Methodenartikel

Een methode voor het meten van RNA N 6 -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

DOI:

10.3791/54672

⸱

5 december 2016

 ,  , 
1Department of Cardiology, Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemodificeerde Northern blotting methode voor het meten N6 -methyladenosine (m 6 A) veranderingen in RNA wordt beschreven. De huidige methode kan wijzigingen in diverse RNA's en controles onder verschillende experimentele ontwerpen te detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-Methyladenosine (m6A) modificaties van RNA zijn divers en alomtegenwoordig onder eukaryoten. Ze komen voor in mRNA, rRNA, tRNA en microRNA. Recente studies hebben onthuld dat deze omkeerbare RNA-modificaties RNA-splicing, translatie, degradatie en lokalisatie beïnvloeden. Meerdere fysiologische processen, zoals circadiaanse ritmen, stamcel-pluripotentie, fibrose, triglyceridenmetabolisme en obesitas worden ook gecontroleerd door m6A-modificaties. Immunoprecipitatie/sequencing, massaspectrometrie en gemodificeerd noordelijk blotting zijn enkele van de methoden die gewoonlijk worden gebruikt om m6A-modificaties te meten. Hier presenteren we een noordoostelijke blotting-techniek voor het meten van m6A-modificaties. Het huidige protocol biedt een goede groottescheiding van RNA, betere accommodatie en standaardisatie voor verschillende experimentele ontwerpen, en duidelijke afbakening van m6A-modificaties in verschillende bronnen van RNA. Hoewel m6A-modificaties bekend staan om hun cruciale impact op de menselijke fysiologie met betrekking tot circadiaanse ritmen en obesitas, zijn hun rollen in andere (patho)fysiologische toestanden onduidelijk. Daarom hebben onderzoeken naar m6A-modificaties een enorme mogelijkheid om belangrijke inzichten te bieden in moleculaire fysiologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische en omkeerbare RNA-modificaties spelen een belangrijke rol in de RNA-homeostase. Vier decennia geleden werd gevonden dat N6-methyladenosine (m6A)-modificaties overvloedig waren in eukaryotische transcriptomen1. Ze hebben diverse functies in boodschapper-RNA (mRNA), ribosomaal RNA (rRNA), kleine nucleolaire RNA, transfer-RNA en microRNA2. De m6A-modificaties van mRNA beïnvloeden hun splitsing3, translatie4, degradatie5 en lokalisatie2. Bovendien beïnvloeden ze ribosoom-biogenese en microRNA-functie6. De evolutionaire conservatie van m6A-modificaties van RNA wordt opgemerkt bij eencellig bacteriën tot meercellige mensen7. De afbakening van de rollen van m6A-modificaties wordt momenteel intensief onderzocht. De inspanningen zullen naar verwachting nieuwe inzichten bieden in transcriptiecontrole. Recente studies onthullen dat andere chemische modificaties van mRNA8 ook cruciale rollen spelen in RNA-metabolisme.

