Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een techniek om specifieke celpopulaties te zuiveren op basis van fenotypes gedetecteerd door stromacytometrie. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de kenmerken van een enkele celpopulatie beter te begrijpen zonder de invloed van andere cellen. In vergelijking met andere methoden van celverrijking, zoals magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS), is FACS flexibeler en nauwkeuriger voor celscheiding vanwege de mogelijkheid van fenotypedetectie door stromacytometrie. Bovendien is FACS meestal in staat om meerdere celpopulaties gelijktijdig te scheiden, wat de efficiëntie en diversiteit van experimenten verbetert. Hoewel FACS enkele beperkingen heeft, wordt het op grote schaal gebruikt om cellen te zuiveren voor functionele studies in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van fluoresctie-geactiveerde celsortering om een zeer zeldzame populatie immuuncellen, plasmacytoïde dendritische cellen (pDC), met hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-geachte muizen voor in vitro functionele studies van pDC.
Inleiding
Efficiënte scheiding van een celpopulatie naar keuze van andere cellen maakt studies van de populatie mogelijk die anders misschien niet mogelijk zijn. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode om een interessante celpopulatie met hoge zuiverheid te verrijken. 1,2 Verschillende celtypen drukken meestal unieke moleculen uit, of een unieke combinatie van verschillende moleculen, op het plasmamembraan die één celpopulatie van een andere kunnen onderscheiden. Bij binding van deze celoppervlaktemoleculen door specifieke fluorescentie-geconjugeerde antilichamen, is een detectieapparaat genaamd flowcytometer/sorteerder in staat om de lichtsigna....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / LPR) lupus vatbaar voor muizen werden gekweekt en onderhouden in een specifiek pathogeen-vrije faciliteit volgens de eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd onder IACUC protocol # 12-062.
1. celkweekmedium en sorteren Buffer
- Bereid volledig celkweekmedium (C10) gebruikt RPMI 1640 aangevuld met 10% foeta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gericht op het verrijken van beenmerg pDC met een hoge zuiverheid, en zonder de invloed van andere celtypen, van MRL / lpr lupus vatbaar voor muizen van jong en oud leeftijd om de functionele veranderingen van pDC met betrekking tot hun vermogen om IFNa produceren studeren. De eerste zuiveringsstrategie gebruikt was MCS, die zoals figuur 1 toont, leidde tot slechts 7,75% zuiverheid na de verrijking. Vergeleken met MCS, FACS verrijkt pDC met zuiverheid zo hoog als 96,4.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is voor de zuivere verrijking van levende pDC die het vermogen behouden om IFNα te produceren. De toepassingen van dit protocol omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de zuivering van pDC en/of andere mononucleaire cellen uit het beenmerg van MRL/lpr en andere muizenstammen voor studies van cellulaire en moleculaire functies. Verschillende cruciale stappen in dit protocol zijn om een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van de gesorteerd pDC te waarborgen. De eerste bel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Dankbetuigingen
Wij danken het Flow Cytometry Laboratory aan het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine voor het gebruik van de flow cytometry core facility. Dit werk werd ondersteund door de opstartfondsen van XML. XL is een Stamps Fellow in het Biomedical and Veterinary Sciences graduate programma.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetaal bovien serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Natriumpyruvaat | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM niet-essentiële aminozuren | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicilline-Streptomycine | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Rode bloedcel (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Dichtheidsgradiënt medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-muis CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-muis CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-muis CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-muis PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-muis B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritische Celisolatie Kit II, muis | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva versie 6 | BD Biosciences |
Referenties
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Sta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
