Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Summary

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Abstract

De vorming van oligomere complexen is een cruciale voorwaarde voor de juiste structuur en functie van veel eiwitten. Het interferon-geïnduceerde antivirale effectoreiwit MxA oefent een breed antiviraal effect uit tegen veel virussen. MxA is een dynamin-achtig GTPase en heeft de capaciteit om oligomere structuren van hogere orde te vormen. Ofwel, of oligomerisatie van MxA noodzakelijk is voor zijn antiviraal effect is een discussiepunt. We beschrijven hier een eenvoudig protocol om de oligomere toestand van endogene of ectopisch geëxprimeerde MxA in de cytoplasmatische fractie van menselijke cellijnen te beoordelen door niet-denaturerende polyacrylamide-gelelektroforese (PAGE) in combinatie met Western blot-analyse. Een kritieke stap van het protocol is de keuze van detergenten om aggregatie en/of precipitatie van eiwitten te voorkomen, met name geassocieerd met cellulaire membranen zoals MxA, zonder de enzymatische activiteit ervan te verstoren. Een andere cruciale aspect van het protocol is de onomkeerbare bescherming van de vrije thiolgroepen van cysteïneresiduen door iodoacetamide om kunstmatige interacties van het eiwit te voorkomen. Dit protocol is geschikt voor een eenvoudige beoordeling van de oligomere toestand van MxA en biedt bovendien de mogelijkheid voor een directe correlatie van de antiviraal activiteit van MxA-interfacemutanten met hun respectieve oligomere toestanden.

Introduction

De quaternaire structuur van een eiwit speelt een cruciale rol in vele cellulaire processen. Signaalwegen, genexpressie en enzymactivering / deactivering allemaal afhankelijk van de juiste montage van eiwitcomplexen ^1-4. Dit proces ook bekend als homo- of hetero-oligomerisatie wordt veroorzaakt door irreversibele covalente of omkeerbare elektrostatische en hydrofobe eiwit-eiwit interacties. Oligomerisatie diversifieert niet alleen de verschillende cellulaire processen zonder genoomgrootte verhogen, maar ook een strategie voor eiwitten stabiele complexen die resistenter voor denaturatie en degradatie ⁵ zijn gebouwd. Defecten in oligomerisatie van invloed op de functie van eiwitten en kan leiden tot de ontwikkeling van ziekten. Bijvoorbeeld het enzym fenylalanine hydroxylase vormt een tetrameer complex. Sommige mutaties in het eiwitcomplex de vorming tetrameer verzwakken en leiden tot de ziekte fenylketonurie ^6.

De menselijke MxA eiwit een interferon (IFN) geïnduceerde antivirale effectoreiwit uitoefenen van een brede antivirale activiteit tegen verschillende RNA en DNA-virussen ^7. Het behoort tot de superfamilie van dynamin-achtige GTPases groot en heeft de capaciteit om grote oligomere structuren in vitro ^8. Oligomerisatie is voorgesteld om MxA te beschermen tegen snelle afbraak ^9,10. Ondanks intensieve inspanningen van vele onderzoeksgroepen, de moleculaire werkingsmechanisme blijft grotendeels ongrijpbaar en de rol van de oligomerisatie toestand van MxA voor zijn antivirale functie is onder debat ^9,11,12. In dit verband, Gao en medewerkers voorgesteld een model waarbij MxA oefent zijn antivirale activiteit door interactie met virale kerneiwitten in vorm van grote ringachtige oligomere structuren ^11. Echter, meer recentelijk, hebben we aangetoond dat MxA dimeren vertonen antivirale werking en interactie met het nucleoproteïne van influenza A virus ^12. Based op de kristalstructuur van MxA, Gao en collega's identificeerden verschillende aminozuurresten in de grensvlakgebieden die essentieel zijn voor de oligomerisatie in vitro en zijn antivirale werking ^11,13 zijn. Teneinde op te helderen die oligomere toestand van MxA antivirale activiteit uitoefent, zochten wij een eenvoudig protocol om de oligmeric staat MxA interface-mutanten tot expressie gebracht in humane cellen als endogeen MxA uitgedrukt IFNa na stimulatie snel vast te stellen.

