Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Samenvatting

Protocollen om de dynamica van chloroplast-stromules te onderzoeken, de stroma-gevulde buisjes die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van chloroplasten, worden beschreven.

Samenvatting

Stromules, oftewel "stroma-gevulde tubuli", zijn smalle, buisvormige uitsteeksels van het oppervlak van het chloroplast die universeel worden waargenomen in plantencellen, maar waarvan de functies nog steeds een raadsel zijn. Naast de groeiende aandacht voor de rol van chloroplasten bij het coördineren van plantreacties op stress, is de interesse in stromules en hun relatie tot de signaleringsdynamiek van chloroplasten de afgelopen jaren toegenomen, geholpen door vooruitgang in fluorescentiemicroscopie en eiwitfluoroforen die een snelle, nauwkeurige visualisatie van stromuledynamiek mogelijk maken. Hier bieden we gedetailleerde protocollen om de frequentie van stromules te meten in de epidermale chloroplasten van Nicotiana benthamiana, een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van de biologie van chloroplaststromules. We geven ook methoden voor het visualiseren van chloroplaststromules in vitro door chloroplasten uit bladeren te extraheren. Ten slotte beschrijven we bemonsteringsstrategieën en statistische benaderingen om verschillen in stromulefrequenties te analyseren als reactie op stimuli, zoals omgevingsstress, chemische behandelingen of gensilencing. Onderzoekers kunnen deze protocollen gebruiken als uitgangspunt om nieuwe methoden te ontwikkelen voor innovatieve experimenten om te onderzoeken hoe en waarom chloroplasten stromules maken.

Inleiding

Chloroplasten zijn dynamische organellen in plantencellen die verantwoordelijk zijn voor fotosynthese en een groot aantal andere metabole processen. Signaalroutes van het chloroplast oefenen ook aanzienlijke invloed uit op plantenfysiologie en -ontwikkeling, en coördineren plantreacties op omgevingsstress, pathogenen en zelfs bladvorm^1-6. Onlangs hebben biologen interesse gekregen in een slecht begrepen aspect van de chloroplaststructuur: stromules, zeer dunne stroma-gevulde buisjes die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van het chloroplast⁷.

De biologische functies van stromules blijven onbekend, hoewel bekend is dat de frequentie van stromules varieert als reactie op omgevingsstimuli^7-9, en stromules mogelijk in staat zijn om signaalmoleculen tussen organellen over te brengen⁶. Alle soorten plastiden (niet alleen de groene, fotosynthetische chloroplasten, maar ook heldere leucoplasten, zetmeel-gevulde amyloplasten en gekleurde chromoplasten, om slechts enkele soorten plastiden te noemen) maken stromules, en stromules zijn te vinden in alle landplantensoorten die tot nu toe zijn onderzocht. Stromules kunnen dynamisch uitrekken en terugtrekken, binnen enkele seconden verschijnen of verdwijnen, of ze kunnen lange tijd relatief stationair blijven. Een van de grote uitdagingen waarmee stromule biologen worden geconfronteerd, is dat stromules vaak worden bestudeerd met drastisch verschillende methoden, weefsels en soorten, waardoor vergelijkingen over de stromule biologieliteratuur moeilijk worden. Om verder te gaan, zullen standaardpraktijken en grondige beschrijvingen van de experimentele systemen die worden gebruikt om stromules te bestuderen, van cruciaal belang zijn voor het ontdekken van de functie van deze alomtegenwoordige kenmerken van chloroplastmorfologie.

Hier beschrijven we methoden voor het visualiseren van stromulevorming in de epidermale chloroplasten van Nicotiana benthamiana bladeren. In het mesofyl zijn chloroplasten dicht opeengepakt in grote, driedimensionale cellen, wat het moeilijk maakt om stromules nauwkeurig en snel te visualiseren door confocale microscopie. Daarentegen zijn epidermale cellen relatief plat, bevatten minder chloroplasten en bevinden zich op het oppervlak van het blad, waardoor gemakkelijke en snelle visualisatie van stromules mogelijk is. N. benthamiana is een ideaal modelsysteem voor deze experimenten omdat, in tegenstelling tot veel plantensoorten, alle cellen in de epidermis van N. benthamiana chloroplasten maken¹⁰. In de epidermis van de meeste planten, inclusief Arabidopsis thaliana, hebben alleen de stomabewakingscellen chloroplasten, terwijl andere epidermale cellen 'leucoplasten' hebben, plastiden die helder, relatief amorf en niet-fotosynthetisch zijn^9,11,12. Dus, terwijl een enkel gezichtsveld van een A. thaliana epidermis slechts een handvol chloroplasten in een paar bewakingscellen zou kunnen tonen, zou een gezichtsveld van een N. benthamiana epidermis tientallen of zelfs honderden chloroplasten omvatten. Alle hier beschreven methoden kunnen echter worden aangepast om andere vragen in stromule biologie te onderzoeken; bijvoorbeeld, we hebben dezelfde aanpak gebruikt om leucoplast stromules van A. thaliana te bestuderen⁹.