Circadiane ritmen9, stamcel-pluripotentie10, triglyceridenmetabolisme4, fibrose11, obesitas12 en ernstige depressie13 zijn een paar voorbeelden van processen waarbij bekend is dat m6A-modificaties de resultaten beïnvloeden. Veel circadiane klokgentranscripten hebben m6A-plaatsen14. Modulatie van m6A-methylase of demethylase veroorzaakt circadiane periodeveranderingen15. Mettl3, een m6A-transferase, is een regulator voor stamcel-pluripotentie. Een tekort aan Mettl3 leidt tot vroege embryonale letaliteit en abnormale lijn-primering in het post-implantatie stadium10. Een tekort aan fat mass- and obesity-associated (FTO), een m6A-demethylase, in adipocyten beïnvloedt vetzuurmobilisatie en lichaamsgewicht door posttranscriptionele regulatie van Angptl44. Deze studies onthullen dat m6A niet alleen mRNA-verwerking controleert, maar ook cruciale rollen speelt in embryologische ontwikkeling en pathofysiologie. De functie van m6A-modificaties heeft implicaties voor toekomstige therapeutische overwegingen.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om m6A-modificaties van RNA te meten16-18. Traditioneel worden dunne-laag-chromatografie (TLC) en hoge-prestatievloeistofchromatografie (HPLC) gebruikt om de verdeling van m6A in verschillende RNA's te bestuderen19,20. Massaspectrometrie is een gevoelig hulpmiddel voor de detectie van m6A-modificaties in RNA. Echter, het RNA moet door RNase in korte fragmenten worden gesneden voordat het door massaspectrometrie wordt geanalyseerd21. Methyl-RNA immunoprecipitatie en sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipiteert gefragmenteerde RNA's met m6A-specifieke antilichamen en voert parallelle RNA-sequencing uit. Deze methode genereert m6A-landschappen van het hele transcriptome. Hoge-resolutiekartering van m6A individuele-nucleotideresolutie cross-linking en immunoprecipitatie (miCLIP) kaartt verder m6A-modificaties op een enkele-nucleotideresolutie23. Beide methoden bieden details van m6A-modificatie over het hele transcriptome, met specifieke geneninformatie. Echter, kwantificering en standaardisatie in beide methoden zijn moeilijk als experimenten de vergelijking van meerdere omstandigheden vereisen. Bovendien veranderen fragmentaties van RNA voor m6A-Seq de oorspronkelijke RNA-structuur, wat de native m6A-niveaus kan beïnvloeden. Om globale m6A-modificaties van RNA en hun veranderingen onder verschillende experimentele omstandigheden te detecteren, rapporteren we een methode die een gewijzigd northern blotting-protocol gebruikt. Deze methode scheidt RNA op moleculair gewicht, met behulp van gelelektroforese18. Deze procedure biedt betere standaardisatie en kwantificering voor experimenten die meerdere omstandigheden of monsters omvatten. Het biedt ook specifieke m6A-modificatie-informatie voor verschillende RNA's, of het nu rRNA, mRNA of microRNA betreft.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Het totale RNA m 6 Een niveau omvat rRNA, mRNA, en andere kleine RNAs. Sinds ribosomaal RNA heeft overvloedige m 6 A wijzigingen, de meting van m 6 A levels moet dit feit te overwegen.

