Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54695

⸱

26 november 2016

 ,  ,  , 
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.

Samenvatting

Honingbijen demonstreren verbazingwekkend leervermogen en geavanceerde sociaal gedrag en communicatie. Bovendien is hun hersenen is klein, eenvoudig te visualiseren en te bestuderen. Daarom hebben de bijen al lang een geliefd model onder neurobiologists en neuroethologists voor het bestuderen van de neurale basis van sociaal en natuurlijk gedrag. Het is echter belangrijk dat de experimentele technieken voor bijen studie niet interfereren met het gedrag bestudeerd. Hierdoor was het noodzakelijk om een ​​reeks van technieken voor farmacologische manipulatie van honingbijen ontwikkelen. In dit artikel tonen we aan methoden voor de behandeling van ingehouden of vrij vliegende honingbijen met een brede waaier van farmacologische middelen. Deze omvatten zowel niet-invasieve methoden zoals orale en topische behandelingen, evenals meer invasieve methoden maken het precies geneesmiddelafgifte in zowel systemische of gelokaliseerde wijze. Tot slot bespreken we de voor- en nadelen van elke methode en beschrijfvoorkomende hindernissen en de beste manier om te overwinnen hen. We sluiten af ​​met een discussie over het belang van het aanpassen van de experimentele methode om de biologische vragen in plaats van andersom.

Inleiding

Sinds Karl von Frisch toegelicht hun danstaal 1, hebben de bijen een populaire studie soort bleef voor onderzoekers in het gedrag van dieren en neurobiologie. In de afgelopen jaren een groot aantal nieuwe disciplines zijn ontstaan op de kruising van deze twee gebieden, en diverse andere disciplines (zoals moleculaire biologie, genomics, en informatica) hebben samen met hen ontstaan. Dit heeft geleid tot een snelle ontwikkeling van nieuwe modellen is te begrijpen hoe gedrag resulteert uit activiteit in het zenuwstelsel. Vanwege het unieke lifestyle, rijke gedragsrepertoire, en het gemak van de experimentele en farmacologische manipulatie, hebben de bijen in de voorhoede van deze revolutie bleef.

Honingbijen worden gebruikt om fundamentele neurobiologische vragen zoals die ten grondslag liggen aan leren en geheugen 2,3, besluitvorming 4, olfactorische 5 of visuele verwerking 6 bestuderen. In de afgelopen jaren, de honey bee is zelfs gebruikt als een model voor de studie onderwerpen algemeen gereserveerd voor medisch onderzoek, zoals de effecten van verslavende drugs 7-11, slaap 12, 13 veroudering, of de onderliggende mechanismen narcose 14.

In tegenstelling tot de klassieke genetische modelorganismen (bijvoorbeeld D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), zijn er maar weinig genetische hulpmiddelen beschikbaar voor het manipuleren neurale functies honingbijen, hoewel dit nog verandert 15. In plaats daarvan hebben honingbij studies vooral vertrouwd op farmacologische manipulaties. Dit is zeer succesvol geweest; De diversiteit van bijenonderzoek zodanig dat verschillende werkwijzen voor farmacologische toediening nodig. Onderzoek met honingbijen behandelt de meest uiteenlopende vragen, wordt bestudeerd door onderzoekers uit verschillende disciplines en achtergronden, en maakt gebruik van een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. veel reseboog vragen vereisen bijen ofwel vrij vliegen, vrij interactie in hun kolonie, of beide. Dit kan het moeilijk maken om bij te houden van de afzonderlijke proefdieren te houden, en maakt terughoudendheid of infusen onhaalbaar.