Protocol

LET OP: Voor dit protocol, hebben we ons gericht op het testen van stromule frequentie in de epidermis van N. benthamiana bladeren. Diverse stabiele transgene lijnen werden gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor dit doel, zoals 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ en NRIP1: Cerulean ^6. Beide lijnen tonen robuuste expressie van fluoroforen in de chloroplast stroma van bladeren gekweekt onder uiteenlopende omstandigheden. Als alternatief kan-chloroplast gerichte fluoroforen transient worden uitgedrukt in N. benthamiana via Agrobacterium-transformaties ^13. Dit is minder dan de ideale transgene lijnen, omdat Agrobacterium infiltraties enkele basale verdediging reacties in N. induceren benthamiana en interacties met Agrobacterium kunnen stromule frequentie veranderen in het blad ^14, potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Tenslotte, stromule vorming visualiseren in vitro,chloroplasten kunnen worden geëxtraheerd uit elke plantensoort, met behulp van genetisch gecodeerde fluoroforen of een fluorescerende kleurstof, zoals beschreven in hoofdstuk 5 hieronder. ^9,15

LET OP:. Methoden voor het kweken van planten zijn eerder beschreven ¹⁶ Kortom, groeien N. benthamiana planten in 4 "potten gevuld met elke professionele bodem mix die een goede drainage biedt. Bedek zaailingen met een doorzichtige plastic koepel voor de eerste 10-14 dagen de tijd om een vochtige omgeving voor het ontkiemen te bieden. In elke standaard meststof mix volgende instructies van de fabrikant om 14- dagen oude planten. Grow planten onder wit licht, met behulp van ~ 100 umol fotonen m ^-2 sec ^-1 lichtintensiteit. Waterplanten regelmatig.

1. Voorbereiding Leaf Monsters voor visualisatie

LET OP: Stromule dynamiek worden beïnvloed door verwonding ^8, dus het prepareren van weefsels onmiddellijk voor het visualiseren van stromule moeten worden uitgevoerds door confocale fluorescentiemicroscopie. Idealiter zou een monster gevisualiseerd met 15 minuten na verwijdering van de plant.

1. Snijd een klein deel van het blad met behulp van een zeer scherp scheermesje. Gebruik altijd hetzelfde gebied van het blad voor de consistentie, en er zeker van op hetzelfde oppervlak (adaxial of abaxiale) in alle experimenten te visualiseren.
2. Direct na het snijden het blad gedeelte onderdompelen blad sectie in een 5 ml naaldloze injectiespuit gevuld met water, verwijdert lucht uit de injectiespuit en een vacuüm toepassing voor de spuit opening met een vinger en het trekken van de zuiger.
   1. Laat de zuiger voorzichtig om te voorkomen dat schade aan het blad sectie. Herhaal deze twee of drie maal, of tot de meeste van de lucht is verwijderd en het blad lijkt diep groen.
      OPMERKING: Deze stap verwijdert lucht in het blad die kunnen interfereren met nauwkeurige visualisatie van stromules.
3. Voeg een druppel water op een dia en plaats het blad sectie over deze daling. Voeg vervolgens een andere Dr.op water naar de top van het blad, en plaats een dekglaasje op het blad. Als er sprake is van luchtbellen, tik dan zachtjes het deksel slip, totdat ze worden verwijderd. De slede is nu klaar voor microscopie en moet onmiddellijk worden gevisualiseerd.