Hoewel er vele technieken die gewoonlijk worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten bestuderen die de split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) complementatie bepaling ^14, oppervlak plasmon resonantie ¹⁵ en Förster resonantie energieoverdracht (FRET) ^16, ze geen informatie over de exacte stoichiometrie van een oligomeer eiwitcomplex. Voor het onderzoek van dit aspect technieken zoalsmulti-angle lichtverstrooiing (Mals) ¹⁷ en analytische ultracentrifugatie ¹⁸ zijn zeer nuttig. Gewoonlijk zijn de eiwitten geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen gezuiverde eiwitten. Oligomerisatie processen kunnen ook afhangen van andere cellulaire factoren. Als deze factoren zijn bekend, de analyse bemoeilijkt. Bovendien hebben sommige eiwitten moeilijk in E. coli en te zuiveren. Daarom zijn deze werkwijzen niet de optimale keuze eiwit oligomerisatie analyseren de cellulaire omgeving. Bovendien zijn deze technieken vereisen dure instrumenten die niet gemakkelijk beschikbaar zijn.

Niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), grootte-uitsluitingschromatografie of chemische verknoping gevolgd door gebruikelijke natrium dodecylsulfaat (SDS) -PAGE zijn nuttige hulpmiddelen voor het karakteriseren van de vorming van oligomeren van cellysaten ^2,19,20. Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden performed in een standaard laboratorium. We eerst geëvalueerd verschillende chemische verknoping protocollen die invariant tot aspecifieke aggregatie en precipitatie van MxA. Daarom hebben we de volgende geteste niet-denaturerende PAGE protocollen. Als niet-denaturerende PAGE gebruik van SDS uitsluit, de migratie van eiwitten afhankelijk van hun oorspronkelijke lading. Blauw-natieve PAGE gebruikt Coomassie brilliant blue G250 eiwitten met een totale negatieve lading, vergelijkbaar met SDS laden, maar niet het eiwit ²¹ denatureren. Helaas, Coomassie Brilliant blauw precipitaat in aanwezigheid van hoge zouten en tweewaardige kationen (bijvoorbeeld Mg ²⁺⁾ die vaak in lysis buffers. Afhankelijk van de gebruikte buffers, kan het moeilijk zijn om het monster zonder verdere optimalisering van stappen die een effect op het oligomeer eiwitcomplex konden analyseren.

Hier presenteren we een eenvoudig protocol op basis van een eerder gepubliceerde werkwijze ²² voor oligomerisatie van bepalenhuman MxA eiwit afkomstig van cellysaten met behulp van niet-denaturerende PAGE.

Protocol

Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op de eerder gepubliceerde niet-denaturerende PAGE ¹² protocol. In deze studie, de oligomere status van de MxA eiwit werd bepaald met behulp van Vero-cellen tot overexpressie MxA of IFN-α-gestimuleerde A549 cellen die endogene MxA. De hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt om de oligomere status van elke proteïne geanalyseerd naast MxA. Echter, kan verdere optimalisatie nodig.

1. Bereiding van cellysaat voor niet-denaturerende PAGE

OPMERKING: Om de oligomere toestand van de menselijke MxA eiwit te analyseren in een van beide Vero of A549-cellen werden 1,0 x 10 ⁶ cellen geoogst. Afhankelijk van het celtype en de overvloed van het eiwit te analyseren, moet het aantal cellen worden ingesteld. Het is ook belangrijk om de lysisbuffer beschermen tegen blootstelling aan licht, zodra het lichtgevoelige joodaceetamide toegevoegd.

