Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Summary

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Abstract

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Introduction

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to....

Protocol

LET OP: Voor dit protocol, hebben we ons gericht op het testen van stromule frequentie in de epidermis van N. benthamiana bladeren. Diverse stabiele transgene lijnen werden gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor dit doel, zoals 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ en NRIP1: Cerulean ^6. Beide lijnen tonen robuuste expressie van fluoroforen in de chloroplast stroma van bladeren gekweekt onder uiteenlopende omstandigheden. Als alternatief kan-chloroplast gerichte fluoroforen transient worden uitgedrukt in N. benthamiana via Agrobacterium-transformaties ^13. Dit is minder dan de ideale transg....

Results

Dit protocol werd gebruikt om stromule frequentie visualiseren overdag en 's nachts in de zaadlobben van jonge N. benthamiana zaailingen. Segmenten van een z-stack werden samengevoegd tot één beeld (figuur 1A). Voor visuele doeleinden, dat het was toen desaturated en omgekeerd, zodat stroma zwart is (Figuur 1B). De chloroplasten werden bestempeld, hetzij als zonder stromules (groene asterisk) of met ten minste één stromule (magenta .......

Discussion

Bij onderzoeken stromules moeten drie belangrijke factoren gedurende beschouwd: (i) manipulatie van het plantenweefsel moet tot een absoluut minimum worden gehouden, (ii) het experimentele systeem worden consequent gehouden, en (iii) bemonsteringsstrategieën moet zorgvuldig worden gepland verzekeren robuust zijn reproduceerbare data geanalyseerd.

Stromules zijn opmerkelijk dynamisch: ze kunnen verlengen en intrekken snel voor de ogen van een waarnemer onder de microscoop. Bovendien stromule .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images