Methodenartikel

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

DOI:

10.3791/54641

⸱

4 november 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een techniek om specifieke celpopulaties te zuiveren op basis van fenotypes gedetecteerd door stromacytometrie. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de kenmerken van een enkele celpopulatie beter te begrijpen zonder de invloed van andere cellen. In vergelijking met andere methoden van celverrijking, zoals magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS), is FACS flexibeler en nauwkeuriger voor celscheiding vanwege de mogelijkheid van fenotypedetectie door stromacytometrie. Bovendien is FACS meestal in staat om meerdere celpopulaties gelijktijdig te scheiden, wat de efficiëntie en diversiteit van experimenten verbetert. Hoewel FACS enkele beperkingen heeft, wordt het op grote schaal gebruikt om cellen te zuiveren voor functionele studies in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van fluoresctie-geactiveerde celsortering om een zeer zeldzame populatie immuuncellen, plasmacytoïde dendritische cellen (pDC), met hoge zuiverheid te isoleren uit het beenmerg van lupus-geachte muizen voor in vitro functionele studies van pDC.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efficiënte scheiding van een celpopulatie naar keuze van andere cellen maakt studies van de populatie mogelijk die anders misschien niet mogelijk zijn. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode om een interessante celpopulatie met hoge zuiverheid te verrijken. 1,2 Verschillende celtypen drukken meestal unieke moleculen uit, of een unieke combinatie van verschillende moleculen, op het plasmamembraan die één celpopulatie van een andere kunnen onderscheiden. Bij binding van deze celoppervlaktemoleculen door specifieke fluorescentie-geconjugeerde antilichamen, is een detectieapparaat genaamd flowcytometer/sorteerder in staat om de lichtsignalen van verschillende fluorescerende kleurstoffen die verschillende molecuulmarkers op de cellen vertegenwoordigen op het niveau van een enkele cel te exciteren en te detecteren. De gecombineerde informatie die bestaat uit ofwel de aanwezigheid van een lichtsignaal (dat een positieve expressie van het corresponderende oppervlaktemolecuul vertegenwoordigt) of de afwezigheid van een lichtsignaal (dat een negatieve expressie van een molecuul vertegenwoordigt) definieert het fenotype van de cel. Na het passeren door de detector, worden cellen met hetzelfde fenotype van belang omgeleid naar een aangewezen opvangbuis op basis van elektrische lading.

FACS wordt breed toegepast in verschillende studies zolang de te verrijken populatie met fluorescentie is gelabeld.3-7 Het is gebruikt om immunoglobuline (Ig)A-gecoate bacteriën van niet-IgA gecoate bacteriën in de darmmicrobiota te scheiden 8 en genetisch gemodificeerde celpopulaties die fluorescente eiwitten uitdrukken te sorteren. 9 Belangrijk is dat het de capaciteit heeft om meer dan één populatie tegelijkertijd te scheiden, wat niet alleen tijd en reagentia bespaart, maar ook meer geavanceerde ontwerpen van studies mogelijk maakt. 10 Echter, FACS heeft ook zijn beperkingen. Als een populatie van belang erg zeldzaam is (minder dan 1%), kan de sorteerefficiëntie verminderd zijn, wat aanzienlijke celverliezen veroorzaakt. Bovendien kan sommige antilichaambinding intracellulaire signaaltransductie activeren die functionele veranderingen van de gesorteerd celpopulatie induceert. 11 Daarom moet het fenotype dat voor het sorteren wordt gebruikt zorgvuldig worden geselecteerd.

Er bestaan andere methoden naast FACS die ook gebaseerd zijn op celoppervlaktemarkers voor de verrijking van specifieke celpopulaties, zoals magnetische-geactiveerde celsortering (MCS). 12 Net als bij FACS, kunnen met magnetische kralen geconjugeerde antilichamen specifieke celoppervlaktemoleculen targeten. Na antilichaam-antigeen interactie, kunnen met magnetische kralen gecoate cellen worden gescheiden van niet-gecoate cellen na het passeren door een magnetisch veld. Echter, slechts een beperkt aantal moleculen kan worden gericht in MCS, aangezien magnetische kralen, in tegenstelling tot verschillende fluorescerende kleuren in FACS, niet onderscheidbaar zijn. Het is dus moeilijk voor MCS om een celfenotype met een gecompliceerde combinatie van oppervlaktemarkers te definiëren. 13,14 Bovendien is MCS ook in staat om onbedoelde activering van doelcellen te veroorzaken.

