Betrouwbare methode voor het beoordelen van zaadkieming, zaadrust en Sterfte onder veldomstandigheden

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van het zaad overleving, kieming en kiemrust onder veldomstandigheden gebruik begraven, geëtiketteerd zaad strips en tetrazolium chloride (TZ) levensvatbaarheid testen.

Samenvatting

We beschrijven technieken voor het benaderen van de dynamischen van zaadbanken in de loop van de tijd met Helianthus annuus als voorbeeldstudie soort. Stroken van doorlaatbaar polyesterweefsel en lijm kunnen worden gevouwen en gelijmd om een strook compartimenten te construeren die zaden en identificatie-informatie huisvesten, terwijl contact met bodemlekvocht, water, micro-organismen en omgevingstemperatuur wordt toegestaan. Stroken kunnen worden geconstrueerd met een breed scala aan compartimentnummers en -grootten en stellen de onderzoeker in staat om een verscheidenheid aan genotypen binnen een enkele soort, verschillende soorten of zaden die verschillende behandelingen hebben ervaren, te huisvesten. In tegenstelling tot individuele zaadpakketten kunnen stroken gemakkelijker als een eenheid worden teruggehaald. Hoewel repliceerbare pakketten binnen een strook kunnen worden opgenomen, kunnen verschillende stroken fungeren als blokken of kunnen op verschillende tijdstippen worden teruggehaald voor observatie van zaadgedrag in de loop van de tijd. We gebruikten een lijmpistool op hoge temperatuur om compartimenten af te bakenen en verzegelden de stroken zodra de zaden en tags die het blok en de verwijderingstijden identificeren, waren ingevoegd. De zaadstroken werden vervolgens in het veld op de gewenste diepte begraven, waarbij de locatie werd gemarkeerd voor latere verwijdering. Dierenpredatoren die graven werden effectief uitgesloten door gebruik van een afdekking van metaalgaas op het bodemoppervlak. Na de geselecteerde tijdsperiode voor begrafenis werden stroken opgegraven en werden zaden beoordeeld op kieming, kiemrust en mortaliteit. Terwijl duidelijk dode zaden vaak met het oog kunnen worden onderscheiden van ongekiemde levende zaden, werden kiemrustende zaden definitief geïdentificeerd met behulp van een standaard Tetrazoliumchloride kleurenmeting voor zaadlevensvatbaarheid.

Inleiding

Het algemene doel van deze methode is om op betrouwbare wijze te beoordelen zaad overlevingskans na verloop van tijd onder veldomstandigheden.

Bodem zaadbanken zijn een reserve van verspreid, levensvatbare nog ongekiemde zaden verspreid, hetzij op het bodemoppervlak, in oppervlakte zwerfvuil, of binnen het bodemprofiel, die tijdelijk of voor vele jaren ^1,2 kan aanhouden. Wanneer zaad begrafenis werkwijzen vergelijkbaar met die die hier werden aangebracht op een 17 jaar durende studie gebruikt tientallen soorten, werden levensvatbare zaden in veel van de geteste species ^3. Kiemrust is een blok aan het ontkiemen zaad tot de juiste combinatie van de voorwaarden voor zaailingen overleven ontstaan ^4. Resterende slapende kan toestaan ​​zaden zware omstandigheden, zoals lage temperaturen in de winter, beperking van voedingsstoffen, of seizoensgebonden droogte te overleven, totdat een externe trigger voor kiemrust afgifte zorgt voor kieming. Maakt naar kiemrust afgifte kan variëren van uitgebreide blootstelling aan koude, verbindingen achtergelaten door fire, of fysieke aanval op de zaadhuid door middel van schuren of contact met de maag dier zuren ^5. Zoals ontkieming signalen geslachten of species specifiek kunnen zijn en vaak resulteren uit vroegere natuurlijke selectie, onaangepaste zaadkieming wat plaatsvindt op een ongeschikt moment, en kan leiden tot sterfte of zaailingen of slechte groei van zaailingen. Hoewel slaaptoestand is ingedeeld in een aantal typen gebaseerd op de mechanismen slaaptoestand afgifte (bijvoorbeeld fysieke slaaptoestand, fysiologische rusttoestand), ⁶ kiemrust blijft een van de minst begrepen onderwerpen plantenbiologie. Zo veldstudies die het mogelijk maken voor de beoordeling van de status van individuele zaden of groepen zaden onder relevante ecologische omstandigheden hebben een hogere verklarende kracht dan die gewoon vertrouwen op standaard kiemproeven in het laboratorium.

