Dit manuscript beschrijft een chirurgisch model bij ratten van pyelonefritis door directe intra-renale infectie met Escherichia coli in de nierbekken. De experimentele procedure kan worden gebruikt om de pathogenese van pyelonefritis te bestuderen, evenals de geassocieerde ontsteking en fibrose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intrarenale injectie van Escherichia coli In een Rat Model van Pyelonefritis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pyelonefritis is een bacteriële infectie van de nier en wordt meestal veroorzaakt door Escherichia coli. Recidiverende infecties kunnen significante ontsteking en fibrose van de nieren veroorzaken, wat uiteindelijk leidt tot een afnemende nierfunctie. Voordat een verbeterde klinische behandeling en preventie van pyelonefritis kan worden ingevoerd, moet een betrouwbaar diermodel worden vastgesteld om de mechanismen van progressie, recidief en therapeutische werkzaamheid te bestuderen. Het transurethrale infectiemodel bootst pyelonefritis bij mensen na, maar vertoont aanzienlijke variatie vanwege de afhankelijkheid van urethrale reflux om de bacteriën naar de nier te transporteren. Hierin wordt een gedetailleerd chirurgisch protocol voor het uitvoeren van bacteriële injecties in de nierpelvis van de rat gepresenteerd en bevestigd door niet-invasieve magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Met behulp van dit protocol krijgen dieren directe blootstelling aan een gewenste concentratie van E. coli bacteriën en kunnen ze volledig herstellen van de chirurgische ingreep met voldoende postoperatieve zorg. Dit vergemakkelijkt vervolgens longitudinale MRI-beoordelingen van de experimentele diermodellen voor vergelijking met saline (sham) controles. Met behulp van deze directe toedieningsmethode is de ernst van de infectie controleerbaar en toepasbaar voor mechanistische studies van progressie evenals de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën.
Inleiding
Knaagdierenmodellen zijn gebruikt om talrijke mensenziekte manifestaties te bestuderen, waaronder pyelonefritis en urineweginfecties (UTI). UTI's zijn een wereldwijd gezondheidsprobleem, en kunnen invloed hebben op kinderen, mannen en vrouwen van alle leeftijden. 1 , 2 , 3 De initiële manifestatie van UTI's omvat cystitis, en als de infectie langs de ureter stijgt, kan een nierinfectie (pyelonefritis) volgen. Tegelijkertijd benadert de prevalentie van diabetes wereldwijd 400 miljoen mensen. 4 , 5 Het is belangrijk dat de incidentie van UTI maximaal 4 keer hoger is bij patiënten die obesitas hebben of diabetes mellitus 2 hebben, wat resulteert in een verhoogd risico op recidiverende UTI-infectie (RUTI), sepsis, nierfibrose van pyelonefritis en blaasdisfunctie. 6 , 7 , 8 KnaagdierModellen zijn belangrijk bij het bestuderen van UTI's, omdat de huidige antibiotica therapieën alleen een onderbroek van UTI-patiënten een blijvende, preventieve respons geven. Om de klinische UTI-zorg te verbeteren, zijn de belangrijkste stappen om het mechanisme van RUTI en zijn pathofysiologische processen te begrijpen van acute infectie tot ontsteking op fibrose, evenals de impact van type 2 diabetes mellitus.
Het doel van het verbeteren van diermodellen is het ontwikkelen van technieken die een nauwkeuriger evaluatie van ziekteprogressie en therapeutische interventies mogelijk maken. Verschillende verschillende benaderingen zijn toegepast om pyelonefritis bij ratten en / of muizen te stimuleren om de pathofysiologie van nierbeschadiging, het effect van antibiotische behandeling en andere aspecten van de natuurlijke gang van UTI's te bestuderen. Een gemeenschappelijke aanpak om retrograde UTI te bepalen is transurethrale catheterisatie. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Deze methode introduceert bacteriën via de urethra in de urine blaas van verdovende dieren. Hoewel deze techniek de menselijke pyelonefritis simpel simuleert, kan de feitelijke incidentie en omvang van de infectie van pyelonefritis zeer variabel zijn door meerdere factoren, waaronder een gebrek aan spontane ureterische reflux of urinevervuiling tijdens of direct na de inenting. 11 Als gevolg daarvan kan de experimentele variabiliteit bij het induceren van een stijgende pyelonefritis-infectie het nut van dit model beperken om nierinfecties en therapeutische strategieën te bestuderen.
Dit rapport beschrijft een chirurgisch pyelonefritis rat model waar E. coli direct in de rat nier wordt geïnjecteerd. Ondanks dat dit ratmodel invasieve is, kan de hoeveelheid E. coli die aan de nier wordt afgegeven effectief worden gecontroleerd waardoor een robuuste nierinfectie en ontsteking kan worden veroorzaakt. 14 In deze procedure beschrijven we ookHoe deze geïnduceerde nierinfecties langzamer kunnen worden bewaakt met in vivo magnetische resonantiebeeldvorming (MRI).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierstudies werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocols van de Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) bij Case Western Reserve University. De duur van de hierna beschreven chirurgische procedure bedraagt ongeveer 45-60 minuten. De MRI-procedure zelf is ongeveer 15 minuten voor elk tijdstip.
