in hoog detail. Door de transparantie van het embryo, kan het sluiten van de neurale buis wordt waargenomen in de toekomst kopgebied. Aanvullende Movie 4 displays formatie somite in dezelfde embryo in volledige resolutie over de volledige beeldvorming tijd in het onderste paneel. Aanvullende Movie 5 toont de complete time-lapse van het embryo gekweekte dorsale kant naar boven (figuur 2C). De imaging-interval 10 min. Terwijl de upper paneel toont de ontwikkeling van het embryo uit de zeven somiet fase (HH9) tot ongeveer HH16-17 fase, wordt het onderste paneel bijgesneden om de morfologische veranderingen in de vroege hersenen in dit stadium van volledige resolutie weergegeven. De lokale zwelling van de neurale buis kan worden waargenomen, waardoor de regionalisering van de voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen, die in een later stadium 13 zal verdelen in vijf deelgebieden van de embryonale hersenen. Daarnaast kan de groei van de optische vesicles duidelijk te zien. Na ongeveer 30 uur in de cultuur, wordt het embryo sterft.

De verenigbaarheid van de ondergedompelde filtreerpapier sandwich met microchirurgische manipulaties verschillende polystyreen microbolletjes vertonen (~ 40 pm in diameter) werden geïmplanteerd in of in de nabijheid van de presomitische mesoderm van een kippenembryo in de verzonken filtreerpapier sandwich cultuur. De microbolletjes werden gewassen in PBS om opslagbuffer en Implan verwijderented voorafgaand aan die het kweekmedium met de laag van lichte minerale olie (te vergelijken met stap 2.18 van de sectie protocol). Een glazen Pasteur pipet werd gebruikt om de parels te dragen aan de embryo oppervlak, onder observatie door de oculairs van de microscoop. Vijf gaten werden in het endoderm gecreëerd door zachtjes te schrapen met een acupunctuur naald. Een maat J-vormige hulpmiddel, door strekken en buigen van een glazen Pasteur pipet in een vlam, werd gebruikt om de kralen te manipuleren en druk ze zorgvuldig in de gaten tot ze immobiel geworden. Drie gaten werden gevuld met één kraal per stuk (figuur 3A - 0 uur en 3B *) en twee gaten met twee kralen per stuk (figuur 3A - 0 uur). Figuur 3A toont in geselecteerde time-lapse frames, de ontwikkeling van het kippenembryo na microchirurgische implantatie van de kralen. Drie korrels werden met succes opgenomen in het weefsel op de gewenste plaats, en de beweging werd afgebeeld viaTijdens het experiment in detail (figuur 3B). De ontwikkeling van het embryo niet lijken te worden beïnvloed door de manipulatie of de aanwezigheid van de korrels. Zie Aanvullende Movie 6 voor de full-time-lapse film. De imaging-interval 4 min.