1. RNA Isolation

  1. Met behulp van de ribonuclease decontaminatie-oplossing (gespoten op papieren handdoeken), veeg de pipetten en de labtafel oppervlakken. Natte papieren handdoeken met nuclease-vrij water en veeg naar beneden pipetten en labtafel oppervlakken weer.
  2. RNA-extractie
    1. Total RNA Isolation
      1. Met een bovenroerder, gehomogeniseerd 50-100 mg weefsel of 5-10 x 10 6 cellen in 1 ml RNA-isolatie oplossing gehandhaafd op 4 ° C.
        OPMERKING: More weefsel (100-150 mg) vereist voor vetweefsel monsters van muizen vanwege de lagere concentraties RNA daarin. Monsters afkomstig van muis hart, lever, skeletspier, long, hersenen en macrofagen zijn eerder gebruikt 4.
      2. Incubate het monster homogenaten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Voeg 100 ul van 1-broom-3-chloorpropaan (BCP) per 1 ml gehomogeniseerd. Schud de buizen krachtig gedurende 15 s en ga verder met totaal RNA te isoleren volgens de instructies van de fabrikant 24.
    2. Gepolyadenyleerde mRNA Zuivering van Geïsoleerde Totaal RNA
      1. Zuiveren gepolyadenyleerde mRNA met behulp van beschikbare kits of protocollen.
        1. Schud grondig resuspendeer elk van de volgende oplossingen: 2x bindoplossing, oligo (dT) polystyreen kralen en wasoplossing. Zorg ervoor dat de oligo (dT) kralen warm tot kamertemperatuur vóór gebruik.
        2. Transfer 120 ul van elutieoplossing per preparaat in een buis en verhit tot 70 ° C in een verwarmingsblok.
        3. Pipet tot 500 ug totaal RNA in een microcentrifugebuis. Met nuclease-vrij water, het volume aanpassen tot 250 ul.
        4. Voeg 250 ul 2x binding oplossing van het totale RNA datlutie en vortex kort naar de inhoud te mengen.
        5. Voeg 15 ul van oligo (dT) kralen en vortex grondig te mengen.
        6. Incubeer het mengsel bij 70 ° C gedurende 3 min.
        7. Verwijder het monster uit het verwarmingsblok en laten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
        8. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 2 minuten.
        9. Verwijder voorzichtig het supernatant, met achterlating van ongeveer 50 ul.
        10. Voeg 500 ul van wassen oplossing voor resuspendeer de pellet door pipetteren.
        11. Pipetteer de suspensie in een spin filter / collectie buis set.
        12. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder de kolom verzamelbuis en gooi het doorstroomkanaal. Breng de kolom aan de collectie buis.
        13. Pipetteer 500 ul van wassen oplossing op de spin-filter.
        14. Centrifuge bij 15.000 x g gedurende 2 min.
        15. Breng de spin-filter in een frisse collectie buis.
        16. Pipetteer 50 ul van elutie verhittot 70 ° C op het midden van het rotatiefilter.
        17. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 70 ° C. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 1 min.
        18. Pipetteer een extra 50 ui elutie-oplossing verwarmd tot 70 ° C op het midden van het rotatiefilter.
        19. Herhaal stap 1.2.2.1.18.
      2. Voeg 100 ug / ml glycogeen, 0,1 volume 3 M natriumacetaat buffer (pH 5,2) en 2,5 volumes absolute ethanol. Precipiteren nacht bij -80 ° C.
      3. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 25 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
      4. Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de ethanol voorzichtig.
      5. Droge lucht gedurende 3-5 min.
      6. Voeg 10 ul nuclease-vrij water aan de pellet lossen.
      7. Bewaar bij -70 ° C.
  3. RNA kwalificatie en kwantificering
    1. Met behulp van een spectrofotometer, bepalen de RNA concentratie kennisgevingng de absorptie bij 260 nm en 280 nm. De A260 / A280-verhouding moet 1,8-2,2.
    2. Controleer de RNA-monster kwaliteit met behulp van 0,8% agarosegelelektroforese 25.
      LET OP: De intacte eukaryotische totaal RNA moet intense 28S en 18S rRNA bands laten zien. De verhouding van 28S versus 18S rRNA band intensiteit voor een goede voorbereiding is het RNA ~ 2.

2. Gel Elektroforese en Transfer

OPMERKING: De buffervoorbereiding protocollen zijn in tabel 1.