1. Verdoving
- Verdoof de ratten in de isofluranekamer die is ingesteld op 2% isofluraan gemengd met zuurstof om dierhantering en terughouding te vergemakkelijken alvorens de injecteerbare anesthesie intraperitoneel toe te dienen.
- Na 3-5 minuten van de blootstelling aan isofluraan, controleer of het dier verdoofd is en geen reactie op de klieren heeft.
- Verdere sedatieve rat met een intraperitoneale injectie van een mengsel van xylazine en ketamine: 75 mg / kg ketamine / 10 mg / kg xylazine. Bij het uitvoeren van intraperitoneale injecties trekt u de naald om ervoor te zorgen dat de delen van de darm of andere vitale organen niet zijn gebogen.
- ikSubcutaan 2 mg / kg bupivacaïne op de snijplaats plaatsen om actuele pijnverlichting te bieden.
2. Bereiding van het chirurgische gebied
- Steriliseer chirurgische instrumenten en benodigdheden voordat ze worden gebruikt voor een operatie en leg uit op de chirurgische pad voor steriliteit. De meeste instrumenten en benodigdheden kunnen worden geautoclaveerd en opnieuw gebruikt.
- Gebruik steriele handschoenen voor alle chirurgische procedures.
- Gebruik een elektrische scheermes om de vacht van de rechterkant van het dier af te scheren. Scheer het dier van de bodem van de ribbeenkast naar de bovenkant van het achterbeen en zorg voor een groot haarvrij gebied voor de incisie.
- Plaats het dier op een steriel chirurgisch pad om het desinfecteerde gebied van de omliggende gebieden te isoleren.
- Schrob de huid met een ontsmettingsmiddel zoals povidonjodium of betadine. Begin het schrobben in het midden van de chirurgische plaats en ga circulair naar buiten toe. Herhaal minstens drie keer met een nieuwe veeg van povidonjodium of betadine.
- Schrob de chirurgische plaats met 70% alcoholwatten tot de huid helder is, aangezien jodium giftig kan zijn indien geabsorbeerd.
3. Chirurgische procedure
- Onderhoud deze procedure onder aseptische omstandigheden.
- Plaats het verdovende dier op een warm verwarmingsbed in de linker zijdelingse decubituspositie met de rechter flank naar boven gericht.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de lichaamstemperatuur van het dier bij 35-37 ° C wordt gehandhaafd om hypothermie te voorkomen. Dit opwarmen bed dient ook te worden gesteriliseerd om de aseptische omstandigheden te behouden. - Voel voor de ribbeugel en maak een kleine 2-3 cm rechter dorsale retroperitoneale incisie met een steriele maat 10 scalpelblad beginnend aan de onderkant van de ribbeugel.
- Plaats het steriele gaas langs de weerszijden langs beide kanten van de insnijding.
- Verwijder het subcutane weefsel, vet en spieren om de buikholte te visualiseren en toegang te krijgen. Gebruik gebogenbladige Mayo-scharen om dieper in te drijvenRantsoen in wond en snijd dikke weefsels.
- Zodra de lever duidelijk zichtbaar en toegankelijk is, gebruik dan stompe tang om de lever naar boven te trekken.
- Gebruik nog een paar stompe tangen in de andere kant, bloot de juiste nier zodat het net buiten de buikholte zit.
- Gebruik de aanwijzer vinger en duim van de linkerhand om de nier in positie te houden. Met de rechterhand, injecteer langzaam en gestaag 0,1 ml UTI89 E. coli oplossing (concentratie tussen 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) van een steriele injectiespuit in het nierbelk (dat verschijnt als een witte bubbel) 15 .
OPMERKING: Bereid de bacterietiter zoals beschreven in referentie 15 . - Plaats een strook absorbeerbare hemostat over de naald om te voorkomen dat het inoculum in het peritoneum komt. Trek de naald langzaam uit het nierbelk.
OPMERKING: Zorg moet worden genomen om geen omliggende weefsels door te brengen of te infecteren, wat resulteert in off-target infectiOns en / of complicaties. - Gebruik een grotere spuit om de nier grondig te spoelen met normale zoutoplossing voordat u deze terug in de buikholte plaatst.
4. hechtingen
Opmerking: Sutuur die in weefsels wordt begraven, moet 4-0 niet-absorbeerbare gevlochten hechtingen zijn. Absorbeerbare of monofilament hechtingen kunnen worden gebruikt voor lichaamsoppervlakken.
- Plaats de hechtingen gelijkmatig en zo dicht bij de weefselrand als mogelijk om obstructie van de bloedstroom te voorkomen; Typisch niet meer dan 0,3 cm van de rand is nodig.