figure-results-2
Figuur 3: Time-lapse Imaging na Microbead Implantatie. Proof-of-principle experiment met de verenigbaarheid van de ondergedompelde filterpapier sandwich met microbead implantatie. Het hoofd van het embryo is aan de linkerkant, maar het was niet tijdens dit experiment afgebeeld. Beelden werden verkregen met behulp van donkerveld verlichting. (A) De geselecteerde time-lapse frames met de gemanipuleerde embryo in 3 uur intervallen na de implantatie van zeven microbolletjes (~ 40 micrometer in diameter). De embryo langwerpig en continu gevormde aanvullende somites. Drie kralen lijken te zijn goed bevestigd en mediaal bewogen met het weefsel stroom over 18 uur van de cultuur. De andere vier kralen popped uit hun holen tussen 6 en 9 uur van cultuur en dreef naar achteren. (B) Gedetailleerde weergave van de drie enkele korrels (B1 tot B3) geïmplanteerd in de presomitische mesoderm aan het begin van het experiment (0 uur, B *) en na 12 uur incubatie (B **). Het nummer van de net-vormende somieten wordt aangegeven (S9 in B * en S18 in B **). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Aanvullende Movie 1: EC-cultuur Ventral Side Up. Embryo in EC cultuur 1, beschaafd ventrale kant naar boven, van de zeven somite fase (HH9) 15 verder op een agar-eiwit bottom 1,33. De imaging-interval 4 min. De relatieve tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek. Hoge kwaliteit afbeeldingen kunnen worden verkregen, omdat de embryo werd opgesloten in de z-richting. Na 21 uur werden de hartslag en de bloedstroom bijna gearresteerd en het embryo begon te desintegreren. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van het embryo, terwijl de onderste panelen visualiseren ontwikkeling van het hart (linker paneel) en de segmentatie van de presomitische mesoderm (rechter paneel) in volledige resolutie (100% zoom). (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-4
Aanvullende Movie 2: Ondergedompeld Filter Paper Sandwich Ventral Side Up. Embryo gekweekt in de verzonken papier sandwich van de zeven somite fase (HH9) 15 verder, ventrale side naar boven. De imaging-interval 4 min. De relatieve tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek in uren en minuten, opnieuw op te starten na 24 uur. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van de ontwikkeling van het embryo dan 46 uur achtereenvolgens. Het linker paneel visualiseert de vroege ontwikkeling van het hart tijdens de eerste 10 uur van het beeld overname in volledige resolutie (100% zoom). De lagere rechter paneel schildert segmenteren mesoderm gedurende ongeveer 30 uur van de ontwikkeling in volledige resolutie (100% zoom) tot focus is verloren als gevolg van de algehele verdikking en draaien van embryonaal weefsel. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-5
Aanvullende Movie 3: Head Fold Formation. Embryo gekweekte ventrale zijde naar boven in de verzonken filterpapier sandwich van de hijad-process / head-fold fase (HH5-6) 15 tot ongeveer 22-somite fase (HH14) 15 meer dan ongeveer 27 uur van de cultuur tijd. De imaging-interval 4 min. De relatieve tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek in h en min, opnieuw op te starten na 24 uur. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van de ontwikkeling van het embryo. Het onderste paneel toont het hoofd gebied van het embryo in volledige resolutie (100% zoom). De vorming van de kop vouw en vroegtijdige hart en de sluiting van de neurale buis kan worden waargenomen. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-6
Aanvullende Movie 4: Somitogenesis. Embryo gekweekte ventrale zijde naar boven in de verzonken filterpapier sandwich van het hoofd-proces / head-fold fase (HH5-6) 15tot ongeveer de 22-somite fase (HH14) 15 meer dan ongeveer 27 uur van de cultuur tijd. De imaging-interval 4 min. De relatieve tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek in h en min, opnieuw op te starten na 24 uur. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van de ontwikkeling van het embryo. Het onderste paneel toont de segmenteren paraxiale mesoderm in volledige resolutie (100% zoom). (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-7
Aanvullende Movie 5: Ondergedompeld Filter Paper Sandwich Dorsale Side Up. Embryo gekweekte dorsale kant naar boven in de verzonken filterpapier sandwich van de zeven somite fase (HH9) 15 tot ongeveer de HH16-17 stadium 15. De imaging-interval 10 min. De relatieve tijd wordt weergegevenin de linkerbovenhoek in uren en minuten, opnieuw op te starten na 24 uur. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van de ontwikkeling van het embryo. Het onderste paneel toont morfologische veranderingen in de vroege hersenontwikkeling in volledige resolutie (100% zoom). Het embryo overleden na ongeveer 30 uur in cultuur. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

figure-results-8
Aanvullende Movie 6: Microkralen geïmplanteerd. Embryo gekweekte ventrale zijde naar boven in de verzonken filterpapier broodje voor ongeveer 19 uur, te beginnen met de negen somite fase (HH9-10) 15. De imaging-interval 4 min. De relatieve tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek in h en min. Het bovenste paneel toont een gewijzigde overzicht van het staartgebied zeven microkorrels geïmplanteerd in de presomitic mesoderm. Het onderste paneel toont het gebied met geïmplanteerde microbolletjes in volledige resolutie (100% zoom). (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