  1. Formaldehyde Gel Bereiding (1%)
    1. Spoel alle elektroforese-apparatuur met diethylpyrocarbonaat (DEPC) water.
    2. Smelt 2,5 g agarose in 215 ml DEPC water volledig in de magnetron.
    3. Voeg 12,5 ml 10x 3- (N- morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) buffer en 22,5 ml 37% formaldehyde.
    4. Giet het in de electroforese-inrichting met een 1,5 mm dik kam.
    5. Elimineer bellen of duw tzoom aan de randen van de gel met een schone kam.
    6. Laat de gel stollen bij kamertemperatuur.
  2. monstervoorbereiding
    1. Meng 1-10 ug totaal RNA en 11,3 pl monsterbuffer.
    2. Meng 2 ug van het RNA marker (1 ug / ul) met 11,3 pl monsterbuffer.
    3. Add nuclease-vrij water aan de monsters van 2.2.1 en 2.2.2 tot een totaal volume van 16 ul.
    4. Verhit bij 60 ° C gedurende 5 minuten, en vervolgens relaxen op ijs.
    5. Meng 16 pl van het monster 2.2.3 met 4 pl traceerkleurstof, die 0,1 ug bevat / ul ethidiumbromide op ijs.
      LET OP: Ethidiumbromide is mogelijk teratogeen en giftig bij inademing. Lees ethidiumbromide veiligheidsinformatieblad.
  3. elektroforese
    1. Voeg 200 ml 10x MOPS buffer tot 1.800 ml DDH 2 O tot een 1X MOPS loopbuffer te maken.
    2. Gebruik de 1x MOPS loopbuffer aan de putjes van de gel te spoelen.
    3. Pre-run tHij gel bij 20 V gedurende 5 min.
    4. Laad de RNA monsters in de putjes van de gel.
    5. Dek af met folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Run op 35 V gedurende ongeveer 17 uur ( 's nachts)
    6. Onderzoeken en fotograferen van de gel onder een UV-licht.
  4. Overdracht
    1. Snijd de gel om het ongebruikte deel te verwijderen.
    2. Bereid 500 ml 10 x SSC buffer (250 ml 20 x SSC buffer en 250 ml DEPC water).
    3. Was de gel tweemaal met 10x SSC buffer gedurende 20 min met schudden bij 50 rpm.
    4. Snijd 1 filtreerpapier vel groot genoeg om als een lont papier, dat transferbuffer opneemt uit de overdrachtschaalvorm (figuur 1).
    5. Snijd 4 filtreerpapiertjes dezelfde grootte als de gel.
    6. 1 gesneden vel positief geladen nylonmembraan dezelfde grootte als de gel.
    7. Markeer een inkeping op de gel en het membraan als een marker om de juiste oriëntatie te verzekeren.
    8. Geniet van het membraan in 2x SSC buffer gedurende 15 min.
    9. Giet 500 ml of 10x SSC buffer in de overdracht lade.
    10. Leg de grote filter vel papier over de glasplaat en bevochtig de filter papier met de overdracht buffer.
    11. Uitrollen eventuele luchtbellen met een pipet.
    12. 2 weken stukjes voorgesneden filtreerpapier in overdrachtsbuffer en plaats ze op het midden van het filterpapier uit stap 2.4.5. Verwijder eventuele luchtbellen.
    13. Leg de gel top-kant naar beneden op het filter papier.
    14. Lag het membraan bovenop de gel. Lijn de inkepingen van de gel en het membraan.
    15. Leg 2 stukken van pre-cut filter papier op de top van het membraan en nat de filter papier met de overdracht buffer.
    16. Verwijder eventuele luchtbellen tussen de lagen.
    17. Toepassen plastic rond de gel dat de handdoeken alleen genieten buffer die door de gel en het membraan.
    18. De stapel papieren handdoeken bovenop het filterpapier.
    19. Plaats een grote glasplaat boven op de handdoeken.
    20. Plaats een gewicht op de bovenkant van de stapel.
    21. Blijf gedurende de nacht om het RNA om van de gel naar het membraan.