2. Visualiseren Stromules met confocale fluorescentiemicroscopie

1. Met doorvallend licht gericht op een gezichtsveld nabij het midden van het blad sectie (weg van het beschadigd door het scheermesblad cellen). Gebruik een 20X objectief zodat veel chloroplasten gelijktijdig kunnen worden gevisualiseerd. Red een afbeelding met uitgezonden licht, zodat celtypes later kunnen worden onderscheiden, indien nodig.
2. Schakel de lichtbron een laser met geschikte excitatie en emissie filters voor de fluorofoor gebruikt. Bijvoorbeeld wekken GFP met een 488 nm laser en laat emissies tussen 500 nm en 525 nm.
   1. Met behulp van de microscoop software, selecteert u het GFP-kanaal en klik op de pinhole opening tot 1 Ai passenry unit. Selecteer laser scanning, om te beginnen met het visualiseren van het monster, en klik vervolgens op de GFP-kanaal naar de laser intensiteit en de detector winst voor het laservermogen te minimaliseren, terwijl nog duidelijk visualiseren stromules aan te passen. Zodra deze instellingen zijn vastgesteld, houden ze zo consistent mogelijk in alle experimenten.
3. Bereid een z -stack experiment dat een serie afbeeldingen verzamelt door het blad epidermis in het gezichtsveld.
   1. Voor de z -stack, omvatten alle epidermale chloroplasten in het gezichtsveld vertekening te voorkomen (bijvoorbeeld als chloroplasten nabij het bladoppervlak meer stromules onder geteste omstandigheden).
   2. Neem beelden op het maximale interval mogelijk dat onder alle stromules maar minimaliseren van de tijd die een z -stack. Als bijvoorbeeld 1 Airy eenheid is gelijk aan een in-focus confocale punt dat 2 urn diep, waarbij een afbeelding om 2 pm is waarschijnlijk ideaal.
      LET OP: Het blad epidermis een oneffen oppervlak, zodat de totale diepte van de z -stack zal variëren afhankelijk van het monster; z meeste -stacks nodig 10-20 beelden, maar kan meer.
   3. Pas scansnelheid en beeldresolutie als nodig is om ervoor te zorgen dat de z -stack snel wordt verzameld (meestal binnen 5-10 min, indien mogelijk). Sla de z -stack voor latere analyse.

3. Beeldverwerking

1. Bepaal stromule frequentie met behulp van een beeldanalyse-software. Voor dit protocol, raden we u aan ImageJ, dat voor het publiek beschikbaar zijn van de National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), of de populaire upgrade van ImageJ, Fiji is (http://fiji.sc / Fiji).
2. Samenvoegen de z -stack tot één beeld met behulp van de maximale intensiteit projectie in de software.
3. Identificeren en handmatig alle chloroplasten in de afbeelding te tellen.
4. Per chloroplast visueel vaststellen of één of meer stromulesworden gezien die zich uitstrekt van de chloroplast in beeld de samengevoegde z -stack. Voor voorbeelden, zie figuur 1.
   Opmerking: omdat de biologische functies van stromules niet bekend, kan elk dun, stroma-gevulde, buisvormig verlengstuk van de chloroplast worden beschouwd als een "stromule", ongeacht de lengte. Als algemene regel, een stroma-gevulde verlenging van het chloroplast is een stromule indien deze minder dan ongeveer 1 micrometer in diameter langs het grootste deel van zijn lengte ⁷ is. Zorg ervoor dat één persoon analyseert alle foto's te controleren voor subjectieve verschillen in het bepalen of een chloroplast heeft een stromule. Een tweede onderzoeker moet onafhankelijk controleren of de stromule frequenties subjectieve vooroordelen verder terug te dringen.

4. experimenteel ontwerp en Sampling

OPMERKING: Stromule frequentie sterk uiteen bladeren, maar verschillende rapporten suggereren dat er weinig variatie in stromule frequentie binnen een inddual blad ^9,17.