In onze studies van een muismodel van systemische lupus erythematosus (SLE), 15 waren we van plan plasmacytoide dendritische cellen (pDC) te zuiveren om hun functionele veranderingen bij ziekteprogressie te onderzoeken. We gebruikten eerst MCS om pDC uit het beenmerg te verrijken door PDCA-1 te targeten, een molecuul dat hoog en uniek wordt uitgedrukt op muis pDC in stabiele toestand. 16 Echter, de celzuiverheid was onverwacht laag, waarschijnlijk als gevolg van de opregulatie van PDCA-1 op andere celpopulaties in een inflammatoire omgeving zoals SLE.16 Uiteindelijk hebben we FACS gebruikt met een combinatie van vier oppervlaktemarkers (CD11c, CD11b, B220 en PDCA-1) om hoogzuivere pDC te scheiden als CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ populatie. Muis pDC heeft een andere specifieke oppervlaktemarker Siglec-H. We besloten Siglec-H niet te gebruiken, omdat antilichaambinding van dit molecuul de functie van pDC om IFNα te produceren onderdrukt. 11

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / LPR) lupus vatbaar voor muizen werden gekweekt en onderhouden in een specifiek pathogeen-vrije faciliteit volgens de eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd onder IACUC protocol # 12-062.

1. celkweekmedium en sorteren Buffer

  1. Bereid volledig celkweekmedium (C10) gebruikt RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM natriumpyruvaat, 1% 100 MEM niet-essentiële aminozuren, 10 mM HEPES, 55 pM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 100 U / ml penicilline-streptomycine.
  2. Bereid sorteren buffer (HBSS-vol) met behulp 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml runderserumalbumine,0,05 mM MgCl2 en 0,2 U / ml DNase I.

2. Mouse Dissection

  1. Bereid twee 6-cm diameter gerechten met 4 ml C10. Leg de gerechten op ijs.
  2. Euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie.
  3. Oogst de milt en bewaar het op een schotel met C10 op het ijs.
    1. Speld de muis naar beneden met de buik naar boven gericht op de dissectie plaat. Steriliseer het lichaam door sproeien van 70% ethanol.
    2. Snijd de huid en scheiden de huid van de spier muur onder langs de ventrale middellijn van de symfyse aan de nek.
    3. Snijd de huid langs de achterpoot van het eerste incisie aan de enkel.
    4. Speld de huid weer aan de zijkanten en snijd de spier muur langs de zijkanten van de eerste incisie plaats om middenrif.
    5. Speld de spierwand weer aan de rechterzijde van het hoofd.
    6. Zoek de milt aan de rechterzijde van de muis onder de dunne darm en aan de maag. Pick-up de ene kant van The milt en scheiden van de maag.
  4. Snijd beide achterpoten, onder meer bovenbeen en onderbeen, en verwijder alle spieren zo veel mogelijk.
    1. Snijd de spieren langs de achterpoot van het bekken / heupgewricht aan de enkel met een scherpe schaar, proberen om de bloedvaten te voorkomen.
    2. Scheid de achterste ledematen door te snijden in het bekken / heupgewricht en de enkel / voet joint zonder de blootstelling van de inhoud van het beenmerg.
    3. Schone resterende spieren aan de botten door krassen met een scheermes herhaaldelijk snijden van de spieren aan de gemeenschappelijke punten.
  5. Houd de botten in een 6 cm schaaltje met 4 ml C10 op ijs. Ga verder met het ontleden van de volgende muis.

3. splenocyten Isolation

  1. Homogeniseer de milt voorzichtig met een zuiger tegen een 70-um zeef cel boven het schaaltje met 4 ml C10 totdat er geen rode stukken zijn toegankelijk.
  2. Voeg extra 6 ml C10 in de schaal door de zeef van eennd vervolgens over de totale 10 ml celsuspensie aan een 15 ml conische buis.
  3. Centrifugeer de conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
  4. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml 1 x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  5. Na incubatie gecentrifugeerd conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
  6. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml C10. Gooi alle grote klonten (dode cellen) en hou de buis op ijs voor later.
    LET OP: Als er veel kleine groepjes, gebruik maken van een 70-um cel zeef aan de celsuspensie een keer te filteren.
  7. Tel het aantal cellen met trypan blauw met behulp van een geautomatiseerde cel teller.