- Grijp de huid en haal het een beetje door met een paar fijne tanden, en draai de naaldhouder in een uitgesproken positie om de huid te doordringen.
- Rijd de naald door de volle dikte van de huid door de pols te vervangen door de naald te draaien en door de huid te passeren.
- Herhaal dit proces voor de huidrand die het dichtst bij de persoon is die de procedure uitvoert.
- aandraaienDe hechtingen zijn genoeg om de weefselranden te verzetten. Enige strenger zal de bloedtoevoer, trage wondgenezing blokkeren en kan leiden tot dehiscentie.
- Bind de hechting aan met behulp van vierkante knopen, alsof het een eenvoudige onderbroken steek was, behalve dat alleen de korte streng gesneden werd, waardoor het ongeveer 3-4 mm staart was.
- Nadat de eerste steek is vastgemaakt, bereidt u zich voor om een tweede steek van ongeveer 3 mm van de eerste af te zetten en de lopende hechting door te gaan.
- Zodra het einde van de insnijding is bereikt, trek niet de laatste steek helemaal door. Gebruik hierbij de lus die hier met de naaldhouder wordt gehouden als de korte streng om het distale uiteinde van de hechtingsluiting af te sluiten.
- Met behulp van instrumentbanden, sluit de hechting met vierkante knopen af. Dit resulteert in 3 strengen van de afgewerkte knoop aan het distale einde.
5. Herstel van dieren
- Injecteer 2,1 mg / kg Yohimbine intra-peritoneaal na de operatie om anesthesie te keren. EENNimalen worden verwacht na volledig herstel van de chirurgische procedure na 3-5 uur.
- Houd het dier op een verwarmingsblok (om hypothermie te voorkomen) en absorberend zacht beddengoed na de operatie.
- Rehydrateren met orale of parenterale vloeistoffen totdat het kan terugkomen naar normaal voederen (binnen 24 uur). Spuit ongeveer 0,6 ml normale zoutoplossing peritoneaal onmiddellijk na de operatie om de uitdrogingseffecten te beperken.
- Bied analgesie zoals beschreven in het IACUC goedgekeurd Diervoeder en Gebruik Protocol. Injecteer 5 mg / kg carprofen subcutaan voor pijnbestrijding.
- Monitor incisies regelmatig voor zwelling, exudaat, pijn of ontlasting.
6. Validatie via magnetische resonantiebeelden
- Voer een n vivo MRI-experiment uit op MRI-scanners op het gebied van kleine velden.
- Verdamp anesthesie met 3% isofluraan in zuurstof en plaats het dier met de juiste nier bij het isocenter in de MRI scanner en pasAt radiofrequentie spoel. Geef dieren met 1-2% isofluraananesthesie continu door de beeldvormingsprocedure via een nosecone.
OPMERKING: Voor de in vivo MRI-afbeeldingen getoond in Figuur 1 , werd een rattengrootte volumespoel (binnendiameter = 72 mm) gebruikt. - Gebruik een dierenbewakings- en controlesysteem om de ademhalingssnelheid van elk dier (40-60 ademhalingen / min) en de lichaamstemperatuur van het lichaam (35 ± 1 ° C) te handhaven.
- Gebruik een multi-slice, multi-echo spin echo MRI-acquisitie om hoge resolutie, axiale T2-gewogen beelden van zowel de geïnfecteerde en de controle nieren te verkrijgen. Typische MRI-acquisitieparameters zijn herhalingstijd = 5.000 msec, echo-tijd = 40 msec, schijfdikte = 2,0 mm, ruimtelijke resolutie in het vliegtuig = 200 μm, 3 signaalgemiddelden en een verwervingstijd van 8 minuten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Medische beeldtechnieken bieden de mogelijkheid om UTI en therapeutische werkzaamheid niet-invasieve te beoordelen. Daarom werd MRI gebruikt voor inductie van acute infectie valideren na injectie van 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli, en de veranderingen in de nier vóór en na de operatie te visualiseren. Figuur 1a-b toont een progressief toenemend gebied van nierinfectie (gele pijlen). MRI-beelden die voor elk dier verkregen zijn bij dag 1 en 4 post-infectie-h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Stijgende acute pyelonefritis bij knaagdieren (dwz muizen en ratten) kan worden geproduceerd door transurethrale catheterisatie. 16 , 17 , 18 Deze transurethrale infectie methode is voordelig omdat het niet invasieve is en de menselijke pathofysiologie van stijgende infectie nabootst. 17 , 18 , 19 ,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen andere onthullingen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de steun van NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), het Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) en de Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439) erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | Voor bacteriële injecties |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | Voor zoutoplossingswas |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | Voor medicatie-injecties |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Injecteer IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Injecteer IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Injecteer IP na de operatie |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Injecteer SQ op de plaats van de incisie |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 of CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
Referenties
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