Exploitatie van de bekende zaad kenmerken kan inzicht geven in de mechanismen van kiemrust. Controle van de kiemrust is complex, met inbegrip van genetische controle van de fysiologische en morfologische factoren. Terwijl een volledig begrip van de breedte slaaptoestand mechanismen is nog niet opgehelderd, is een algemeen model ontstaan, waarbij een terugkoppeling tussen de twee planthormonen Gibberellinezuur (GA) en abscisinezuur (ABA) ^7. In deze algemene model voor zaden met een fysiologische component om hun slaaptoestand, Georgië dient als signaal voor de slaaptoestand release, terwijl ABA dient om de slapende toestand te houden. Maternale genetische effecten, evenals de moederlijke groei milieu kunnen beïnvloeden latentie en andere zaad kenmerken, zoals grootte, door middel van de moeder gegenereerd weefsels en ontwikkelingsstoornissen signalen ^8. Moederdier gegenereerde externe structuren (of zaad afdekkingen) kunnen slaaptoestand handhaven, soms in combinatie met een fysiologische cues. Omdat maternale zaad bekledingen worden gecontroleerd door de genen van de moeder plant, kunnen zij niet overeen met het zaad van de werkelijke nucleaire genetische make-up. We hebben onsed de Helianthus annuus achenes uit een scala aan gewas-wild hybride kruisen om plagen uit deze moeders vs. embryo genetische effecten op het zaad kenmerken ^9,10. Dus studie ontwerpen die diverse soorten, kruis types, of genotypes bevatten u informatie over het verzamelen ecologie en genetica van kiemrust, kieming en overleving.

Een belangrijk voorbeeld van hoe zaadkieming en overleving fenotypes kan invloed hebben op de populatiedynamiek kan worden gezien in gewas-wild hybride zones. Selectie tijdens acclimatisering van cultuurgewassen elimineert de meeste latentie en vermindert het vermogen van een zaad overleven buiten het groeiseizoen. Maar gene flow, of hybridisatie, tussen de gecultiveerde en wilde soorten in gewasspecifieke wild hybride zones kan gewas allelen (of genetische varianten) opnieuw in een wilde populatie, met mogelijke effecten op de zaadbank dynamiek. Hybriden tussen gecultiveerde en wilde verwanten potentieel gevonden in gewas-wild hybride zones kunnen bezittendiverse tussenproduct slaaptoestand fenotypes, met slechts enkele fenotypen wordt naar omstandigheden te overleven buiten kweken (bijv wintermaanden) ^11.

Het doel van dit manuscript is om de werking te tonen, met de zaad begraven strookmethode, kunnen we kiemkracht, latentie en overleving van diverse zaadsoorten op verschillende tijdsperioden evalueren hun natuurlijke variatie onder veldomstandigheden onderzocht. In ons voorbeeld hebben we gebruik gemaakt zonnebloempitten van 15 gewasspecifieke wild hybride kruis types omdat we geïnteresseerd zijn in de moeder en embryo genetische effecten op zaad kenmerken.

Protocol

1. Verzamel Zaad uit Multiple Species of Controlled Kruisen van een Single Species

Opmerking: Dit voorbeeld gebruikt zaad uit 15 kruis types binnen de soort Helianthus annuus (zonnebloem) met behulp van wild, hybride, en de soorten gewassen als de moeder (zaad produceren) ouder.

1. Aan het einde van het groeiseizoen, het verzamelen van rijpe zaad hoofden in gelabelde zakken. Clean zaad van kaf en plaats zaad in enveloppen gelabeld met oudertype kruis in standaard formaat (dat wil zeggen, de moeder x vaderlijke).
2. Bulk zaad samen in grote enveloppen middels gelijke hoeveelheden zaad uit een gelijk aantal identieke ouderlijke types kruis. Bijvoorbeeld 100 zaden van 10 kruising of met dezelfde vaderlijke en moederlijke ouders. Label de enveloppen met het identificeren van (cross-type) informatie. Deze grote enveloppen zijn zaad masters voor gebruik bij het vullen van de begrafenis strips in afdeling 2.