Om de diversiteit van de honingbij onderzoek tegemoet te komen, een verscheidenheid van drug delivery methoden nodig, waardoor robuuste en flexibele administratie met dien verstande dat de farmacokinetische en farmacodynamische profielen, invasiviteit van de methode en de betrouwbaarheid, past het paradigma in kwestie. Vanwege deze uiteenlopende behoeften, hebben de meeste onderzoeksgroepen hun eigen unieke Drug Administration methoden ontwikkeld. Tot nu toe, dit is een sterkte van de bij onderzoeksgemeenschap; het heeft geleid tot de ontwikkeling van reeksen methoden waardoor toediening van hetzelfde geneesmiddel in verschillende omstandigheden. Ons doel is om geen enkele gestandaardiseerde methode voor farmacologische manipulatie van bijen te ontwikkelen, maar om methoden te benadrukken dathebben bewezen bijzonder succesvol te zijn, en helpen onderzoekers nemen deze. We bespreken de basisprincipes van hun werking en hun voordelen en nadelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Drug Administration voor Uitgeruste Bees

  1. orale behandeling
    1. Bereid 1,5 M sucrose oplossing door het mengen van 257 g sucrose met 500 ml water (het is gemakkelijker om deze hoeveelheid sucrose oplossen in kokend water). Bewaar sucrose-oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
      OPMERKING: Sucrose-oplossing biedt een zeer gastvrije omgeving voor bepaalde micro-organismen, en dus gemakkelijk verontreinigd raakt en onverteerbaar voor bijen. Bulk sucrose oplossing kan worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
    2. Beslis over een geschikte dosis drug (hoe het te bereiken, komt aan bod in de discussie hieronder), en voor te bereiden een oplossing zodanig dat de dosis geprefereerde geneesmiddel wordt opgelost in 20 ui sucrose-oplossing (bijvoorbeeld om te leveren 20 ug, verdunnen drug in een verhouding van 1 mg / ml). Harness bijen volgens Felsenberg et al. (2011) 16. Doe deze stap ten minste 12 uur voor behandeling met geneesmiddelen om ervoor te zorgen dat de bijen niet meer gestresst out van gebruik te maken van wanneer het geneesmiddel oplossing wordt gepresenteerd.
      OPMERKING: Voor meer consistente resultaten, het beste bijen verhongeren (door ingezet bijen in een incubator bij 34 ° C en 70% luchtvochtigheid) O / N.
    3. Met behulp van een micropipet, raakt een daling van 1,5 M sucrose water om de antenne van een benut bij. Als de snuit is verlengd, raakt een 20 ul druppel 1,5 M sucrose die het geneesmiddel rechtstreeks aan de slurf van de honingbij. Zorg ervoor dat de bijen verteert alles. Als controle voertuig te gebruiken 1,5 M sucrose oplossing zonder toegevoegde geneesmiddelen.
      LET OP: De hoeveelheid sucrose oplossing zou moeten worden aangepast op basis van experimentele plannen. Als appetitive conditioning is bedoeld, het voeden van de bijen gewoon voor de training zal bemoeien met responsiviteit bijen.
    4. Gooi of terzijde bijen dat niet alle van de sucrose verbruiken.
      LET OP: Als een groot aantal bijen niet aan de sucrose-oplossing te drinken, moet het voederen schema aan te passen.
  2. Injectie in de thorax
    1. Bereid drug in honingbij de Bel 17 als volgt:
      1. Mix en autoclaaf 7,45 g NaCl, 0,448 g KCI, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g sucrose, 4,95 g D-glucose en 2,48 g HEPES in 1000 ml water. Wees voorzichtig bij het opslaan van de Bel als het gemakkelijk is besmet. Aliquot en bewaar Ringer bij -20 ° C tot gebruik.
      2. Los het geneesmiddel in Ringer-oplossing en vervolgens verdund zodat de gewenste hoeveelheid aanwezig is 5 ul. Als voorbeeld, wanneer de bijen worden behandeld met 5 ug van een geneesmiddel, 1 g kan aanvankelijk worden opgelost in 1 ml Ringer, alvorens te worden verdund 1: 1000 in Ringer voor een definitieve oplossing van 1 ug / ul.
        OPMERKING: U handel verkrijgbaar PBS (fosfaat-gebufferd Salin) kan worden gebruikt in plaats van Ringer oplossing.
    2. Maak een microscalpel door het afbreken van de hoek van een tweesnijdend scheermesje meteen bladhouder. Bevestig het blad fragment van een mes houder, zodat het een mooi mes met een scherpe eindpunt.