Als een nieuwe variant van de gevestigde EC cultuur 1, de ondergedompelde filterpapier sandwich vergemakkelijkt de overname van de lange termijn helderveld en donkerveld time-lapse filmpjes van de vroege kippenembryo ex ovo door het maken van een temperatuur- en luchtvochtigheid gecontroleerde incubator rond de microscoop overbodig. In plaats gekweekt op een halfvast agar-eiwit bodem, worden de embryo lang volledig ondergedompeld in een eenvoudige kweekmedium bestaande uit PC-zoutoplossing en dunne albumen. Verdamping en warmteverlies geminimaliseerd door een laag minerale olie drijvende bovenop het kweekmedium. Embryo's kunnen gemakkelijk worden gekweekt, ofwel dorsale en ventrale zijde naar boven, zonder zichtbare kwaliteitsverschillen. Zoals hier getoond, embryo's in de verzonken filtreerpapier sandwich toegankelijk zijn microchirurgische ingrepen, zoals de toepassing van morfogeen geweekte korrels. Toekomstige toepassingen zijn onder meer live-fluorescentie beeldvorming, micro-injecties en elektroporatie, en gene silencing te manipulate en studie een breed scala van morfogenetische gebeurtenissen tijdens ventrale (bv vroege hart en somitogenesis) en dorsale (bv late gastrulatie, neurale buis sluiting, en het begin van de hersenen) ontwikkeling. Een tijdsafhankelijke medicatie is haalbaar als de petrischaal met het filterpapier sandwich wordt vervangen door een perfusie kamer, waardoor de uitwisseling van het kweekmedium onder de minerale olielaag. De ondergedompelde filterpapier sandwich zal zijn volledige potentieel beeldvorming in combinatie met de ontwikkeling van op laser gebaseerde beeldvorming (met inbegrip van light-sheet microscopie) en onderdompeling doelstellingen.

Sommige problemen met de voorbereiding van de ondergedompelde filterpapier sandwich zal in de volgende paragrafen worden aangepakt. Hoewel het vereist slechts een matige hoeveelheid training om een ​​embryo te brengen van de dooier in het filterpapier sandwich kunnen verschillende stappen steeds belangrijke invloed op de kwaliteit van de embryo in kweek. Voordat het filterpapier dragergeplaatst op de dooier moet de vitelline membraan rond het embryo worden bevrijd van elke dikke albumine. Pas dan wordt de verbinding tussen het filtreerpapier en de vitelline membraan sterk genoeg zijn om het wassen in PC-zoutoplossing weerstaan. Het filtreerpapier die het embryo zou de vloeistof / lucht-interface zo min mogelijk steken om de druk op de membranen minimaliseren. Eenmaal in de PC-zoutoplossing wassen gebracht, moet het gehele filter papierdrager geheel onder water blijven te allen tijde. De tijd in de PC-zoutbad moet worden beperkt tot ongeveer 30 - 60 sec, de vitelline membraan gaan loslaten van het filterpapier. Toch moet het schoonmaken van het embryo grondig worden uitgevoerd, zoals dooier restanten later zal bepalen het aanzicht van het embryo. Tijdens het wassen, nooit richt de stroom van de overdracht pipet rechtstreeks op het embryo, maar altijd radiaal weg van. Na het verwijderen van het embryo uit de PC-zoutoplossing, zorg ervoor dat het filterpapier horizontaal houdt te minimaliserenspanning op de embryonale membranen. Dan, het stabiliseren van de embryo met de tweede filter papier carrier. Zodra de tweede filterpapier drager geplaatst, voorkomen dat zijwaartse spanning, wat het filter papierschepen opzichte van elkaar kunnen verschuiven Scheur embryonale membranen. Wanneer het filtreerpapier sandwich in het kweekmedium wordt gebracht, moet het ook steek de lucht / vloeistof-grensvlak slechts eenmaal om de spanning op de membranen minimaliseren. Het tweede paar roestvast stalen ringen gebruikt om het filterpapier sandwich van boven stabiliseren moet langzaam worden geplaatst en zonder druk van compressie van de embryonale membranen minimaliseren. Kleine breuken van het gebied opaca van het embryo genezen meestal tijdens het eerste uur van de cultuur, maar een beschadigde embryo kan en moet altijd worden vervangen door een nieuw monster voor de olielaag gepipetteerd bovenop het kweekmedium.