1. Bereken het blad stromule frequentie van een gezichtsveld van een blad. Gooi het blad, en beschouwen dit als een onafhankelijke steekproef. Houden geen rekening met aparte velden van uitzicht vanaf een blad als onafhankelijke steekproeven.
   LET OP: Er is geen sterke consensus over de beste manier om maatregel veranderingen in stromule activiteit, en totdat de functie van stromules wordt meer duidelijk omschreven, moeten onderzoekers blijven creatief bij het kwantificeren stromule dynamiek te zijn. Ter vergelijking in de literatuur echter gemeenschappelijke normen rapportage worden gebruikt in aanvulling op meer creatieve benaderingen. Op zijn minst bericht altijd de frequentie van chloroplasten die een of meer stromules hebben.
2. Bepaal de frequentie van chloroplasten die stromules in een gezichtsveld hebben. Gebruik ImageJ om alle chloroplasten te identificeren in een gezichtsveld. Vervolgens wordt voor elke chloroplast bepalen of de chloroplast ten minste ene stromule heeft gevormd. Verslag stromule frequentie als de percentage van chloroplasten met een stromule.
   LET OP: Sommige onderzoekers transformeren het percentage, bijvoorbeeld met de boogsinus transformatie, voordat de rapportage stromule frequenties; terwijl dit een optie voor statistische analyse, de boogsinus van stromule frequentie is niet een intuïtieve waarde, en hoeft niet te worden gemeld in de hoofdtekst of de cijfers van een studie.
   1. Als alternatief is, telt het totale aantal stromules en delen door het totale aantal chloroplasten.
      OPMERKING: In de meeste gevallen zal dit vergelijkbare resultaten te benaderen 4,2 opleveren; kan de frequentie stromule overschatten, maar als een chloroplast vele stromules gevormd. In de getoonde resultaten onder representatieve voorbeeld bijvoorbeeld enkele chloroplasten twee of meer stromules, waardoor het aantal stromules per chloroplast 40/87 (versus een stromule frequentie van 33/87).
   2. Als alternatief, bepalen de stromule lengte in plaats van stromule frequentie. Lengte kan worden gemetenin ImageJ door het traceren van de stromule met de vrije hand lijn tool.
      LET OP: Aangezien de biologische rol van stromules onbekend blijft, is het niet duidelijk dat stromule lengte invloed op hun functie. Melden significante verschillen in stromule lang als ze worden waargenomen, maar ook rapporteren stromule frequenties (zoals beschreven in 4.2).
      OPMERKING: Stromule frequentie kan zeer variabel tussen verschillende bladeren onder dezelfde groeiomstandigheden zijn. Daarom, hoewel het bepalen van stromule frequentie kan tijdrovend zijn, experimenten moeten worden zorgvuldig ontworpen om grote steekproeven te nemen. Gebruik datasets uit ons laboratorium hebben we vastgesteld dat een monster van ten minste 16 planten per behandeling meestal voldoende krachtig is om te bepalen of er een statistisch significant verschil van ten minste een 1,5-voudige verandering in stromule frequentie tussen twee condities (met standaard α = 0.05 en β = 0,80).
3. Statistische analyse van de resultaten.
   1. Om het me vergelijkeneen stromule frequenties van twee behandelingen, gebruik maken van de Welch t-test (ook bekend als de heteroscedastische t-toets of t-toets in de veronderstelling ongelijke variantie).
      Opmerking: Deze test is niet zo krachtig als t-toets conventionele Student's, maar Welch's t test is voordelig omdat het niet aannemen dat de variantie in stromule frequentieverdeling vergelijkbaar tussen behandelingen.
      LET OP: Aangezien stromule frequentie is een "deel", is haar steekproefverdeling voorspelde binomiale eerder dan normaal te zijn, die kan in theorie scheef statistische analyse als steekproefomvang zijn zeer laag is of als stromule frequentie is zeer laag (in de buurt van 0%) of zeer hoog (bijna 100%). Sommige rapporten hebben boogsinus transformaties gebruikt voor statistische analyse, die bedoeld is om een binomiale verdeling vormen naar een normale verdeling en dus voldoen aan de standaard eisen van een Student t-test of ANOVA. In de praktijk echter, eenrcsine transformaties hebben weinig of geen effect op de statistische analyse, en worden daarom niet aanbevolen. In plaats daarvan, herhaal experimenten om steekproefomvang, die statistische power zal toenemen en het aantal fouten in de interpretatie van de gegevens te verhogen.
   2. Wat statistische aanpak wordt gebruikt, moet u zorgvuldig verslag van de bemonsteringsstrategie, steekproefgrootte, statistische test, en p-waarde voor elk experiment.
      OPMERKING: Net als bij andere gebieden van de biologie, kan een p-waarde van minder dan 0,05 worden beschouwd als "statistisch significant", hoewel de onderzoekers zeker de exacte p-waarde verkregen moet melden. Als p iets boven 0,05, waardoor de steekproefomvang met twee of drie experimenten kunnen helpen verduidelijken of het verschil waargenomen reproduceerbaar en statistisch significant.

5. extraheren Intact Bladgroenkorrels te visualiseren Stromule Dynamics

LET OP: verschillende methodenzijn gebruikt om chloroplasten isoleren van bladeren, met een enigszins ander protocol in een recente studie over stromule formatie in vitro ^15. Het protocol hieronder gebruikt een betrekkelijk eenvoudige methode die biochemisch pure chloroplast monsters niet oplevert, maar in plaats daarvan een grote hoeveelheid intacte, gezonde chloroplasten ^9,18 isoleren.