1. Seed 0,3 x 10 ⁶ A549 of Vero-cellen per putje intot 6 goed gerechten. Houd de cellen in 2 ml kweekmedium per putje (zie tabel 1). Incubeer cellen 's nachts in een celkweek incubator (37 ° C, 5% CO _2).
2. Oogst de cellen door wassen met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en losmaken door toevoeging van 0,5 ml van 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 1x oplossing gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Zodra de cellen los van de schotel, voeg 0,5 ml groeimedium en meng voorzichtig door en neer te pipetteren.
4. Breng de cellen van elk putje in een 2 ml buisje en pelleteren ze met een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
5. Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren zonder verstoring van de cel pellet.
6. Was de cellen met 1 ml ijskoude PBS door voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer.
7. Pellet cellen in een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
8. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren without losmaken van de celpellet.
9. Resuspendeer cellen in 200 ul ijskoude lysisbuffer (zie tabel 1) door en neer te pipetteren en op ijs gezet.
10. Onmiddellijk beschermen lysaat van licht door het bedekken van de buizen met behulp van aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    OPMERKING: Na incubatie gedurende 30 min op ijs, is het niet langer noodzakelijk om het lysaat te beschermen tegen blootstelling aan licht, omdat de bescherming van de vrije thiolgroepen onomkeerbaar.
11. Verwijderen celresten door centrifugeren in een voorgekoeld tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
12. Equilibreren dialyse kolommen in dialysebuffer (Tabel 1) in de koude kamer bij 4 ° C gedurende 20 min in de centrifugatiestap. Gebruik een kolom met een molecuulgewicht cut off van 10.000.
    1. Bevestig de kolommen een float boei en ze in een beker gevuld met dialysebuffer. Om voorzichtig roeren te waarborgen, gebruik een magnetische roerder. Raak de membraan niet aan.
       LET OP: Dialyswordt kolommen kunnen worden gekocht of bereid uit 1,5 ml buizen volgens de werkwijze beschreven door Fiala en medewerkers ¹⁹ protocol.
13. Verwijder de kolommen uit de dialyse buffer en de vlotter boei. Breng de ontruimde lysaten in de voorbereide dialyse kolom door pipetteren zonder het aanraken van het membraan. Bevestig de kolommen aan een vlotter boei en zet ze terug in de beker gevuld met dialyse buffer.
14. Dialyseer het lysaat in een bekerglas met ijskoude buffer dialyse (Tabel 1) gedurende ten minste 4 uur (of bij voorkeur overnacht) bij 4 ° C onder voorzichtig roeren met een magneetroerder. Gebruik minimaal 100 ml dialysebuffer een 200 ul lysaat.
15. Breng het gedialyseerd monster in een 1,5 ml buis. Verwijderen precipitaten door centrifugeren in een tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Om de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen verder met het protocol (deel 2) onmiddellijk na de dialyse te voorkomen. Niet bevriezende bereide lysaten.

2. Elektroforese

OPMERKING: Elektroforese werd uitgevoerd zoals hiervoor is beschreven met enkele modificaties ^22. In de hieronder beschreven protocol werd prefab gradiënt gels gebruikt (4-15% gradiënt). Als alternatief kunnen de gels worden bereid in het laboratorium. Het is zeer belangrijk om denatureringsmiddel priori als SDS aan de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen voorkomen. Tijd van elektroforese werd geoptimaliseerd voor de verschillende oligomere toestanden van het menselijke MxA eiwit. Het kan echter variëren voor andere eiwitten, afhankelijk van de grootte van het oligomere complex en het bereik van de scheiding die verondersteld worden bereikt om het complex te analyseren. Daarom moet het optimale tijdstip van elektroforese empirisch worden bepaald. Voor optimale resolutie van de oligomeren te analyseren moet de huidige maximaal 25 mA.

1. Monteer de niet-denaturerende PAGE gel in de gel kamer. Vul tHij binnenste en buitenste kamer met vooraf gekoelde loopbuffer (tabel 1).
2. Voorlooptijd de gel met voorgekoeld loopbuffer bij 25 mA per gel gedurende 15 minuten in de koude kamer bij 4 ° C.
3. Meng 15 pl van het hierboven bereide lysaten met 5 ui 4x monsterbuffer (tabel 1). Mis het monster niet koken.
4. Laad 15 pl monster en een natief eiwit standaard keuze op de gel. Voer de elektroforese bij 25 mA gedurende 4 uur in de koude kamer bij 4 ° C.
   OPMERKING: Bij semi-kwantitatieve analyses, een eiwit kwantificering protocol (bijvoorbeeld een Bradford eiwittest ²³⁾ kunnen worden uitgevoerd om het laden van gelijke hoeveelheden totaal eiwit per laan waarborgen.

3. Western Blot

OPMERKING: Hieronder wordt het protocol van een natte western blot systeem. Elke blotting membraan kan worden gebruikt. Activeren polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen in 100% methanol voor equilibratie in blotting buffer. De semi-droge western blot techniek kan ook worden gebruikt, maar moet worden geoptimaliseerd voor grote oligomere complexen.