Om het beeld een hele embryo of meerdere monsters voor hoge-resolutie time-lapse filmpjes, de microfoonroscope moeten worden uitgerust met een gemotoriseerde xy-fase, gecontroleerd door de microscoop software. Het is van cruciaal belang voor de xy-fase bewegen met een minimale snelheid om schade aan het embryo en turbulenties in het kweekmedium en de olie, die de beeldkwaliteit zal afnemen vermijden. Voor de overname van de time-lapse filmpjes hier gepresenteerde, de gemotoriseerde xy-podium bewoog zich met een snelheid van ongeveer 1,75 mm / sec. In de toekomst kan beeldvorming verder worden verbeterd door eerst het podium om de gewenste positie te verplaatsen en het verwerven van het beeld na een korte rustperiode te laten trillingen en turbulenties verdwijnen.

Als een beperking moeten potentiële gebruikers zich bewust zijn van de relatief lange werkafstand (ongeveer 1 cm) noodzakelijk deze kweekmethode als een rechtopstaande microscoop zonder onderdompeling doelstellingen wordt gebruikt. Deze werkafstand resultaten van de laag en medium van minerale olie bovenop het embryo. In de 6 cm Petrischaal, de olielaag een thickness van ongeveer 1-1,5 mm, en het embryo wordt ondergedompeld ongeveer 4 mm diep in het kweekmedium. Afhankelijk van de diameter van het doel, kan de bovenrand van de 6 cm Petrischaal ook toegang tot het embryo beperken. Dit kan omzeild worden door een grotere schaal.

De werkafstand van de top kan enigszins worden verminderd door het minimaliseren van de dikte van de vloeistof lagen. Bovendien kan de werkafstand van onderen worden geminimaliseerd door aanpassing van de embryo verder naar de bodem van de petrischaal en vermindering van de dikte van de beglazing van het verwarmde bekerglas. Terwijl het protocol werd geoptimaliseerd om te werken met een rechte lange werkafstand zoom microscoop kan worden gemonteerd op een omgekeerde microscoop ook. Toekomstige gebruikers moeten er rekening mee dat onder te dompelen het embryo te diep in het kweekmedium kan leiden tot O 2 -diffusion problemen te houden, hoewel voorlopige experimenten suggereren dat beperkte verspreiding lijkt niet een prob zijnlem, mits het embryo wordt omgeven door een voldoende groot reservoir kweekmedium en het filterpapier kern niet aan de bodem van de petrischaal gedrukt.