    3. Onder een stereomicroscoop, zorgvuldig gebruik microscalpel een 2 mm gat juist boven het schildje naast de achterste vleugel werkwijze thorax een bijen. Vermijd het snijden te diep, omdat dit zou kunnen verwonden vlucht spieren, en wees voorzichtig aan de vleugel scharnieren te voorkomen. Idealiter alleen knippen drie zijden, zodat de flap van cuticula later kan worden teruggevouwen naar de plaats van letsel te sluiten.
    4. Met behulp van een micropipet, depot 5 μlL gekleurde (of PBS) die het geneesmiddel bovenop de opening in de thorax. nauwlettend onder de microscoop om ervoor te zorgen het hele druppel wordt geabsorbeerd in de hemolymfe. Gebruik van de Bel (of PBS) als een controle voertuig.
    5. Indien mogelijk, bewegen de cuticula flap terug over het gat. Na 5-10 uur, zal het opnieuw te bevestigen en te verzegelen.
      Opmerking: Als alternatief voor deze techniek injecteren 1 pi rechtstreeks in de thorax met een glazen injectiespuit, na het openen van eell gat in het midden van de frenum (dwarslijn in het achterste gedeelte van het schildje) met een injectienaald (diameter: 0,6 mm, G: 23). Dit omzeilt de noodzaak om eerst de thorax gesneden met een scalpel en de injectieplaats kleiner, maar deze methode zal de injectieplaats blootgesteld verlaten.
  3. ocellus injectie
    LET OP: Dit is een methode geschikt is voor het leveren van moleculen in de hele kop capsule, in de hemolymfe.
    1. Bereid drugs zoals in 1.2.1, maar aan te passen geneesmiddel concentraties zodanig dat de gewenste dosis zullen worden opgenomen in 1 pl van Ringer of PBS (minder volume kan worden geabsorbeerd door de ocellus gat dan door de thorax).
    2. Bereid een microscalpel als in 1.2.2. Onder een stereomicroscoop, blokkeer je de kop van een ingezet bij in plaats van het vullen van de nek spleet met was. Gebruik lage temperatuur smeltende was (bijvoorbeeld tandheelkundige wax) om schadelijke antennal olfactorische receptoren of andere cellen die ik kan voorkomenmportant voor de beoordeling van het gedrag (bijvoorbeeld, olfactorische leren). Dan voorzichtig de lens van de mediaan ocellus door de tip van de microscalpel onder de lens en de lens voorzichtig breken vrij van de kop capsule.
      LET OP: Het is ook mogelijk om de was zorgvuldig te plaatsen over de antennes om verplaatsing te voorkomen.
    3. Voorzichtig pipet geneesmiddel op de ocellus gat. Wacht tot alle in de kop capsule wordt genomen. Verwijder tandheelkundige was van de antennes en laat de bijen om te rusten voor een tijdje voordat de voortzetting van de experimentele procedure. Gebruik van de Bel (of PBS) als een controle voertuig.
  4. Injectie in de ocellar darmkanaal
    NB: De ocellar darmkanaal bevat grote vezels, aan te sluiten op de meeste regio's van de centrale hersenen 18. Deze behandelmethode maakt aanbrengen verbindingen alleen de hersenen, maar niet gericht op specifieke subregio's van de hersenen.
    1. Bereid bijtje als in 1.3.2. en verwijder de lens van de mediaan ocellus met de tip van een microscalpel als in 1.3.3.
      LET OP: Dit kan worden gedaan om 2 uur voor de injectie. Op basis van onze ervaring, gevoed bijen zijn beter in staat om te gaan met deze operatie dan uitgehongerd bijen
    2. Vul een 10 ul glazen injectiespuit met een kleine overdruk (bijvoorbeeld 33, diameter: 210 pm) naald met geneesmiddeloplossing bereid zoals in 1.3.1.
    3. Met behulp van een handmatige micromanipulator, plaatst de spuittip door de ocellar netvlies in het hoofd capsule tot een diepte van 50 urn en injecteer 250 nl oplossing.
    4. Spoel na gebruik de injectiespuit 3 maal met gedestilleerd water en 3 maal met 75% ethanol.
  5. Micro-injectie in bepaalde hersenstructuren
    OPMERKING: Naast de bovengenoemde systematische behandelingen, is het mogelijk om micro-injecties uitvoeren naar bepaalde hersenstructuren. Dit zorgt voor farmacologische manipulatie van één of meer hersenen, terwijl anderen beïnvloed. Dit werkthet beste met hersengebieden die gemakkelijk te herkennen uit de voorste hersenen oppervlak (bijv antennaal lobben, champignon lichaam calyces of verticale lobben, of de optische kwabben) zijn, maar ook andere regio's zijn gericht. Houd er rekening mee dat de oriëntatie (anterior / posterior, dorsale / ventrale) verwijst naar het lichaam as, in plaats van, dan naar de neuraxis 19.
    1. Bereid het geneesmiddel in Ringer of PBS op dezelfde wijze als in 1.2.1, toevoegen van een fluorescerend (bijvoorbeeld 0,5 mg / ml dextran, Alexa 546 of 568 fluor) of niet-fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld, 1 mM methyleenblauw).