1. Bereid koude extractie buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM _MgCl2 en 1,0 mM _MnCl2. Breng de pH op 6,9 met NaOH en HCl, en in de koelkast voor gebruik.
   OPMERKING: Hoewel niet noodzakelijk, met koud buffers en het opslaan van monsters op ijs indien mogelijk een groter deel van intacte chloroplasten verkregen.
2. Bereid isolatie buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM _MnCl2, 1,0 mM _MgCl2, 10 mM KCl en 1,0 mM NaCl. Breng de pH op 7,6 met NaOH en HCl en in de koelkast voor gebruik.
3. Of de vleugels nietexpressie van een genetisch gecodeerde stromale fluorofoor, voor te bereiden carboxyfluoresceïne (CFDA) oplossing: 50 mm CFDA voorraad oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) (2,3 mg CFDA per 1,0 ml DMSO).
   OPMERKING: De precieze concentratie is niet kritisch. Houd CFDA voorraad in het donker te allen tijde. WINKEL kleine fracties 50 mM CFDA bij -20 ° C.
4. Om chloroplasten isoleren, te verwijderen ~ 5-10 g bladeren van verschillende planten en kort afspoelen met koud water. Onmiddellijk over naar 50 ml koude extractiebuffer. Grind bladeren met behulp van een blender met een aantal korte pulsen. Filtreer door twee of drie lagen kaasdoek te bladeren vuil te verwijderen, verdelen de geëxtraheerde chloroplasten twee 50 ml centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 1 min bij 750 x g.
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de groene chloroplasten in 10 ml isolatie buffer. Centrifugeer opnieuw gedurende 1 min bij 750 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer chloroplasten geïsoleerd buffer eindvolume tot 5 ml wordt.
6. overdracht 201, l van de chloroplasten aan een dia, dek af met een dekglaasje, en beginnen microscopie.
   Opmerking chloroplasten van transgene planten die plastidegerichte fluorescente proteïnen zijn nu klaar voor visualisatie door confocale fluorescentiemicroscopie.
7. Vlek chloroplasten van planten die niet tot expressie plastidegerichte fluorescerende eiwitten te stromules te visualiseren.
   1. Voeg 5 ul van 50 mM CFDA bouillon aan de 5 ml chloroplasten gesuspendeerd in isolatie buffer. Breng het uiteindelijke concentratie 50 uM.
   2. Sta chloroplasten incuberen 5 min, en vervolgens over een kleine hoeveelheid (~ 50 pi) van een glijbaan, bedek met een dekglaasje en beginnen microscopie.
   3. Gebruik een FITC of GFP filter set. Gebruik een 20X objectief te veel chloroplasten gelijktijdig te visualiseren, of een hoger doel een enkele geïsoleerde chloroplast te visualiseren.
      LET OP: CFDA zal fluoresceren in het stroma van intacte chloroplasten.
   4. Als er sterke achtergrondfluorescentie, was de chloroplasts opnieuw in 10 ml isolatie buffer na 5 min incubatie met CFDA Centrifugeer gedurende 1 min bij 750 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 ml isolatiebuffer.

Resultaten

Dit protocol werd gebruikt om stromule frequentie visualiseren overdag en 's nachts in de zaadlobben van jonge N. benthamiana zaailingen. Segmenten van een z-stack werden samengevoegd tot één beeld (figuur 1A). Voor visuele doeleinden, dat het was toen desaturated en omgekeerd, zodat stroma zwart is (Figuur 1B). De chloroplasten werden bestempeld, hetzij als zonder stromules (groene asterisk) of met ten minste één stromule (magenta ...

Discussie

Bij onderzoeken stromules moeten drie belangrijke factoren gedurende beschouwd: (i) manipulatie van het plantenweefsel moet tot een absoluut minimum worden gehouden, (ii) het experimentele systeem worden consequent gehouden, en (iii) bemonsteringsstrategieën moet zorgvuldig worden gepland verzekeren robuust zijn reproduceerbare data geanalyseerd.

Stromules zijn opmerkelijk dynamisch: ze kunnen verlengen en intrekken snel voor de ogen van een waarnemer onder de microscoop. Bovendien stromule ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software voor het analyseren van biologische beelden