1. Demonteer de gel voorzichtig deze hoeveelheid in SDS-buffer (Tabel 1).
2. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
3. Bereid 2 sponzen, 4 cellulose filterpapier lakens en een blotting membraan per gel. Drenken in blotbuffer (tabel 1).
4. Monteer de sandwich als volgt (onder naar boven): 1 spons, 2 cellulose filter vellen papier, membraan, gel, 2 cellulose filter vellen papier, 1 spons.
5. Doe de sandwich in de blotting tank. Zorg ervoor dat het membraan wordt geconfronteerd met de pluspool, terwijl de gel wordt geconfronteerd met de minpool.
6. Vul het blotting tank met voorgekoeld blotting buffer.
7. Blot 90 mA overnacht bij 4 ° C voor de beste eiwit overbrenging leidt.
8. Demonteer de sandwich en visualiseer het eiwit standaard door incubatie van het membraan in Ponceau S oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
9. Destain het membraan door het zorgvuldig wassen van de Ponceau S met gedemineraliseerd water totdat u duidelijk de banden van het eiwit standaard kunnen zien.
10. Markeer de banden van het eiwit standaard met behulp van een pen.
    LET OP: Resterende Ponceau S kan interfereren met de immunokleuring. Om dit te voorkomen, kan het membraan verder worden ontkleurd door incubatie in 0,1 M NaOH gedurende 1 min en daaropvolgend wassen met gedeïoniseerd water.
11. Blokkeer het membraan met een blokkeerbuffer (zie tabel 1) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
12. Visualiseren eiwit (ten) van belang door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen het eiwit te analyseren.
    OPMERKING: De menselijke MxA eiwit werd gevisualiseerd met behulp van het konijn polyklonaal antilichaam specifiek voor humaan Mx1 verdund 1: 1000 in blockingbuffer (tabel 1). De antilichaamoplossing werd overnacht geïncubeerd bij 4 ° C. Als alternatief, het monoklonale eennti-MxA antilichaam (kloon 143) kan worden gebruikt (gegevens niet getoond) ^24.

Results

Het gebruik van niet-denaturerende PAGE, analyseerden we de oligomere toestand van het humane wildtype MxA, de dimere interface-mutanten MxA (R640A) en MxA (L617D) en de monomere-interface mutant MxA (M527D) vanaf ¹² cellysaten. Cellen werden gelyseerd in een buffer die 1% octylfenoxypolyethoxyethanol (NP-40) en joodacetamide om eiwitten oplosbaar en bescherming van de vrije thiolgroepen te verzekeren (zie figuur 1). Zoals eerder beschreven, werden zout en kleine metabolieten verwijderd door ...

Discussion

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die de snelle bepaling van de oligomere toestand van eiwitten in zoogdiercellen tot expressie gebracht door niet-denaturerende PAGE gevolgd door Western blot analyse. Het grote voordeel van deze aanpak is dat de oligomere status van een bepaald eiwit kan worden bepaald uit gehele cellysaten zonder voorafgaande eiwitzuivering. Dit kan belangrijk zijn voor eiwitten die oligomeriseren of hun functie in associatie uitoefenen met aanvullende factoren. Bovendien zijn de eiwitten nog ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Voorbereiden in dialysebuffer (indien glycerolverwijdering gewenst is) Kan zelf worden gemaakt volgens Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Vooraf draaien in uitloopbuffer om buffersysteem aan te passen
cOmplete, Mini, EDTA-vrij	Roche	11836170001	Gebruik 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  fles van 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S-oplossing	Sigma-Aldrich	P7170	TOXISCH draag handschoenen en bescherm ogen
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	Laad 5 µl/putje
A549 cellen	ATCC	ATCC CCL185	Laten groeien in groeimedium (zie Tabel 1)
Vero cellen	ATCC	ATCC CCL81	Laten groeien in groeimedium (zie Tabel 1)
anti-Mx1-antilichaam	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Gebruik bij een 1:1.000 verdunning
ECL Anti-konijn IgG, met paardenradijsperoxidase gekoppeld vol antilichaam (van ezel)	GE-Healthcare	NA934V	Gebruik bij een 1:10.000 verdunning
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamid   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	voorraad  100 mM
Broomfenolblauw	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyrovaat life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x      100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetaal bovien serum, gedialyseerd, VS-oorsprong 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filterpapier	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membraan	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan	Biosolve	0020092391BS
natriumfluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-vrij	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% oplossing	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
natriumorthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerofosfaat	Sigma Aldrich	G9422
Melkpoeder	Migros/Zwitserland
Methanol	Millipore	1.06009
natriumchloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesiumchloride (MgCl2)	Amresco	288
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
natriumhydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045