      LET OP: De toevoeging van een fluorescerende kleurstof zal de verificatie van de injectie locatie kan worden na het experiment voorbij is (met behulp van confocale microscopie, volgende hersenen dissectie), terwijl niet-fluorescerende kleurstoffen mogelijk directe controle tijdens het experiment.
    2. Om glazen pipetten voor injectie te maken, plaatst glas haarvaten van de juiste diameter in de houder klemmen van een elektrode trekker (1,0 mm voor de standaard holder opgenomen voor de in de lijst genoemde materialen microinjector). Pas pull en temperatuurinstellingen tot een ongeveer 0,5 cm lang tip produceren (instellingen verschillend voor elke trekker, zelfs als hetzelfde model wordt gebruikt).
      OPMERKING: Idealiter twee pipetten getrokken uit een glazen moet dezelfde lengte en vorm hebben, zodat beide kunnen worden gebruikt.
    3. Onder een stereomicroscoop, breken de uiteinden een buitendiameter van ongeveer 10-15 urn, gebaseerd op visuele schatting met een weegschaal op een raster ingevoegd in het oculair. De stappen op de schaal worden bepaald door de fabrikant kan worden gecorrigeerd voor de vergroting gebruikt.
    4. Vervolgens vul het glas pipetten met de oplossing te injecteren. Als glazen capillairen met filamenten worden gebruikt, vul de pipet door het plaatsen van de achterkant in de drug oplossing, anders tip te vullen met behulp van microloader tips.
    5. Plaats de gevulde glazen pipet in de capillaire houder van een microinjectie, die wordt bestuurd door een handmatig of elektronisch micromanipulator.
    6. Kalibreer de microinjector het gewenste volume te injecteren (0,5-2 nl, afhankelijk van de grootte van de hersenstructuur getarget). Hiervoor direct te injecteren in een kleine petrischaal met minerale olie en de diameter van de druppel met het raster. Wijzig instellingen totdat het gewenste volume is bereikt.
    7. Bevestig de kop van een ingezet bij gebruik zachte tandheelkundige was zoals in 1.3.2, voor het snijden van een opening in het voorste deel van het hoofd capsule, met een microscalpel, met drie delen: een net onder de mediaan ocellus (ventrale), een voor de rand van de rechter- of linkeroog en boven de antenne stengels (dorsale). Gebruik een stuk van tandheelkundige wax aan de geopende klep op zijn plaats houden.
    8. Duw klieren en de luchtpijp die bovenop de hersenen vernietigd met behulp van fijne pincet, vervolgens een kleine breuk in de neurilemma (zeer dun vlies rond de hersenen) boven de beoogde hersenstructuur.
      NB: Als er veel bijen in een keer worden behandeld, deze procedurekan eerder worden uitgevoerd; Maar wees voorzichtig om niet bijen in deze toestand te lang (niet meer dan 30 min) te verlaten, omdat hun hersenen zouden kunnen uitdrogen.
    9. Steek de punt in het gewenste gebied van de hersenen, en pas de diepte loodrecht op de hersenen oppervlak (bijvoorbeeld 60 micrometer voor paddestoel lichaam kelken). Injecteer de vooraf ingestelde volume. Voor laterale gebieden van de hersenen, injecteren bilateraal (dwz u een injectie om elk halfrond). Als een niet-fluorescerende kleurstof wordt gebruikt, zorgen de injectie plaatsvond op de juiste regio van observatie tijdens het injecteren. Als een fluorescerende kleurstof wordt gebruikt hetzelfde doen bij tl-licht met behulp van een stereomicroscoop met een fluorescentie-viewing-systeem.
    10. Daarna plaatst u de geopende klep terug over het hoofd van de bijen. Smelt een kristal van eicosaan, die ongeveer 1 mm in diameter, met een dunne draad rond het uiteinde van een micro soldeerbout (smelttemperatuur is 35-37 ° C) en sluit de sneden. Dit zal sterk verminderen van de sterfte.
    11. Laat de ... Losbee van het harnas voor gedragsanalyse (maar zie bespreking), of te houden in het harnas voor experimenten op ingetogen bijen - bijvoorbeeld proboscis extensie reflex (PER) testen 20.
    12. Als een fluorescerende kleurstof werd gebruikt, ervoor zorgen dat de injectie raakte het gebied van belang na het experiment is boven het gebruik van een confocale laser scanning microscoop (Fig. 1).
      LET OP: Dit is vooral handig wanneer de doelgroep diepere hersengebieden (waar het moeilijk zou zijn om niet-fluorescerende kleurstof te zien tijdens de injectie fase).