	Maternal Parent
vaderlijke Parent	Wild: wXw	F 1: WXC	Crop: CXC
Wild: wXw	0% wXw	25% F 1 XW †	50% CXW †
BC: WxF1 of F1xW	12,5% WxBC	37,5% F 1 XBC	62,5% CxBC
F 1: WXC	25% WXF 1 †	50% F 1 xF 1	75% CxF 1 †
F 2: F 1 xF 1	25% WXF 2	50% F 1 xF 2	75% CxF 2
Crop: CXC	50% WXC †	75% F 1 xC †	100% CXC

Tabel 1. Ouderlijke kruis types geproduceerd uit de hand bestuiving. Zonnebloem gewas-wild hybride kruis types werden geproduceerd met hand-bestuiving voor gebruik in zaad begrafenis experiment. Voor alle types kruis, de moederlijke ouder eerst en de vaderlijke ouder tweede vermeld. Cross types gemarkeerd met † maken deel uit van de wederzijdse cross type paren met hetzelfde% gewas allelen, maar verschillende moeders ouders. Tabel is eerder gepubliceerd in: Pace, BA et al. (2015) ^15.

2. Aangepaste Seed Burial Strips

LET OP: Voor dit voorbeeld, hadden we drie verwijdering date behandelingen en 15 herhalingen, zodat we verplicht 45 strips totaal. Dit voorbeeld gebruikt 15 vakken per zone dus, we verplicht genoeg fijnmazig polyester textiel of klamboe naar het huis van 15, 7 x 10 cm vakken. Zie figuur 1.

1. Begin met het snijden van een 20 x 105 cm strook stof voor elk zaadje strip.
2. Meet en markeer compartimenten, vouw de stof in de helft. Met een high-temperatuur lijmpistool, verzegelen een korte (10 cm) einde. Zodra de lijm afkoelt een beetje, maar niet volledig, drukt u op de stof kanten op elkaar om een ​​afdichting te creëren.
   LET OP: hoge temperatuur lijm en lijmpistool tips kan brandwonden veroorzaken als contact met de huid is verlengd.
3. Lijm lijnen van de gevouwen rand naar het open kortste eind bij elk compartiment mark. Druk op de twee weefsel kanten op elkaar langs de lijm lijnen om zeehonden te waarborgen, zonder gaten tussen de compartimenten. Zaden migreren tussen de compartimenten een bijdrage leveren aan de experimentele fout.
   LET OP: Nu dat de compartimenten zijn gemaakt, moet de opengevouwen rand open en klaar om zaad en hun identificerende informatie (cross-type naam) te ontvangen blijven.
4. Willekeurig zaad kruis types toe te wijzen aan compartimenten voor elke strip.
   1. Vul zaad compartimenten met een uniforme aantal zaden (20 voor elk compartiment worden in dit voorbeeld). Voor etiketten, gebruik van industriële permanente markeringen op cut-to-fit kunststof tuin darts, zodat zij in staat zijn omweerstaan ​​begrafenis.
      OPMERKING: Alternatieve labeling methoden worden gebruikt.
   2. Nadat elk compartiment is gevuld met zaad en het label, sluit de ruimte onmiddellijk met de hoge-temperatuur lijmpistool. Ga verder totdat de gehele zaad strook volledig is afgesloten. Label totale strip in het eerste compartiment met repliceren, te blokkeren en / of behandeling informatie.
      LET OP: Voor onze studie, want we hadden tijdelijke verhuizingen, blokken, en repliceren strips in blokken, inclusief we al deze informatie.
   3. Controleer of er gaten tussen compartimenten en spot lijm als nodig is alvorens over te gaan naar de volgende strip.

Figuur 1. Begrafenis zaad strip schema. Voorbeeld van een begrafenis strip toont cross-type identificatie van afzonderlijke compartimenten. Moederlijke ouder wordt eerst met de vaderlijke ouder tweede vermeld. Kleuren geven verschillende moeders bloedverwantschap,met geel voor wild, blauw voor F ₁ hybride, en rood voor gewas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bury Seed Strips in het Veld

1. Graaf plots naar de opgegeven diepte naar het huis van strips. Toewijzen strips afzonderlijke blokken waarin stroken willekeurig zijn ingericht om voor de verwijdering date te gebruiken als de belangrijkste plot en identiteit compartiment (in dit voorbeeld dwars type) als subplot in analyse.
2. Dek af strips met aarde. Cut metalen gaas hardware doek tot 10 cm groter dan plots en plaats over begraven strips zijn. Gebruik U-pins aan de randen en de dekking doek randen te beveiligen met aarde.
   LET OP: Deze bekleding is voor het uitsluiten van gravende zaad roofdieren. Als een andere optie, Mercer et al. ¹³ gebouwd en begraven dozen hardware doek dat het zaad strips als gevolg van hevige gopher druk in hun vakgebied loca omringdtie.)
3. Plaats vlaggen gekleurde landmeter om onderscheid te maken strip locatie en verwijdering data om de duidelijke schriftelijke verslagen aan te vullen.