4. Bone Marrow Cell Isolation

  1. Breng de botten met 4 ml C10 in een vijzel en voeg 6 ml C10 tot een volume van 10 ml in totaal C10 maken.
  2. Crack de botten voorzichtig in de mortel met behulp van apEstle.
  3. Roer voorzichtig met de stamper naar het beenmerg vrij in C10.
  4. Breng de ml C10 10 met beenmerg in een 50 ml conische buis op ijs door een 70-um cel zeef. Voeg 10 ml vers C10 in de mortel nog met de botten.
    LET OP: Pipette de oplossing die het beenmerg en neer meerdere malen voor het passeren van de zeef als rode klonten zichtbaar zijn.
  5. Herhaal stap 4,2-4,4 keer. Na de laatste wasbeurt, moet de botten verschijnen wit.
  6. Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. Bereid ondertussen 5 ml kant-en-klare dichtheidsgradiënt medium in een 15 ml conische centrifugebuis bij kamertemperatuur.
  7. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml C10.
  8. laag langzaam de 10 ml celsuspensie bovenop de 5 ml medium dichtheidsgradiënt, handhaven duidelijk grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer de 15 ml conische buis bij 1363 g gedurende 30 minuten bijRT (20 ° C) met versnelling set als 9 en vertraging ingesteld op 0 (of Brake OFF).
  9. Na centrifugeren verwijdert de bovenste 8 ml oplossing voorzichtig en laat de 2 ml buffy coat bij de interface (een laag van mononucleaire cellen) in een nieuwe 15 ml conische buis.
  10. Voeg 12 ml ijskoud C10 de 15 ml conische buis met beenmerg mononucleaire cellen, cap en keer herhaaldelijk goed te mengen, centrifugeer de buis bij 800 xg gedurende 10 min, 4 ° C.

5. celoppervlak kleuring voor FACS

  1. sample kleuring
    1. Bereid anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing (1 tot 100 verdunning in HBSS vol, 5 ug / ml eindconcentratie).
    2. Na centrifugatie in stap 4,10, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 gl anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing Fc-receptor op de mononucleaire cellen. Incubeer op ijs gedurende 10 min.
    3. Bereid fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel (anti-muis CD11c-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning en anti-muis B220-V500 1:40 verdunning in HBSS- full zoals aanbevolen door de fabrikant aan 100 gl eindvolume per monster).
      NB: Het is belangrijk om antilichamen te titreren voor gebruik.
    4. Na 10 min incubatie in stap 5.1.2, voeg 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C ongebonden anti-muis CD16 / 32 te verwijderen.
    5. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten in het donker.
    6. Na 15 minuten incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C om ongebonden fluorescentie-geconjugeerde antilichamen te verwijderen.
    7. Bereid FACS laden oplossing (500 ng / ml DAPI in HBSS-vol).
    8. Na centrifugatie in stap 5.1.6, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 μ; L FACS laden oplossing. Breng de celsuspensie in een 12 x 75 mm met ronde bodem buis (FACS buis) en hou de buis op ijs in het donker totdat het sorteren binnen 1 uur.
  2. Kleuring voor compensatie
    1. Label 6 FACS buizen als PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI of ongekleurd. Aliquot splenocyten van 1 x 10 6 cellen / buis in de FACS buizen en wassen met 4 ml HBSS vol bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C.
      LET OP: Het gebruik van DNA-bindende fluorescentie kleurstof, DAPI, om levende cellen te onderscheiden van dode cellen. DAPI kan passeren de plasmamembraan van dode cellen (maar niet die van levende cellen) en bind chromosoom DNA.
    2. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui HBSS vol.
    3. In elke overeenkomstige FACS buis, voeg een van de volgende antilichamen: anti-muis CD19-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning of anti-muis B220-V500 1:40 verdund zoals aanbevolen door de manufacturer. Laat de 5 e (DAPI) en 6e (ongekleurd) FACS buizen zoals ze zijn. Meng goed door schudden en incubeer de FACS buisjes op ijs in het donker gedurende 15 min.
    4. Na incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS-full in elke buis en centrifugeer de FACS buizen bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
    5. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 ul ijskoud HBSS vol behalve de pellet in de buis gemerkte DAPI, welke wordt geresuspendeerd in 500 pi FACS beladingsoplossing. Het houden van alle 6 buizen op ijs in het donker totdat het sorteren.