2. Drug Administration Methoden voor Free-flying Bees

  1. orale behandeling
    1. Bereid geneesmiddel op dezelfde manier als in stappen 1.1.1-1.1.2. Voeg drug oplossing voor een feeder en plaats in de koelkast voor opslag.
      OPMERKING: Elke feeder zal doen, zoals een omgekeerde dop van de fles of een potje omgekeerd op vloeipapier.
    2. Train bijen aan een zwaartekracht feeder met 1 M of 0,5M sucrose oplossing door een feeder dichtbij de korf. Zodra bijen beginnen fourageren op de feeder, geleidelijk verder weg, tot het op een comfortabele afstand om te voorkomen dat gestoken (minimum 5 m).
    3. Paint-mark bijen om bij te houden van de individuele bijen te houden. Maak een lijst van alle kleurencombinaties die zullen worden gebruikt. Wanneer een honingbij landt op de feeder, zorgvuldig markeren haar buik met twee kleuren, en noteer op de lijst die de combinatie wordt genomen.
    4. Wissel de zwaartekracht feeder voor een feeder die het geneesmiddel / sucrose-oplossing. Let op de gemarkeerde bijen die de feeder te bezoeken. Vang elke ongemarkeerde bij een bezoek aan de feeder als bijen zijn productief recruiters, en de nummers van de bijen een bezoek aan de gedrogeerde feeder kan snel uit de hand. Dit is vooral problematisch wanneer hetzelfde experiment wordt uitgevoerd op opeenvolgende dagen, naïef bijen niet langer naïef kunnen zijn.
      LET OP: Als een alternatief voor het trainen van individuele bijen aan een feeder, vorige auteurs hebben met succes fed-drug geregen sucrose water om een hele korf 21-23.
  2. plaatselijke behandeling
    Opmerking: Het doel is om de verbinding van belang te lossen in een oplosmiddel dat de wasachtige insect cuticula kunnen dringen. Verschillende oplosmiddelen kunnen worden gebruikt voor dit doel. De meest gebruikte omvatten aceton, dimethylformamide (DMF) en dimethylsulfoxide (DMSO).
    1. Beoordelen welke oplosmiddel het beste werkt voor de verbinding bij de hand. Als er een sterke fenotype wordt verwacht van overdosering (bijvoorbeeld verlamming of de dood), behandel bijen (stap 2.2.2) met een hoge dosis (bijvoorbeeld 20 ug cocaïne 7) opgelost in elk van de verschillende oplosmiddelen en nauwlettend totdat verlamming of de dood.
    2. Met een 1 pi microcapillaire (of een injectiespuit, die op geschikte herhalende dispenser monteerbaar) en microcapillaire houder trekken 1 pl van de geneesmiddeloplossing (bijvoorbeeld 381, g / ul cocaïne) in de capillair. Verdrijf de druppel, en zorgvuldig schilderen op de thorax van een duidelijke bee. Bedek groot als van een gebied met een mogelijke oplossing, in plaats van het verlaten van een vaste druppel, als bij is dan waarschijnlijk te verzorgen af. Wees voorzichtig niet om de verbinding contact opnemen met de vleugel scharnieren, of dit kan het tekenen van de thorax en langs de vleugels, waar het zonder te worden opgenomen in de hemolymfe zal verdampen.
      OPMERKING: Afhankelijk van het onderzoeksdoel, kan deze methode ook gebruikt worden om medicijnen toe te dienen aan de buik van de bijen. Echter, drugs bereikt het CZS sneller en in grotere hoeveelheden wanneer toegepast op de thorax 24 .Het werkwijze werkt evengoed met ingezet als bij vrij vliegende bijen.