4. Graaf Strips en evalueren Seed

1. Graaf zaad strips toegewezen aan een bepaalde datum te verwijderen. Handhaving van de strips in een koele vochtige omgeving tot ze het laboratorium waar zaad evaluatie zal plaatsvinden bereiken. Dit kan worden bewerkstelligd door het wikkelen van de stroken in natte kranten en ze in een koeler voor transport of overnacht scheepvaart.
2. Spoel de modder en de bodem van strips in water tot strips zijn schoon genoeg dat de externe puin zal niet obscure zaden.
3. Gebruik een schaar open één compartiment te snijden op een moment. Graaf ontkiemde zaden en verwijder ze. Count duidelijk dode zaden (bv, rot, of verrotte zaden). Plaats ongekiemde zaden op het label, natte Petri-formaat vloeipapier om ongekiemde, slapende, en dode zaden verder te onderscheiden.
   1. Plaats Petri gerechten met ongekiemdezaden in een kweekkamer set voor standaard kieming voorwaarden: 25 ° C / 10 ° C 12 uur dag / nacht. Laat zaden een week om te ontkiemen. Elke dat doen, tellen deze als levensvatbaar, maar ongekiemde omdat zij niet ontkiemen onder veldomstandigheden.
4. Na de groei kamer behandeling, testen resterende ongekiemde zaden voor de levensvatbaarheid gebruik tetrazoliumchloride (TZ) ^13. Om dit te bereiken, vormen een procent oplossing van TZ geschikt is voor de studie soorten met behulp van de AOSA Tetrazolium Testing Handbook ^14. Voor dit voorbeeld wordt een 1% oplossing toegepast.
   1. Snijd de ongekiemde zaden in tweeën en plaats een helft uit het embryo en endosperm zichtbaar in een petrischaal met weinig TZ oplossing te bedekken zaad (zaden kunnen drijven, is goed).
   2. Plaats TZ petrischalen in een incubator ingesteld op 30 ° C en 3 uur wachten. Opmerking: Hogere temperaturen leiden tot een snellere reactie, desgewenst, maar overstaining gevaar.
5. Verwijder Petri gerechten uit de couveuse en te evalueren. Zaden die rood zijn gekleurd in hun embryo's kiemkrachtige, terwijl ongekleurde zaden dood zijn. Raadpleeg de AOSA Tetrazolium Testing Handboek voor meer informatie over onderscheidende marginale gevallen en bijzondere soorten.

Resultaten

Cross types met gevarieerde moederlijke afstamming en gewas allel percentage (tabel 1) verschilde over het verwijderen data in procent ontkiemd, ongekiemde, en dode zaad (fig. 2 en 3). Gebruik TZ testen van ongekiemde zaden, vonden we enkele werkelijk slapende zaden in de tweede verwijdering (lente) (Tabel 2), terwijl alle zaden ongekiemde de derde verwijdering (spring) bleken werkelijk blijven liggen.

Discussie

Hier presenteren we werkwijzen voor het toepassen zaad begraven strips zaadkieming, latentie en mortaliteit van diverse zaadvoorraden nageleefd vooraf gekozen tijdsperioden in het veld. De voordelen van strips in plaats van individuele pakketten liggen in (1) de snelheid van de strip en compartiment constructie over de schepping van afzonderlijke verpakkingen; en (2) het gemak en de snelheid van het verwijderen van meerdere compartimenten in een beweging zonder het gevaar van een pakket weglaten of verwijderen van een o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kleine muntenvelopjes	Elk
Grote muntenvelopjes	Elk
Fijnmazige polyester muskietennetjes	Elk
Lijmpistool voor hoge temperaturen	Elk
Navullingen voor lijmstick voor hoge temperaturen	Elk
Individuele permanente markeerstiften	Elk
Kunststof tuinlabels	Elk
Scharen	Elk
Schop	Elk
Metaalgaas harde smederijdoek	Elk
Vlaggen van landmeters, meerdere kleuren	Elk
Natte krant	Elk
Koeler	Elk
Vlekloos papier	Elk
Petrischalen	Elk
Temperatuur gecontroleerde groeikam	Elk
Veiligheidsmesjes	Elk
Petrischalen	Elk
Tetrazoliumchloride	Elk
Water	Elk
Warmte-incubator	Elk