3. Detectie van N 6 -methyladenosine

  1. membraan Crosslinking
    1. Houd het membraan vocht in 2x SSC buffer.
    2. Plaats 2 vellen filterpapier ondergedompeld met 10x SSC buffer in UV crosslinker.
    3. Plaats het membraan boven op het filterpapier, met de RNA-geadsorbeerde zijde naar boven.
    4. Selecteer "autocrosslink mode" (120.000 uJ) en druk op de knop "Start" om de bestraling te starten.
    5. Onderzoek de membraan en de gel met een UV-afbeelding gel catcher aan het RNA transfer van de gel aan het membraan te bevestigen.
  2. immunoblotting
    1. Blokkeer het membraan in 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) buffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Was driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    3. Incubeer het membraan overnacht in m 6 A ( N 6 -methyladenosine) antilichaamoplossing (1: 1000 in 5% vetvrije melk TBST buffer) bij 4 ° C.
    4. Was het membraan driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    5. Incubeer het membraan in het HRP-geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam-oplossing (1: 2000 in 5% vetvrije melk TBST buffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
    6. Was het membraan driemaal met TBST buffer gedurende 15 min.
    7. Breng het versterkt chemiluminescent substraat (0,125 ml per cm2 membraan).
    8. Leg de chemiluminescentie met de optimale instellingen voor de digitale beeldvormer volgens de instructies van de fabrikant 26.
  3. m 6 een kwantificering
    1. Meet de relatieve m 6 een chemiluminescentie-intensiteit met de ImageJ software.
      1. Onder de ImageJ software menu de optie "File" om het relevante bestand te openen.
      2. Selecteer de "rechthoek" tool van ImageJ en trek een kader rondde signalen.
      3. Als ribosomaal RNA is niet de focus van de experimenten, vermijd de 18S en 28S ribosomale RNA m 6 A banden voor de berekening.
      4. Klik "Commando" en "1" om de geselecteerde baan te bevestigen.
      5. Druk op "Command" en "3" om de geselecteerde plot tonen.
      6. Klik op de "Straight" tool en lijnen te vestigen op de gesegmenteerde te scheiden.
      7. Klik op de "Wand" tool om de metingen te nemen.
      8. De gegevens exporteren.
      9. Normaliseren van de niveaus van m 6 A met de 18S ribosomale RNA band uit ethidium bromide kleuring.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na 14 dagen in normaal licht-donker circadiane fase werden de wild-type muizen geplaatst in constante duisternis. De RNA's uit de lever werden bemonsterd op 4 uur intervallen en studeerde met gemodificeerde Noord-blotting. De methylering van rRNA, mRNA's en kleine RNA duidelijk gedetecteerd (figuur 2). De vergelijking tussen verschillende circadiane tijden (CT) kan nauwkeurig worden berekend met de 18S rRNA standaard. Er was sterke circadiane oscillatie van m 6 A niveaus in rRNA, mRNA, en kleine RNAs.

Om de storing aangeboden door rRNA te voorkomen, kan gepolyadenyleerde RNA's worden gezuiverd, zoals in stap 1.2.2. Na zuivering, kan het rRNA grotendeels geëlimineerd om een betere visualisatie van andere RNA's (figuur 3).

figure-results-1
g> Figuur 1: Montage van de vlek transporteenheid. De capillaire blotting overbrengeenheid voor het RNA aan het membraan getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: circadiane ritme van de m 6 A levels in C57BL / 6J muizen. Deze figuur toont de m 6 Een blot van totaal RNA van levers van wild-type muizen geofferd op de eerste dag van de donkere donkere fase na 14 dagen van een normaal licht-donker fase bij 4 uur intervallen. De kwantificering werd gedaan met behulp van de m 6 beeld Een dichtheidsverschil tussen 18S en 28S rRNA. De m 6 een overvloed werd genormaliseerd naar het 18S rRNA band uit de formaldehyde gel op de bodem.et = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De m 6 Een blots met of zonder rRNA. Representatieve m 6 Een blots van totaal RNA en gepolyadenyleerd RNA uit de lever van wildtype muizen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1 10x MOPS buffer (pH 7,0, bescherming tegen licht)
MOPS 41.85 g 0,2 M
Natriumacetaat 4.1 g 0,05 M
EDTA, Disodium Salt 3.7 g 0,01 M
DEPC water
Totaal 1 L
Roer bij kamertemperatuur
2 20x SSC-buffer (pH 7,0)
natriumchloride 175.3 g 3 M
trinatriumcitraat 88.3 g 0,3 M
DEPC water
Totaal 1 L
Roer bij kamertemperatuur, vervolgens autoclaveren
3 Tracking Dye
10x MOPS buffer 500 pl 1x
Ficoll 400 0.75 g 15%
broomfenolblauw 0.01 g 0,2%
xyleencyanol 0.01 g 0,2%
DEPC water
Totaal 5 mL
Bewaren bij -20 ° C
4 DEPC water
Verdun ratio 1: 1000 in met DEPC DDH 2 O
Roer overnacht bij kamertemperatuur, vervolgens autoclaveren
5 Monsterbuffer (bescherming tegen licht)
10x MOPS buffer 200 pl
37% formaldehyde 270 pl
formamide 660 pl
Bewaren bij -20 ° C