  3. verdampte behandeling
    1. Ontbinden drugs (voorheen deze methode is gebruikt om cocaïne leveren honingbijen 10) in 100% ethanol. Oplosbaarheid gen mag een hydrochloride of andere zoutvormen van het nietdrug indien mogelijk. Bij een verdunning te bereiden, zodat de hoeveelheid aan een bij te leveren is aanwezig in 100 pl. Gebruik pure ethanol als een controle voertuig.
    2. Om een filament maken, gebruikt u dezelfde procedure als McClung en Hirsh 25.
      1. Kort toegelicht: liquideren nichroom draad strak om een ​​spijker en hechten aan twee elektrische draden (één aan elk uiteinde van de gloeidraad). Verwijder de nagel. De resterende nichroom spoel wordt aangeduid als de gloeidraad.
      2. Leid de twee draden goed door gaten in het deksel van een 50 ml centrifugebuis, die resistent zijn tegen de gekozen temperatuur dient. Lijm de draden op zijn plaats met vloeibare siliconen.
        LET OP: Dit zal de buis luchtdicht te maken. Dit is essentieel om secundaire blootstelling aan het experiment en kunnen de bijen worden behandeld met het geschikte dosis.
    3. Bevestig de kabels van de gloeidraad op een voedingsbron. Met behulp van een thermokoppel om de temperatuur te meten vanhet filament, experimenteren met verschillende spanning / stroom combinatie totdat die resulteert in een geschikt temperatuurprofiel voor het geneesmiddel in kwestie, idealiter, die zorgt voor 10 sec verwarming of minder. Dit is zeer belangrijk, het relevante literatuur (bijvoorbeeld, zodat cocaïne vluchtig moet worden verwarmd tot ten minste 200 ° C, maar bij temperaturen boven 350 ° C wordt afgebroken tot secundaire verbindingen 26).
    4. pipet zorgvuldig 100 pl geneesmiddel bevattende ethanol oplossing op de gloeidraad. Verdeel de vloeistof over zoveel filament oppervlak mogelijk, omdat dit de verdamping efficiency zal toenemen. Laat het filament bloot bij kamertemperatuur totdat alle ethanol verdampt.
      Opmerking: Als de ethanol onvoldoende is verdampt, zal bijen worden behandeld met zowel het middel van keuze en ethanol. Bijen zijn uiterst gevoelig voor ethanol en sommige geneesmiddelen hebben synergistische interacties met ethanol stellen die voorspanning experimental resultaten.
    5. Zodra de ethanol volledig verdampt (drug neerslag kan meestal worden gezien op de droge vezel onder een microscoop), vang een vrij vliegende bij in een 50 ml buis. sluit voorzichtig het deksel met de gloeidraad.
    6. Schakel de stroom gedurende 10 seconden, schakel de stroom uit en wacht nog eens 50 sec (zodat de vervluchtigde verbinding te koelen en daardoor condenseren of borg). Laat de bijen.
      OPMERKING: Hoewel deze behandeling methode werkt uitstekend voor free-vliegende bijen, kan het net zo goed met de bijen ingezet worden gebruikt. Eenvoudigweg de spande bijen in een 50 ml buis. Reload de gloeidraad, zoals beschreven in 2.3.4 tussen bijen. Voor hogere doorvoer kan meerdere filamenten parallel worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een selectie van representatieve resultaten van de hierboven beschreven werkwijzen zijn getoond, primair te tonen dat de werkwijzen maken farmacologische middelen naar de hersenen bereiken en beïnvloeden honingbij gedrag.