Een andere beperking is de temperatuurregeling. Door de temperatuur van de controller voor de verwarmde bekerglas tot 40 ° C, de temperatuur van het medium in evenwicht tot 37,5 ° C rond de embryo wanneer het medium wordt bedekt met minerale olie. Hieruit blijkt dat er energie verloren tussen de bodem van de beker, waarbij de verwarmingselementen en de temperatuursensor zich bevinden en de locatie van het embryo. De temperatuurregeling kan worden geoptimaliseerd door het verplaatsen van de sensor en herverdelen van de verwarmingselementen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen financiële steun van een ZonMW-VICI subsidie ​​918.11.635 (Nederland). De auteurs willen graag het gereedschap winkel van de Vrije Universiteit Amsterdam bedanken voor hun praktische suggesties en voor de productie van de installatie componenten en Jarno Voortman van Carl Zeiss Nederland voor nuttig advies over microscopie. Marjolein Blaauboer was een grote steun in kritisch commentaar op verschillende ontwerpen van het manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Milli-Q Reference Water Purification SystemMilliporeZ00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 LSigma-Aldrich/DuranZ305200-10EA 
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Oplossing A
NaClMerck Millipore1064041000
KClMerck Millipore1049361000
CaCl2·H2OMerck Millipore1023821000
MgCl2·6H2OMerck/Sigma-Aldrich13152-1KG-D 
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Oplossing B
Na2HPO4·2H2OMerck1065801000
NaH2PO4·2H2OMerck1063420250
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Whatman kwalitatief filterpapier, Grade 595Sigma-Aldrich10311611
Lasersnijmachine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, golflengte 10,6 µmMicro Lasersystems
Tork Extra Soft gezichtsweefselsTork140280
Latex handschoenenSigma-AldrichZ645613
EMDAMEDEMDA 300.131
Transfer pipettenSigma-AldrichZ350613
VWRWITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette ControllerBrandTech Scientific26332
Serologische plastic pipetten, 25 mlSigma-AldrichCLS4251
Kunststof documenthoezen
Ei-incubator - Incubator mod. Cip Cip 40Fiem
Bevruchte kippen eieren (Gallus gallus)Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm weefsel kweek schalenSigma-AldrichP5731
Greiner Bio-one664160
6 cm Petri schotelsSigma-AldrichP5481
50 ml Centrifugebuizen, Greiner centrifugebuizen of Cellstar buizenSigma-AldrichT2318
greiner bio-one227261
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Roestvrijstalen ringen, op maat gemaakt
Grote ringen, 30 mm buitendiameter, 4 mm hoog, 1,5 mm wanddikte
Kleine ringen, 20 mm buitendiameter, 4 mm hoog, 1,5 mm wanddikte, 6,5 mm opening in de ring
Naaldenschaar
Pincet, Dumont #5, InoxFine Science Tools, F.S.T.11251-20
Fijn, heel scherp schaar voor het snijden van filterpapierVWR21-102
M3516 Sigma-Aldrich Minerale OlieSigma-AldrichCAS Nummer 8042-47-5
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarbodems voor EC kweek
AgaroseSigma-AldrichA9539 SIGMA
NaClSigma-AldrichS7653 SIGMA-ALDRICH
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microbead implantatie
Polybead Sampler Kit III (45 µm kralen werden gebruikt)Polysciences, Inc.16905-1
Naaldpunternaalden: type J, No.02, 0.12x30 mmSEIRIN type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023 
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Temperatuur gecontroleerde beker
RTD Temperatuur Sensor met M4 Draadhuisvesting RTD-850MOmegaRTD-850M
Hermetisch afgedichte RTD Sensoren HSRTD-3-100-A-3MOmegaHSRTD-3-100-A-1M
Thermistor en RTD Verlengdraad EXTT-3CU-26S-50OmegaEXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectoren voor Thermokoppels, 3-draads RTD's en Thermistors MTP-U-MOmegaMTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Geïsoleerde Flexibele Verwarmers KHLV-103/(10)-POmegaKHLV-103/(10)-P
Temperatuur/Proces Controller CNi16D24-C4EIT-DC

Referenties

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15(2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154(2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429(2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
  30. Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
  31. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
  33. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Herprints en machtigingen

Tags

Ex ovo kippenembryoondergedompelde kweekminerale olie-overlaytemperatuurgecontroleerd badlichtmicroscopiemorfogenetische gebeurtenissengastrulatieneurulatiesomitogenesehartvorming
Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn Ex Ovo Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.