Tabel 1: Buffers en oplossingen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificaties van RNA spelen een belangrijke rol in de cellulaire functie en fysiologie. Het huidige begrip van de regulatie, functie en homeostase van deze modificaties wordt nog steeds onderzocht en uitgebreid8. Daarom is er een nauwkeurige en gouden standaardmethode nodig om de modificaties van RNA te evalueren. De gemodificeerde northern blotting-methode biedt een nauwkeurige kwantificering van RNA-modificaties en een duidelijke afbakening van de modificaties in verschillende RNA's. Hoewel de methode minimaal 3 dagen vereist, kan deze worden gestandaardiseerd en in verschillende experimentele ontwerpen worden gebruikt. Bovendien kan het met verschillende antilichamen verschillende RNA-modificaties detecteren27.

Het is belangrijk om verschillende RNA's te scheiden bij het analyseren van RNA-modificaties. Ribosomale RNA vormt een groot deel van de totale hoeveelheid RNA28,29. De resultaten van het analyseren van RNA-modificaties alleen in totaal RNA zullen vooral de veranderingen van rRNA vertegenwoordigen. Methylering en andere dergelijke modificaties van rRNA kunnen mogelijk de veranderingen in andere RNA's maskeren. Met de procedure van gelscheiding kunnen de modificaties van mRNA en andere kleine RNA's nauwkeuriger worden geanalyseerd.

Transcriptoom-breed mapping met m6A immunoprecipitatie en sequencing biedt gedetailleerd inzicht in de modificatie van elk type RNA22. Het biedt informatie over de specifieke RNA's en een resolutie van ongeveer 80-120 bp. Hoewel m6A-Seq de modificaties tussen verschillende experimentele omstandigheden kan vergelijken, is de selectie van geschikte standaarden en controles voor dergelijke experimenten moeilijk18. Immunoprecipitatie is moeilijk te reproduceren en geeft vaak aanzienlijke variaties tussen herhalingen. Bovendien vereist m6A-Seq de fragmentatie van RNA-monsters vóór immunoprecipitatie en sequencing30. Het fragmentatieproces kan mogelijk onnodige invloeden hebben op de oorspronkelijke RNA-modificaties. Als het experiment de specifieke geninformatie niet nodig heeft, maar verschillende omstandigheden vereist voor vergelijking, biedt de huidige methode betere visualisatie en controle voor diverse experimentele opstellingen.

Modificatie van RNA is een belangrijke stap in het reguleren van transcriptionele controle31. Echter, de homeostase en de regulerende mechanismen van verschillende RNA-modificaties onder diverse fysiologische domeinen zijn nog steeds onduidelijk. Met behulp van de huidige gemodificeerde northern blotting-methode kunnen verschillende RNA-modificaties worden gekwantificeerd en vergeleken. Bovendien kunnen de veranderingen en regulaties van RNA-modificaties in meer detail worden onderzocht. In de toekomst zou het ook mogelijk kunnen zijn om de experimentele gegevens van zowel de klassieke northern blotting als de gemodificeerde northern blotting-protocollen te combineren, waardoor meer inzicht wordt verkregen in de RNA-biologie.

De belangrijkste factor die het succes van het gemodificeerde northern blotting-protocol bepaalt, is de integriteit van het RNA-monster. RNA's met een zekere mate van degradatie kunnen goede klassieke northern blotting-resultaten opleveren, maar dit kan mogelijk een significante invloed hebben op de resultaten van de gemodificeerde northern blotting. De modificaties van RNA in verschillende weefsels of cellijnen kunnen ook aanzienlijk variëren. Het is belangrijk om de geschikte RNA-monsterladingen voor verschillende weefsels te testen voordat de uiteindelijke experimenten worden uitgevoerd.