6. sorteren op de Cell Sorter

LET OP: De werking van het sorteren procedure op de cytometer en de software is gestandaardiseerd met een gedetailleerde instructies geleverd door het bedrijf. In het kort, maken we gebruik van 100 micron nozzle bij 20 psi, stelt doelcel concentratie tussen 5-10000000 per ml, en efficiëntie aan te passen tot 70% of hoger (dat wil zeggen, conflicten gehouden onder 30%).

  1. Bereid collectie FACS buizen met 500 ul FBS / buis met 100 U / ml penicilline-streptomycine.
  2. Pas compensatie parameters van de cel sorter met behulp van single-vlek compensatie buizen uit stap 5.2.
    1. Noteer 10.000 cellen in ongekleurd buis negatieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit.
    2. Noteer 10.000 cellen in andere vergoeding single-vlek buizen om positieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit.
      NB: De software berekent automatisch de compensatie parameters.
  3. Met een monster van stap 5.1 tot de poorten van de gesorteerde celpopulaties ingesteld door registratie 3000 cellen. Middels fluorescentie-intensiteit als parameters X en Y-as grafiek poort doelwitcelpopulatie handmatig een groep punten kennelijk gescheiden van andere punten.
    LET OP: Deze venstertijd set is flexibel en willekeurig op basis van de eisen van de onderzoekers. Als onderzoekers verwachten hogere zuiverheid op basis van één of meer markers, verplaats de gatehoger gebaseerd op de bijbehorende fluorescentie-intensiteit.
  4. Laad een verzameling buis en beginnen met de doelcel populatie sorteren.
  5. Houd de collectie buis op ijs na sortering totdat alle monsterbuizen worden gedaan.
  6. Voeg ijskoud C10 aan de collectie buis tot 4 ml, cap en zwenken om te mengen.
  7. Centrifugeer de verzamelbuis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C, en zuig de supernatant, waardoor ongeveer 200 pi met celpellet onaangeroerd.
  8. Voeg 1 ml ijskoud C10 aan de cel pellet te resuspenderen en de overdracht van alle celsuspensie in een 1,5 ml centrifugebuis.
  9. Centrifugeer de 1,5 ml buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C en zuig de supernatant, waardoor 100 pi met de celpellet onaangeroerd.
  10. Bewaar de gesorteerde celpopulaties op ijs tot gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gericht op het verrijken van beenmerg pDC met een hoge zuiverheid, en zonder de invloed van andere celtypen, van MRL / lpr lupus vatbaar voor muizen van jong en oud leeftijd om de functionele veranderingen van pDC met betrekking tot hun vermogen om IFNa produceren studeren. De eerste zuiveringsstrategie gebruikt was MCS, die zoals figuur 1 toont, leidde tot slechts 7,75% zuiverheid na de verrijking. Vergeleken met MCS, FACS verrijkt pDC met zuiverheid zo hoog als 96,4...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is voor de zuivere verrijking van levende pDC die het vermogen behouden om IFNα te produceren. De toepassingen van dit protocol omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de zuivering van pDC en/of andere mononucleaire cellen uit het beenmerg van MRL/lpr en andere muizenstammen voor studies van cellulaire en moleculaire functies. Verschillende cruciale stappen in dit protocol zijn om een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van de gesorteerd pDC te waarborgen. De eerste bel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Flow Cytometry Laboratory aan het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine voor het gebruik van de flow cytometry core facility. Dit werk werd ondersteund door de opstartfondsen van XML. XL is een Stamps Fellow in het Biomedical and Veterinary Sciences graduate programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetaal bovien serumHyCloneSH30396.03
Natriumpyruvaatgibco by life technologies11360-070
MEM niet-essentiële aminozurengibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutamine gibco by life technologies25030-164
Penicilline-Streptomycinegibco by life technologies15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution gibco by life technologies14175-079
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
Rode bloedcel (RBC) lysis buffer eBioscience00-4300-54
Dichtheidsgradiënt mediumGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
anti-muis CD19-PEBD Pharmingen553786
anti-muis CD11c-PEeBioscience12-0114-82
anti-muis CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
anti-muis PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
anti-muis B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Plasmacytoid Dendritische Celisolatie Kit II, muisMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer BD Biosciences643178
BD FACS Diva versie 6BD Biosciences

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959(2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

Gerelateerde artikelen