Specifieke effecten op hersenen processen kunnen gemakkelijk worden verkregen na injectie thorax.

Omdat farmacologische middelen geïnjecteerd door de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hierboven beschreven methoden kunt eenvoudige, effectieve en robuuste behandeling van ofwel free-flying of benut honingbijen. Deze werkwijzen kunnen op tal experimentele paradigma en biologische bevat (Tabel 1). Alle free-flying werkwijzen kunnen eenvoudig worden toegepast op benut bijen. Het omgekeerde is minder succesvol, maar omdat tijdelijke beperking en invasieve behandelmethoden vaak compromis vliegende vermogen bijen.

De methoden zijn gepresenteerd vanuit een brein...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd gefinancierd door ARC-subsidie DP0986021 en NHMRC-subsidie 585442. ABB wordt ondersteund door een ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP wordt ondersteund door een iMQRES-beurs toegekend door Macquarie University en door een DAAD-Doktorandenstipendium toegekend door de German Academic Exchange Service. JMD wordt ondersteund door CNRS en University Paul Sabatier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SucroseSigma-AldrichS8501Elke leverancier is voldoende
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333 
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Calcium Chloride dihydrateSigma-AldrichC8106
Dextrose monohydrateSigma-Aldrich49159
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma-AldrichP4417
Protection WaxDentaurum124-305-00
HEPESSigma-AldrichH3375
dimethylformamideSigma-AldrichD4551
95% EthanolSigma-Aldrich493511
Glass capillaryWPI1B100F-3
23 G NanoFil needleWPINF33BV-2
Very fine forscepsDumont0208-55-PO
Electrode pullerSRI2001
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.01
EicosaneSigma-Aldrich219274
manual micromanipulatorBrinkmann InstrumentenbauMM-33
electronic micromanipulatorLuigs & Neumann Feinmechanik + ElektortechnikJunior unit XYZ
stereomicroscopeLeicaM80
soldering ironWellerWESD51
Dextran, Alexa Fluor 546, 10,000 MWThermoFisher ScientificD-22911
Dextran, Alexa Fluor 568, 10,000 MWThermoFisher ScientificD-22912
small Petri dishSigma-AldrichP5481
mineral oilSigma-AldrichM5904
50 ml Centrifuge tubeThermoFisher Scientific339652
forcepsAustralian Entomological Supplies
Blade holder and breakerAustralian Entomological SuppliesE130
Feather double edged razor bladeThermoFisher Scientific50-949-135
Nichrome wireElke leverancier is voldoende
Electrical wiresElke leverancier is voldoende
Model paintTamiya USAAfhankelijk van de kleur
Repeating dispenserHamilton companyPB-600-1
Glass syringeWPINANOFIL
flourescence viewing systemNightseaSFR-GR
graticuleProSciTechS8014-24
microcapillary with holderDrummond1-000-0010
Liquid siliconeElke leverancier is voldoende
ThermocoupleDigitechQM-1324
MicropipetteEppendorf

Referenties

  1. Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
  2. Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
  3. Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
  4. Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
  5. Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
  6. Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
  7. Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920(2013).
  8. Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
  9. Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
  10. Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662(2014).
  11. Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
  12. Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
  13. Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
  14. Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
  15. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
  16. Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282(2011).
  17. Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
  18. Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
  19. Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
  20. Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
  21. Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
  22. Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
  23. Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
  24. Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
  25. McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
  26. Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
  27. Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
  28. Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248(2016).
  29. Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
  30. Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
  31. Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
  32. Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288(2007).
  33. Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  34. Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989(2015).
  35. Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
  36. Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661(2013).
  37. Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529(2014).
  38. Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
  39. Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
  40. Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Farmacologie van de honingbijmethoden voor geneursdieningthoracale injectieocellusinjectieinjectie in het ocellaire trajectvolatilisatietechniekpreparatie van microscalpelsdental wax-harnasconfocale microscopieneuroethologische methoden
Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.