Aangezien blotprocedures traditioneel zijn vernoemd naar Dr. Southern en verschillende geografische richtingen, stellen we de naam "noordoostelijke" blotting voor de huidige techniek voor.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.W. ontving ondersteuning van het National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), de National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) en Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 en CMRPG3C1763).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNaseZap oplossingAmbionAM9782Protocol 1.1
TRI Reagent oplossingAmbionAM9738Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloorpropaan (BCP)SigmaB9673Protocol 1.2.1.3
EthanolJTbaker8006Protocol 1.2.1.3
IsopropanolSigmaI9516Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep KitSigmaMRN70Protocol 1.2.2.1
GlycogenAmbionAM9510Protocol 1.2.2.2
NatriumacetaatFluka71183Protocol 1.2.2.2
Nuclease-vrij waterAmbionAM9930Protocol 1.2.2.6
DEPCSigmaD5758Protocol 2.1.1
AgaroseJT BakerA426Protocol 2.1.2
MOPSSigmaM1254Protocol 2.1.3
37% formaldehyde oplossingSigmaF8775Protocol 2.1.3
EDTA, DinatriumzoutJT Baker8993Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
FormamideSigmaF7503Protocol 2.2.1
RNA Millennium MarkerAmbionAM7150Protocol 2.2.2
EthidiumbromideAmrescoX328Protocol 2.2.5
Ficoll PM400GE Healthcare17-0300-10Protocol 2.2.5 tracking dye
BroomfenolblauwSigma114391Protocol 2.2.5 tracking dye
Xyleen Cyanol FFSigmaX4126Protocol 2.2.5 tracking dye
Natriumchloride dihydraatJT Baker3624Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
TrinatriumcitraatSigmaS1804Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting PaperGE HealthcareRPN6101MProtocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membraanGE HealthcareRPN303BProtocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400Stratagene400075Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500ANT TechnologyGel Catcher 1500Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)Synaptic Systems202003Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Konijn IgG, HRP-gelinkt geheel AbGE HealthcareNA934Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP SystemBIO-RAD1708280Protocol 3.2.8

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thammana, P., Held, W. A. Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro. Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).
  2. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
  3. Niu, Y., et al. N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).
  4. Wang, C. Y., et al. Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism. Sci Signal. 8 (407), 127(2015).
  5. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  6. Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).
  7. Deng, X., et al. Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).
  8. Dominissini, D., et al. The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. , (2016).
  9. Fustin, J. M., et al. RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock. Cell. 155 (4), 793-806 (2013).
  10. Geula, S., et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).
  11. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. , SREP18874 (2016).
  12. Jia, G., et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).
  13. Du, T., et al. An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population. J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).
  14. Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome. Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).
  15. Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription. Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).
  16. Heyn, H., Esteller, M. An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine. Cell. 161 (4), 710-713 (2015).
  17. Xiao, W., et al. Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing. Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).
  18. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  19. Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).
  20. Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).
  21. Golovina, A. Y., et al. Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis. Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).
  22. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  23. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  24. Fu, L., et al. Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method. Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).
  25. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).
  26. Wang, C. Y., et al. FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy. Sci Rep. 6, 18874(2016).
  27. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. , (2016).
  28. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons. J Vis Exp. (90), (2014).
  29. Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq. J Vis Exp. (74), (2013).
  30. Mishima, E., et al. Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides. PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).
  31. Klungland, A., Dahl, J. A. Dynamic RNA modifications in disease. Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA epigeneticagemodificeerde Northern blotRNA isolatieagarosegelelektroforeseUV crosslinkingm6A antilichaamdetectiechemiluminiscentie kwantificeringanalyse van muisweefselonderzoek naar het circadiane ritme

Gerelateerde artikelen